CN113151008B - 利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内生真菌P.Indica菌液的制备方法，包括菌种活化、菌丝体制备、菌液获取，从而获得内生真菌P.Indica菌液。本发明还同时公开了利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法，利用内生真菌P.Indica菌液，选用以下任一方法：水培侵染法、土培灌根法、蘸根水培法。本发明能提高西瓜培育过程中耐低磷、低氮的能力；提高养分胁迫下的西瓜养分利用率；提高西瓜田间产量。

Description

利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法

技术领域

本发明属于蔬菜栽培技术领域，具体涉及一种适用于西瓜设施栽培的提质增效施肥方法。

背景技术

西瓜是我国重要的园艺(蔬菜)作物，2013年我国西瓜种植面积为183万公顷，占世界西瓜总种植面积的53％，总产量为7319万吨，占世界西瓜总产量的67％。氮、磷、钾作为最重要的大量元素，是西瓜养分需求研究的重点。西瓜生长前期，要保证充足的氮肥，适当的磷、钾肥，在生长后期，确保大量的氮肥和钾肥，有利于提高西瓜的产量和品质。西瓜全生育期需要大量化肥使用，但其化肥利用效率较低，盲目施肥易导致资源浪费和土壤盐碱化。通过按需施肥、测土配方施肥等栽培技术创新是解决这一问题的有效途径。其中，生物菌肥是其中一种提高养分利用效率、改善土壤肥力、提高植株抗性的重要技术手段。

P.indica是一种担子菌纲、腊壳耳目的可以人工培养、类似AM的新型内生真菌，该新型内生真菌的菌丝可以定殖于植物根系表面、根系表皮细胞和细胞间隙，形成梨形厚垣孢子，能在作物根系定殖存活很长时间。新型内生真菌的寄主范围广泛，如拟南芥、烟草、大麦、小麦、玉米等，甚至能够在AM真菌不能定殖的十字花科作物上定殖。前期研究表明，新型内生真菌具有以下作用：可以通过促进植物对营养元素的吸收来促进多种植物生长，提高大麦、小麦等粮食作物产量；提高大麦、拟南芥等植物的抗旱、抗盐能力，并通过调节植物抗病反应减轻根部和叶部病害发生。目前为止，该真菌在蔬菜作物中的功能及其使用方法尚未有报道。

发明内容

本发明解决的问题是西瓜化肥利用率偏低以及化肥浪费问题，提供一种基于内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种内生真菌P.Indica菌液的制备方法，依次进行以下步骤：

①、菌种活化

将P.indica(4℃保存的P.indica)接种到PDA固体培养基中，在黑暗、26±1℃条件下活化，直至获得直径6～7cm的菌落；

说明：

4℃保存的P.indica存储半年左右仍具备侵染活性；

上述活化生长时间约为2周左右；

②、菌丝体制备、菌液获取

利用0.5cm打孔器对步骤①所得的带菌PDA固体培养基取样(即培养基连带菌丝取样)，从而形成一个0.5cm菌片，在250ml的PDB液体培养基中加入1-10片的菌片；于避光、26±1℃、150±30r/min转速的条件下培养(悬浮培养)5-7天；

培养结束后，震荡，从而使得培养所形成的菌丝体破碎，过滤，所得滤液为内生真菌P.Indica菌液。

说明：1片菌片对应所得的菌液定义为浓度1单位的菌液，其余以此类推。

菌片在PDB液体培养基中将快速扩繁，培养(悬浮培养)5-7天后，得到球形菌丝体(直径超过1.5cm球形菌丝体)；

过滤为用2层纱布过滤。

本发明还同时提供了一种利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法：利用内生真菌P.Indica菌液，选用以下任一方法：

水培侵染法、土培灌根法、蘸根水培法。

作为本发明的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法的改进，水培侵染法(利用Hongland营养液水培法培养西瓜幼苗)为：

在1L Hongland营养液中加入孢子当量为8～120(优选8当量)的内生真菌P.Indica菌液，作为侵染液；

将两叶一心的西瓜幼苗放入至所述侵染液中进行培养；培养一周后，以1LHongland营养液替代侵染液，而后，每周更换一次Hongland营养液(用量为1L)；

培养条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^-2s^-1，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃。

说明：在1L Hongland营养液中加入孢子当量分别为8，40，120的内生真菌P.Indica菌液，即，为在1L Hongland营养液中分别加入1ml，5ml，15ml的浓度8单位的内生真菌P.Indica菌液。

种苗密度为5西瓜幼苗株/L Hongland营养液。

作为本发明的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法的改进，所述土培灌根法为：

将内生真菌P.Indica菌液进行稀释，将当量(孢子当量)为2.5～40的菌液稀释液向一叶一心或两叶一心的基质培养的西瓜幼苗进行灌根处理；

灌根处理后的培养(基质培养)条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^{- 2}s^-1，温度为27～30℃；8小时黑暗环境，温度为20～24℃。

说明：当量为2.5的菌液稀释液的灌根处理，为，每株幼苗的根部浇2.5ml浓度1单位菌液用水稀释到总体积10ml所得的稀释液，其余以此类推。

作为本发明的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法的改进，蘸根水培法为：

用浓度5～8单位的内生真菌P.Indica菌液对一叶一心或两叶一心的西瓜苗(土培或水培所得)进行蘸根处理，处理时间分别为15～25min；

将蘸根处理所得的西瓜苗放入Hongland营养液中培养，培养条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^-2s^-1，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃。

作为本发明的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法的进一步改进，培养时间为15～30天。

本发明中：

在内生真菌P.Indica菌液的制备过程中考虑到了以下内容：PDA固体培养基制备的P.indica虽然可以用于侵染，但是效率低、操作困难。因此，本发明提供了利用液体培养大量制备菌丝体的方法，利用0.5cm打孔器将PDA固体培养连带菌丝取样(每次形成一个0.5cm菌片)，然后放入250ml的PDB液体培养基中，每份PDB培养基中可以加样1-10片菌片。根据每瓶培养基加样数量不同形成最终菌液浓度，即5菌片/瓶得到菌液浓度为5单位。

利用Hongland营养液水培法培养西瓜幼苗，培养15天后即可取根样检测P.indica定殖率，培养30天后可观测到西瓜植株生长指标差异。该侵染方法的优点是可多植株同时侵染且效果较均匀；检查侵染定殖效果较为方便。适用于植物工厂或无土栽培的西瓜栽培模式。

上述土培灌根法，西瓜苗用基质培养，当植株长到一叶一心或两叶一心的时，向植株根部浇灌一定当量的菌液，共培养15天后取根样检测定殖情况，培养30天后测定植株生长指标。该侵染方法的优点是操作简便，适用于绝大多数西瓜栽培模式的育苗期侵染。缺点是由于菌液土壤中扩散速度不均会出现前期侵染不整齐，但后期植株生长差异将逐渐消失。

上述蘸根水培法为：土培或水培的西瓜苗长到两叶一心时，将幼苗取出后蘸根处理，而后进行共培养；共培养15天后取根样检测定殖情况，培养30天后测定植株生长指标。该侵染方法的优点是操作简便，定殖率最高。缺点是由于根系直接接触未稀释菌液，浓度过高或时间过久会产生前期植株因过度侵染导致生长抑制。适用于技术掌握较熟练的大规模使用。

综上，本发明提供了一套适用于西瓜栽培种使用的内生真菌P.Indica菌液制备及使用的技术体系(图1)。

本发明具有如下技术优势：提高西瓜培育过程中耐低磷、低氮的能力；提高养分胁迫下的西瓜养分利用率；提高西瓜田间产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为适用于西瓜栽培种使用的内生真菌P.Indica菌液制备及使用的技术体系；

图2为打孔取样的P.indica菌片；

图3为PDB液体培养基悬浮培养7天后的P.indica菌丝体；

图4为P.indica菌液侵染后15天在西瓜根系观察到内生真菌定殖；

上图从左至右依次为未被侵染根段、侵染早期根段、侵染中后期根段；

下图从左至右依次为侵染了2个孢子体的根段、侵染了3个孢子体的根段、侵染了4个孢子体的根段；

图5为二叶期西瓜幼苗水培法侵染P.indica菌液效果；

图6为一叶期西瓜幼苗土培灌根法侵染P.indica菌液效果；

图7为二叶期西瓜幼苗土培灌根法侵染P.indica菌液效果；

图8为一叶期西瓜幼苗蘸根水培法侵染P.indica菌液效果；

图9为二叶期西瓜幼苗蘸根水培法侵染P.indica菌液效果；

图10为一叶期西瓜幼苗蘸根土培法侵染P.indica菌液效果；

图11为被P.indica定殖和未被定殖的植株统一营养条件下7天后长势差异；

图12为低磷/低氮胁迫下，新型内生真菌共生对氮/磷元素积累量，以及植株磷/磷利用效率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

印度梨形孢(P.indica)选用中国普通微生物菌种保藏管理中心的cgmcc3.17686菌株。

Hoagland营养液配方：

硝酸钙10μM

硝酸钾12.5μM

磷酸二氢钾2.5μM

硫酸镁7μM

硼酸50nM

硫酸锰10nM

硫酸锌0.76nM

硫酸铜0.32nM

钼酸铵0.016nM

铁盐77nM

pH＝6.0。

说明：上述铁盐同常规Hoagland营养液。

缺磷Hongland营养液，即将上述配方中的磷酸二氢钾降低到0.05μM；并补充1.3μM硫酸二钾；从而达到磷肥降低到原配方1/50，但不影响钾肥的效果。

缺氮Hongland营养液，即将上述配方中的硝酸钙降低到1μM，硝酸钾降低到1.25μM；并补充9μM氯化钙和11.25μM氯化钾；从而达到氮肥降低到原配方1/10，但不影响钾肥和钙肥的效果。

实施例1：

1.不同侵染方法的效果：

于4℃中保存的P.indica，将其接种到新的PDA固体培养基中活化(在黑暗、26℃条件下活化)，待菌落直径长至6～7cm时(活化生长时间约为2周左右)，将活化的印度梨形孢P.indica打孔取样(图2)后接种到250mL的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB液体培养基)中。

接种方式具体如下：利用0.5cm打孔器将PDA固体培养连带菌丝取样(每次形成一个0.5cm菌片)，然后放入至250ml的PDB液体培养基中，每份PDB培养基(250ml的PDB液体培养基)中可以加样1-10片菌片。根据每瓶培养基加样数量不同形成最终菌液浓度，以5菌片/瓶为例，最终得到菌液浓度定义为5单位。其余以此类推。

菌种在避光26℃条件下，以转速为150r/min悬浮培养，培养时间为6天，此时菌片生长为直径约1.5cm的球形菌丝体(图3)，结束培养。将菌丝体震荡后用2层纱布过滤，所得滤液为内生真菌P.Indica菌液。

以内生真菌P.Indica菌液(以下简称菌液)分别进行如下3种方法的实验：

1.1.水培侵染法效果

供试西瓜品种为“早佳8424”，采用水培法培养，西瓜幼苗长到两叶一心时用侵染液处理，共设3个处理，具体如下：在1L Hongland营养液中加入孢子当量为8，40，120的内生真菌P.Indica菌液(分别加入1ml，5ml，15ml的浓度为8单位的菌液)作为侵染液；以不加内生真菌P.Indica菌液的处理为对照W 2-0，每个处理5株幼苗。

种苗密度为5株/L Hongland营养液。

培养条件为：16小时光照环境，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；光照强度为600μmol m^-2s^-1，空气湿度约为70-80％。

每周更换一次营养液(仅仅为Hongland营养液，不添加内生真菌P.Indica菌液)。

培养15天后取根样检测P.indica定殖率，定殖率＝有真菌侵染定根定数量/总监测的根数；如图5所述；P.indica菌液侵染后15天在西瓜根系观察到内生真菌定殖效果如图4所示。

培养30天后测定西瓜植株生长指标。结果(图5)显示菌液当量与定殖率正相关，但是不同处理组对西瓜幼苗根段儿的定殖率差异不显著。此外三个处理组对西瓜茎粗、茎长的影响并不显著，但是当量8与当量40处理组西瓜茎粗要大于对照(+5.17％，+4.56％)，且显著大于处理组当量120(-19.76％)的西瓜茎粗；当量8处理组西瓜植株茎长最长(+25.30％)，当量120处理茎长小于对照(-22.32％)。表明当培养液菌液量达到一定范围内时，可以促进西瓜茎粗，茎长的增长，而超出某一范围，则会抑制植株茎粗，茎长的生长。综上所述，该侵染法下以当量8处理效果最佳。

1.2.土培灌根法效果

“早佳8424”西瓜苗用基质(常规基质)培养，穴盘培养(每盘32株)，分别在植株一叶一心和二叶一心期开展灌根处理(每个处理组均为仅灌根一次)。各处理菌液当量分别为2.5，4，12.5，20，25，40(即，每株幼苗分别浇2.5ml浓度1单位菌液的稀释液，4ml浓度1单位菌液的稀释液，2.5ml浓度5单位菌液的稀释液，4ml浓度5单位菌液的稀释液，2.5ml浓度10单位菌液的稀释液，4ml浓度10单位菌液的稀释液，上述菌液均分别用水稀释到总体积10ml)，以不浇灌滤液的处理为对照(即，对照为灌根10ml水)。

每个处理组8株西瓜幼苗。共培养15天后取根样检测侵染情况(如图6)，培养30天后测定植株生长指标。

培养条件为：16小时光照环境，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；光照强度为600μmol m^-2s^-1，空气湿度约为70-80％。

结果表明：

在西瓜幼苗一叶一心期开展侵染，植株侵染率为20-60％；各处理组西瓜茎粗，叶片个数，地上干重差异不显著；茎长，地上鲜重先上升再下降，菌液当量为12.5时达到峰值。综上，一叶一心土培灌根法侵染时，以菌液当量约为12.5时效果最优(图6)。

在西瓜幼苗二叶一心期开展侵染，植株侵染率为40-80％；西瓜苗茎粗和干重均在菌液当量4-20范围内较优，当量为12.5时达到峰值；地上鲜重呈现先上升后下降的趋势，当量20最优；茎长和叶片数随当量增加而下降，但菌液当量在2.5-25范围内均显著大于对照，表明在两叶一心期开展灌根侵染，菌液当量在4-20范围内较优(图7)。

说明：侵染率＝在根系发现真菌定殖的株数/总侵染株数。

1.3.蘸根水培法效果

待“早佳8424”西瓜苗长催芽后，分别于一叶一心和二叶一心期，用浓度为5或8的菌液进行蘸根处理，处理时间分别为0min，15min，20min，25min，即处理组D0min,D15min，D20min，D 25min。处理结束后将幼苗放入Hongland营养液中共培养并生长。

培养条件为：16小时光照环境，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；光照强度为600μmol m^-2s^-1，空气湿度约为70-80％。

每周更换一次营养液(仅仅为Hongland营养液)。

共培养15天时对植物根系进行检测，再培养30天后测定西瓜的生长指标。

蘸根水培法侵染率均为100％。当一叶期幼苗用浓度为5菌液处理时，随着侵染时间的增加，根段侵染率逐渐降低，从71.11％到36.52％，随着处理时间的增加，植株茎粗先增加后降低，但同对照无显著差异；当浓度为8片时根段侵染率呈相同趋势，从55.66％降低到44.55％，植株茎粗随着侵染时间的增加而增加，25min时，茎粗显著高于对照(+18.98％)(图8)。综合来看，一叶一心期开展水培蘸根处理，以浓度为5的菌液侵染25min最优。

当二叶期幼苗用浓度为5菌液处理时，不同侵染时间对西瓜根段侵染率略有差异，侵染率在46.98％-60.94％之间，但当浓度为8时，侵染25min(72.29％)时侵染率显著高于侵染20min(40.28％)，侵染15min时侵染率为60.83％。当浓度为5时，侵染25min可显著降低植株茎粗(-12.77％)，其他5个处理组茎粗同对照没有显著差异(图9)。综合来看，二叶一心期开展水培蘸根处理，以浓度为8的菌液侵染15min最优。

1.4.蘸根土培法效果

本发明还尝试了蘸根土培法进行侵染，待“早佳8424”西瓜苗长至一叶一心期，用浓度为5或8的菌液进行蘸根处理，处理时间分别为0min，15min，20min，25min。处理结束后将幼苗种入固体基质(常规基质)中。

该方法下侵染率于侵染时间正相关，处理中植株表现明显的生长抑制(茎粗、茎长、鲜重和干重)。其原因应该是植株直接接触高浓度菌液后，根系被过度定殖后产生抑制效果(图10)。因此，本发明判断该蘸根土培法不适合田间大量使用。

2.内生真菌P.indica定殖提高西瓜养分利用效率的效果

2.1真菌定殖对西瓜幼苗生长势的影响

将“早佳8424”西瓜苗用基质(常规的Lambert LM-GPS)培养，穴盘培养(每盘32株)，植株一叶一心期以当量为12.5菌液进行灌根处理。

培养条件为：16小时光照环境，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；光照强度为600μmol m^-2s^-1，空气湿度约为70-80％。

灌根处理后的共培养15天取根样检测定殖情况；将定殖成功的幼苗和未定殖幼苗各32株，在相同营养情况下(等量基质并以Hongland营养液为养分)再培养生长1周。结果表明，新型内生真菌侵染后可以显著促进西瓜幼苗在正常养分条件下生长势(图11，表1)，具体长势表现为：植株高度(茎长)、地上部和地下部鲜重显著高于对照；地上部干重略高于对照。

表1、P.Indica定殖后正常营养生长一周后生理指标(新型内生真菌在缺氮/缺磷处理下对西瓜生长势的影响)

2.2真菌定殖对西瓜幼苗耐低磷、低氮能力的影响

采用水培法培养“早佳8424”，西瓜幼苗长到两叶一心时用当量8侵染液处理。培养条件同上。

培养15天后取根样检测P.indica定殖率，此后将定殖成功的幼苗和未定殖幼苗各30株，分别移入Hongland营养液、缺磷Hongland营养液和缺氮Hongland营养液中进行生长。在16小时光照环境，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；光照强度为600μmol m^-2s^-1，空气湿度约为70-80％的条件下生长14天后，进行检测。

结果表明：在缺氮胁迫下，新型内生真菌可以促进宿主的主茎伸长；在缺磷胁迫下，共生真菌可以提高西瓜幼苗的主茎茁壮度和叶片数量(表2)。此外，新型内生真菌共生可以显著缓解缺氮胁迫导致的叶绿素a含量和缺磷胁迫导致的叶绿素b含量的降低(表3)。在正常养分条件下，新型内生真菌共生显著提升地下部的氮、磷元素积累量，并且稍微提高植株的氮、磷利用效率；在低磷胁迫下，新型内生真菌共生显著提升全株的氮元素积累量，以及植株磷利用效率；在低氮胁迫下，新型内生真菌共生显著提升地下部的磷元素积累量，并不显著提高氮、磷利用效率(图12)。表明新型内生真菌可以一定程度提高西瓜养分利用率以及耐养分胁迫能力。

表2、新型内生真菌在缺氮/缺磷处理下对西瓜生长势的影响

表3、新型内生真菌在缺氮/缺磷处理下对西瓜叶绿素含量影响

	叶绿素a含量mg/g	叶绿素b含量mg/g	叶绿素含量mg/g
				全素无菌	0.805±0.0932b	0.294±0.0365a	1.099±0.1298b
全素加菌	1.419±0.1536a	0.538±0.0177a	1.957±0.1713a
				缺氮无菌	0.536±0.0269c	0.263±0.0575a	0.948±0.2089b
缺氮加菌	0.903±0.0380b	0.344±0.0309a	1.093±0,1324b
				缺磷无菌	0.847±0.0095b	0.320±0.0241b	1.166±0.0336b
缺磷加菌	0.954±0.0262b	0.418±0.0224a	1.373±0,0486b

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法，其特征是：利用内生真菌P.Indica菌液，选用以下任一方法：

水培侵染法、土培灌根法、蘸根水培法；

内生真菌P.Indica提高西瓜养分利用率以及耐养分胁迫能力；

内生真菌P.Indica菌液的制备方法依次进行以下步骤：

①、菌种活化

将P.indica接种到PDA固体培养基中，在黑暗、26±1℃条件下活化，直至获得直径6～7cm的菌落；

P.indica为cgmcc3.17686菌株；

②、菌丝体制备、菌液获取

利用0.5cm打孔器对步骤①所得的带菌PDA固体培养基取样，从而形成一个0.5cm菌片，在250ml的PDB液体培养基中加入1-10片的菌片；于避光、26±1℃、150±30r/min转速的条件下培养5-7天；

培养结束后，震荡，从而使得培养所形成的菌丝体破碎，过滤，所得滤液为内生真菌P.Indica菌液；

在缺氮胁迫下，内生真菌P.Indica可以促进宿主的主茎伸长；在缺磷胁迫下，共生真菌P.indica可以提高西瓜幼苗的主茎茁壮度和叶片数量，内生真菌共生可以显著缓解缺氮胁迫导致的叶绿素a含量和缺磷胁迫导致的叶绿素b含量的降低；

在低磷胁迫下，内生真菌P.Indica共生显著提升全株的氮元素积累量，以及植株磷利用效率；

在低氮胁迫下，内生真菌P.Indica共生显著提升地下部的磷元素积累量。

2.根据权利要求1所述的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法，其特征是；

所述水培侵染法为：

在1L Hongland营养液中加入孢子当量为8的内生真菌P.Indica菌液，作为侵染液；

将两叶一心的西瓜幼苗放入至所述侵染液中进行培养；培养一周后，以1L Hongland营养液替代侵染液，而后，每周更换一次Hongland营养液；

培养条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^-2s^-1，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃；

所述土培灌根法为：

将内生真菌P.Indica菌液进行稀释，将当量为12.5的菌液稀释液向一叶一心或将当量为4～20的菌液稀释液向两叶一心的基质培养的西瓜幼苗进行灌根处理；

灌根处理后的培养条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^-2s^-1，温度为27～30℃；8小时黑暗环境，温度为20～24℃；

所述蘸根水培法为：

用浓度5单位的内生真菌P.Indica菌液对一叶一心或用浓度8单位的内生真菌P.Indica菌液对两叶一心的西瓜苗进行蘸根处理，处理时间分别为15～25min；

将蘸根处理所得的西瓜苗放入Hongland营养液中培养，培养条件为：16小时光照环境，光照强度为600μmol m^-2s^-1，温度为27～30℃，8小时黑暗环境，温度为20～24℃。

3.根据权利要求2所述的利用内生真菌提高西瓜养分利用效率的方法，其特征是：

培养时间为15～30天。