CN114540208B - 一株高效解磷的犁头霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效解磷的犁头霉及其应用。本发明自死亡天牛中筛选到具有高效解磷作用的犁头霉(Absidia sp.)2‑5，其保藏编号为CGMCC NO.23216。该菌株处理含磷酸三钙的培养液后，其溶磷量高达2162.7mg/L；盆栽实验发现，经该菌株发酵液处理以磷酸三钙为唯一磷源的绿豆幼苗，其株高和根长较对照分别提高1.66倍和2倍，表现出高效的解磷特性。犁头霉2‑5还通过增强土壤中脲酶和酸性磷酸酶的活性，进而改善土壤品质。

Description

一株高效解磷的犁头霉及其应用

技术领域

本发明涉及一株高效解磷的犁头霉及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

目前，全世界13.19亿hm²耕地中有43％缺磷；据报道，至少有70％的磷肥进入土壤后被土壤固定，成为难以被作物吸收利用的固定形态。耕地土壤中磷素含量普遍不高，再加上土壤中对磷素的固定作用，导致磷肥利用效率较低，严重制约着高效农业、绿色农业的发展。

解磷菌是一类具有溶磷能力的微生物的总称，可将土壤中难溶性的磷化物转变成可被植物直接吸收利用的可溶性磷化物，在土壤磷资源循环利用过程中起重要作用，因而被广泛应用于微生物肥料的加工与生产，成为目前的研究热点。但目前已经筛选出且被证明具有解磷作用的真菌种类比较少，实际应用于生产的种类更少；在生产上应用比较多的具有解磷作用的真菌仅仅是菌根菌类。对解磷真菌的报道多集中于曲霉属和青霉属，如CN202111352520.5 公开了具有解磷作用得黑曲霉(Aspergillus niger)H1，CN201711354460.4公开了具有高效解磷、解钾、高效降解纤维素的能力的黑曲霉(Aspergillus niger)CS-1，CN201911377062.3公开了一种溶磷青霉(Penicilliumcitrinum)PSF，CN201710197028.2公开了解磷青霉菌(Penicillium citrinum)QM-6和QM-10等，经检索未见有犁头霉属菌株具有解磷特性的报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株高效解磷的犁头霉及其应用，该菌株为犁头霉(Absidia sp.)2-5，具有高效解磷、增强土壤酶活、改善土壤特点。该菌株的发现有效填补了犁头霉属具有解磷特性的空缺，丰富了解磷真菌菌株资源库；以该菌为功能菌株可开发为微生物菌肥，对提高磷肥利用率、改善土壤，促进农业可持续发展具有重大意义。

本发明自死亡天牛中筛选到具有高效解磷作用的犁头霉(Absidia sp.)2-5，该菌株已于 2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为中国北京，保藏编号为 CGMCC NO.23216。该菌株整个生长周期菌落呈绒毛状，气生菌丝发达，菌丝呈白色长毛状；具有典型的霉菌菌落特征。该菌株还通过增强土壤中脲酶和酸性磷酸酶的活性，进而具有改善土壤品质的特性。

本发明还提供了犁头霉(Absidia sp.)2-5的发酵方法，其特征是，犁头霉2-5菌株在发酵培养基中26～28℃下发酵培养36-40h，得到发酵液。发酵培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖或蔗糖10～20g/L，蛋白胨10g/L，水1000mL，pH自然。

本发明还提供了上述犁头霉(Absidia sp.)2-5以及发酵液在高效解磷方面的应用。

本发明还提供了上述犁头霉(Absidia sp.)2-5以及发酵液在增强土壤酶活(脲酶和酸性磷酸酶)，改善土壤品质中的应用。

本发明还提供了一种提高土壤可溶性磷含量的方法，其特征是，将犁头霉2-5发酵液施于土壤中。

本发明的技术效果是：

1、高效解磷

经该菌株处理含磷酸三钙的培养液后，其溶磷量高达2162.7mg/L；盆栽实验发现，经该菌株发酵液处理以磷酸三钙为唯一磷源的绿豆幼苗，其株高和根长较对照分别提高1.66倍和 2倍，表现出高效的解磷特性。

2、增强土壤酶活，改善土壤品质

犁头霉2-5可以有效提高土壤中脲酶的活性，进而促进土壤的氮素代谢；也可显著增强酸性磷酸酶活性，从而促进土壤磷素水平的改善。

3、犁头霉2-5菌株的发现有效填补了犁头霉属具有解磷特性的空缺，丰富了解磷真菌菌株资源库，且易于发酵生产，可开发为微生物菌肥，对提高磷肥利用率、改善土壤，促进农业可持续发展具有重大意义。

附图说明：

图1为犁头霉2-5的菌落形态；

图2为犁头霉2-5水解磷酸三钙产生的水解圈；

图3为磷标准曲线；

图4为犁头霉2-5处理7d后发酵液中可溶性磷含量；

图5为犁头霉2-5发酵液处理含磷酸三钙缺磷营养土绿豆长势；

图6为犁头霉2-5发酵液处理含磷酸三钙缺磷营养土绿豆根长势；

图7为犁头霉2-5对土壤脲酶活性影响；

图8为犁头霉2-5对土壤酸性磷酸酶活性影响。

具体实施方式

实施例1：菌株的分离与鉴定

1.菌株2-5分离

本发明的犁头霉菌株2-5是从山东省烟台长岛马尾松林场采集的死亡的天牛中利用稀释平板法分离获得的。具体方法如下：

1.1分离菌样制备

将采集的死亡天牛用蒸馏水清洗干净，并用含75％酒精棉球表面消毒3～5次；在无菌条件下用剪刀将其剪碎放入装有10mL无菌水和少许灭过菌的石英砂的无菌研钵内，利用研磨棒充分研磨成匀浆，用移液枪吸取5mL于无菌试管中，即为菌样。

1.2稀释涂布

利用10倍稀释法将菌样依次稀释成10^-1～10^-6稀释度的菌样；分别从10^-4、10^-5和10^-6稀释度的菌样中吸取100μL涂布于含有孟加拉红琼脂培养基平板上，每个梯度涂布三个平行。

孟加拉红琼脂培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，无水硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，琼脂20g，水1000mL。上述各成分(孟加拉红和氯霉素除外) 加入蒸馏水中溶解后，再将孟加拉红溶液加入培养基中，分装后，121℃灭菌25min。倾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基。

1.3培养纯化

在27℃培养36～40h后挑取培养基上的不同形态的真菌菌落于PDA培养基平板上，定时观察菌落生长情况；利用菌丝尖端分离法不断纯化菌株，确认单菌落后编号保存。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然。分装， 121℃灭菌25min。

通过上述方法，共计分离到6株真菌，分别编号为2-1～2-6。

2.菌株2-5筛选

利用水解圈法对分离得到的6株真菌的解磷功能进行初步研究，进而筛选得到具有解磷功能的菌株。具体方法如下：

2.1筛选培养基制备

筛选培养基(磷酸三钙无机磷固体培养基)，配方：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5.0g，琼脂15.0g，去离子水1000mL，pH值7.0-7.5。

按照上述配方，称取各物质加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

2.2菌株活化

将分离得到的6株待测菌株接种于含PDA培养基的平板上，27℃恒温培养36h。

2.3接种观察

用打孔器打取上述活化菌株的菌饼(5mm)，接种于含有筛选培养基的平板中央，27℃恒温培养3d，每一处理三个平行，观察各处理有无溶磷圈，确定菌株解磷功能。

结果显示，在分离得到的6株真菌中，菌株2-5有溶磷圈，说明菌株2-5具有解无机磷能力(表1)；

表1不同真菌解磷情况汇总表

备注：有水解圈为“+”级，无水解圈为“－”级。

3菌株2-5形态学及分子生物学鉴定

3.1形态学鉴定

将菌株2-5接种在PDA平板上，27℃恒温进行培养，分别在24h、48h观察菌落特征。结果发现，该菌株在PDA平板上菌丝平均生长速度为16.4mm/d；整个生长周期菌落呈绒毛状，气生菌丝发达，菌丝呈白色长毛状；具有典型的霉菌菌落特征。

3.2分子生物学鉴定

将菌株2-5活化后，挑取菌盘接种到含玻璃纸的PDA培养基中，27℃恒温培养48h，收集上层菌丝体，用滤纸压干后，液氮研磨成粉末，用CTAB法提取真菌基因组DNA，将提取基因组送至测序公司进行测序。所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS1区)如下(SEQNo.1)：

CTTATGTTCAGCGGGTAATCCCGCCTGATTTCAGATCAAGTTTTTTGAATGAAGGGG AGGCTTTTCTAGCTGACTAGGTTTTTTTTGAAAGATGAATCTACCAAAAGGTAACTAGCC GGTTAAAAAGAAACCAGATCATATTTAAGCCGTGAAGGCGGGAAGACGAATCCTCCCTT TCCTCAAGGGCCAGTAGTAATTTTTCCACCCAAATAGTATGGGAAGAAGTTATAATGATA CTGAAACAGGCGTACCTCCAGGAATACCCAGAGGTGCAAGATGCGTTCAAAGATTTGAT GATTCACTATAGGCAGATCACACTACATATCGCGATTTGCTGCGTTCTTCATCGATACGAA AGCCGAGAGATCCATTGCTGAAAGTTGTTTATATGTTAACAATTTCTGTTATGGTTCAGTC ATAATAGTATAATAATTGATCTGGGCGGCCGAACAATCTCCCAAAGGAAAAAGCGAACC AACCCAGGGCGGGGTTTCCCCCAAATTAAACGGTGCACAGAATAAAAAGTTGAGACTC CCGAGAGAGCCCAGCATTTTTAATGATCCTTCCGC。

菌株2-5经形态学及分子生物学鉴定为犁头霉(Absidia sp.)，该菌株已于2021年8月20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.23216。

实施例2：犁头霉2-5高效解磷能力测定

1.犁头霉2-5高效解磷能力定性测定

(1)检测方法：

将犁头霉2-5接种于含PDA培养基的平板上，27℃恒温培养36h，活化菌株；用打孔器在活化好的犁头霉2-5边缘处打菌饼(5mm)，接种于磷酸三钙无机磷固体培养平板中央，27℃恒温培养24h，观察溶磷圈，测量菌落直径和产生的透明圈直径，每一处理三个平行。测得的菌落直径和透明圈直径取平均值，计算可溶性指数。

可溶性指数＝透明圈直径/菌落直径

(2)结果分析：

将犁头霉2-5接种磷酸三钙无机磷固体培养培养24h，出现明显的水解圈(图2)，其可溶性指数为1.67。结果初步说明，犁头霉2-5是一株高效解磷真菌。

2.犁头霉2-5高效解磷能力定量测定

(1)检测方法

利用钼锑抗比色法测定了犁头霉2-5解磷能力，具体方法：

①前处理：挑取保存的犁头霉2-5菌苔接种于PDB培养基中，27℃、120r/min恒温培养 36～40h作为种子液；种子液按2％接种量接种于250mL含100mL磷酸三钙无机磷液体培养基三角瓶中得到发酵液，以接种2％的无菌PDB培养基到磷酸三钙无机磷液体培养基作为空白对照，于27℃、120r/min恒温摇床中振荡培养7d。

PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，水1000mL，pH自然。

磷酸三钙无机磷液体培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5.0g，去离子水1000mL， pH值7.0-7.5。

②制作磷标准曲线：将磷标液稀释至5mg/L，分别吸取稀释好的磷标液0、2、4、6、8、10mL至50mL容量瓶中，加蒸馏水将总体积定容至30mL，加入2滴2,6-二硝基酚指示剂，逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至容量瓶中液体呈现微黄色，再逐滴加入1mol/L的H₂SO₄至黄色刚刚消去，接着加入5mL钼锑抗试剂，并用蒸馅水定容至刻度。在25℃条件下，显色30min，然后与上述样品的显色液同在721型紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。以磷浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制磷标准曲线(图3)。

③发酵液磷含量测定：摇匀发酵液，取20mL到离心管中，于8000r/min条件下离心10～15 min；吸取2.5～10mL上清液到50mL的容量瓶中，加入蒸馏水将体积定容到30mL，加入2 滴2,6-二硝基酚指示剂，再加入1滴1mol/L的H₂SO₄至溶液黄色刚好退去，接着加入5mL的钼锑抗试剂，定容至刻度，在25℃条件下显色30min，然后在721型紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。根据标准曲线计算出对应的可溶性磷含量。

(2)结果分析

通过上述方法，对不接菌的空白对照溶液和接有犁头霉2-5的发酵液可溶性磷含量进行了检测。结果发现，不接菌的空白对照溶液中的可溶性磷浓度为65.5mg/L，犁头霉2-5的发酵液中可溶性磷含量为2162.7mg/L(图4)。这说明犁头霉2-5是一株高效解磷真菌。

实施例3：犁头霉2-5发酵液制备

(1)将犁头霉2-5活化接种于PDA平板表面，27℃恒温培养48h；

(2)打孔器在活化菌株边缘处打菌饼，接种于种子液培养基(PDB培养基)中，27℃、120r/min摇瓶培养36-40h，得到犁头霉2-5的种子液；

(3)将步骤(2)制备的种子液接种到发酵培养基中，接种质量比为1:50，发酵条件同步骤(2)，得到犁头霉2-5的发酵液。菌落数为1×10⁹CFU·mL^-1。

发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)15g，蛋白胨10g，水1000mL，pH自然。

实施例4：高效解磷真菌犁头霉2-5盆栽实验

(1)实验方法

选取大小、饱满程度一致的绿豆种子进行盆栽实验。对照组为缺磷营养土，每盆750g；实验组为缺磷营养土+磷酸三钙，每盆700g缺磷营养土、50g磷酸三钙，搅拌均匀。对照组浇水200mL，实验组浇犁头霉2-5发酵液100mL。每一处理每盆点种20颗，每一处理三个平行。处理完成后，置于25℃，14h/10h光周期，光强120-200μmol/m²·s^-1下培养。每天喷水一次，保持湿润。培养7d，观察各处理绿豆幼苗长势情况，对株高、根长等相关指标进行检测。

(2)结果分析

培养7d后，观察了两处理组绿豆的生长情况，并对其株高和根长进行了测量。结果发现，经犁头霉2-5发酵液处理含磷酸三钙的缺磷营养土之后，绿豆长势显著好于对照缺磷培养(图5、6)；其株高为19.33cm，根长为8.67cm，较对照组分别提高1.66倍和2倍(表2)。结果说明，在土壤中，犁头霉2-5能够高效降解磷酸三钙为可溶性磷，为植株生长提供所需磷元素，进而促进植物生长，表现出高效的解磷特性。

表2不同处理绿豆株高与根长统计

实施例5：高效解磷真菌犁头霉2-5对土壤酶活的影响

(1)实验方法

将实施例3制备的犁头霉2-5发酵液100mL接种到装有750g土的盆里，对照组不做处理，置于25℃温室中培养，每周浇水一次，每隔10d进行土壤脲酶、酸性磷酸酶含量测定。脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定。

(2)结果分析

通过对接种犁头霉2-5不同天数土壤中脲酶和酸性磷酸酶活性进行检测发现，接种犁头霉2-5对土壤酶活具有较大影响。与对照组相比，接种犁头霉2-5可以有效提高土壤中脲酶的活性(图7)；也可显著增强酸性磷酸酶活性(图8)，从而促进土壤磷素水平的改善。

以上结果说明，犁头霉2-5能够促进土壤的氮素代谢以及磷的转化和释放，进而可以促进植物生长和改善土壤品质，同时其具有的高效解磷特性对增强作物对肥料的吸收率有很大的积极影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省林业科学研究院

<120> 一株高效解磷的犁头霉及其应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 569

<212> DNA

<213> 犁头霉（Absidia sp.）2-5的的rDNA基因序列测定结果（ITS1区）

<400> 1

cttatgttca gcgggtaatc ccgcctgatt tcagatcaag ttttttgaat gaaggggagg 60

cttttctagc tgactaggtt ttttttgaaa gatgaatcta ccaaaaggta actagccggt 120

taaaaagaaa ccagatcata tttaagccgt gaaggcggga agacgaatcc tccctttcct 180

caagggccag tagtaatttt tccacccaaa tagtatggga agaagttata atgatactga 240

aacaggcgta cctccaggaa tacccagagg tgcaagatgc gttcaaagat ttgatgattc 300

actataggca gatcacacta catatcgcga tttgctgcgt tcttcatcga tacgaaagcc 360

gagagatcca ttgctgaaag ttgtttatat gttaacaatt tctgttatgg ttcagtcata 420

atagtataat aattgatctg ggcggccgaa caatctccca aaggaaaaag cgaaccaacc 480

cagggcgggg tttcccccaa attaaacggt gcacagaata aaaagttgag actcccgaga 540

gagcccagca tttttaatga tccttccgc 569

Claims (9)

1.一株高效解磷的犁头霉菌株，其特征是，该菌株为犁头霉（Absidia sp.）2-5，其保藏编号为CGMCC NO.23216。

2.一种微生物发酵液，其特征是，以权利要求1所述的犁头霉（Absidia sp.）2-5为主要有效成分。

3.权利要求2所述的微生物发酵液的制备方法，其特征是，犁头霉（Absidia sp.）2-5菌株在发酵培养基中26~28℃下发酵培养36-40 h，得到犁头霉2-5发酵液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，其发酵培养基为：马铃薯200 g/L，葡萄糖或蔗糖10~20 g/L，蛋白胨10 g/L。

5.权利要求1所述的犁头霉（Absidia sp.）2-5或权利要求2所述的微生物发酵液在高效解磷方面的应用。

6.权利要求1所述的犁头霉（Absidia sp.）2-5或权利要求2所述的微生物发酵液在增强土壤酶活中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述增强土壤酶活为增强脲酶和酸性磷酸酶酶活。

8.权利要求1所述的犁头霉（Absidia sp.）2-5或权利要求2所述的微生物发酵液在改善土壤品质中的应用。

9.一种提高土壤可溶性磷含量的方法，其特征是，将权利要求2所述的微生物发酵液施于土壤中。

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