CN115088733A - 一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物生产栽培技术领域，公开了一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，选用生长健壮的百香果幼苗作为被接种植株，配制PDA液体培养基，将固体印度梨形孢菌丝块接入PDA液体培养基中，放于摇床振荡培养。将获得的菌液注射至百香果植株幼苗根部附近，注射两次，即获得植入根部内生真菌印度梨形孢的百香果植株幼苗。本发明增强了百香果秋冬季低温产区植株的抗寒性，提高经济产量，对百香果产业可持续发展具有重要的经济、社会和生态效益。

Description

一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法
技术领域
本发明属于植物生产栽培技术领域，尤其涉及一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法。
背景技术
百香果为西番莲科西番莲属的草质藤本植物，在我国的福建、广西、台湾、云南等地广泛种植。百香果已成为我国部分地区的重要经济产业。印度梨形孢是印度科学家Verma于1998年在印度西北部塔尔沙漠中发现的根部内生真菌，是一种理想的内生真菌，其宿主范围广泛，对宿主植物具有促生和抗逆作用。
百香果是温度敏感型植物，温度过高或偏低均易造成生理障碍。百香果栽培过程中，秋冬季低温导致果实不能完熟，且易遭低温寒害或冻害的影响，幼苗生长受到抑制，叶片萎蔫，植物生长缓慢，甚至生长停止，给众多果农造成较大的经济损失。
发明内容
为了提高百香果苗的抗寒性，本发明的目的是提供一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法。
本申请提供一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，采用如下的技术方案：
（一）将印度梨形孢接种在KM固体培养基上，置于28℃的黑暗恒温培养箱中培养5-6天；
（二）切取KM固体培养基上的印度梨形孢真菌菌丝块，接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH值为7；
（三）将接有菌丝块的PDA液体培养基置于150 r/min、温度为30℃的摇床中黑暗培养7天；
（四）用榨汁机粉碎菌液中的菌丝团，加入无菌水至印度梨形孢菌液最终浓度为OD600nm=1.121；
（五）将获得的印度梨形孢菌液注射至百香果幼苗根部附近。
通过采用上述技术方案，将印度梨形孢菌液喷施在百香果的根部附近，使得印度梨形孢侵染百香果的根系，从而使得百香果的根系抗寒性提高。
优选的，步骤三还包括：使用250 mL锥形瓶，每瓶PDA液体培养基200 mL，每瓶PDA液体培养基中放入2块菌丝块。
通过采用上述技术方案，通过在PDA液体培养基中放入2块菌丝块，一方面能够提高印度梨形孢繁殖的速率，另一方面能够提高印度梨形孢的存活率。
优选的，每块菌丝块大小约为1 cm2。
通过采用上述技术方案，通过将菌丝块设置成为1cm2，提高接种操作过程的便捷性。
优选的，根部内生真菌印度梨形孢在百香果苗根部附近注射两次。
通过采用上述技术方案，通过在百香果苗根部注射两次，能够有效提高印度梨形孢与百香果根部的结合效率，使侵染充分。
优选的，两次注射间隔时间为15天。
通过采用上述技术方案，通过将注射的时间间隔设置成为15天，使得百香果的根系能够得到充分的适应时间。
优选的，根部内生真菌印度梨形孢在植物根部附近注射量为每次5 mL菌液。
通过采用上述技术方案，5 mL菌液量能够达到浸润多数百香果根系的需求。
优选的，将印度梨形孢菌液注射在离植株茎干5厘米的位置。
通过采用上述技术方案，通过将菌液注射在离植株茎干5厘米的位置，使得菌液能够与大多数根系的根端接触，从而提高菌液与根系的侵染效率。
优选的，印度梨形孢菌液置于4℃冰箱保存备用。
通过采用上述技术方案，4℃冰箱保存能够使印度梨形孢的菌液保持活性。
优选的，选取生长健壮的百香果幼苗且高度为28-33 厘米。
通过采用上述技术方案，通过选择生长健壮的植株，能够提高百香果植株的存活率。
本发明的优点及积极效果为：
本发明为植入根部内生真菌印度梨形孢，增强百香果抗寒性，选用生长健壮的百香果单株幼苗作为被接种植株，配制PDA液体培养基，将固体印度梨形孢菌株接入PDA液体培养基中，放于摇床室温振荡培养。将获得的菌液注射至百香果植株幼苗根部附近，注射两次，将获得植入根部内生真菌印度梨形孢的百香果植株幼苗。
附图说明
图1为印度梨形孢共生对百香果低温表型的影响示意图；
图2为印度梨形孢对低温胁迫百香果叶片电导率和MDA含量的影响图；
图3为印度梨形孢对低温胁迫百香果叶片渗透调节物质的影响图；
图4为印度梨形孢对低温胁迫百香果叶片抗氧化酶的影响图；
图5为印度梨形孢对低温胁迫百香果叶片活性氧含量的影响图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合附图1-5对本申请作进一步详细说明。
本申请公开一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法。
（1）将印度梨形孢接种在KM固体培养基上，置于28℃的黑暗恒温培养箱中培养5天，也可以选择培养6天；
KM固体培养基的配方，15.00 g琼脂、2.00 g蛋白胨、1.00g酵母提取物、1.00 g水解酪蛋白、50mL 20 X Salt stock solution、10mL 100 X Microelement stocksolution、10mL Fe-EDTA、1mL 1000 X Vitamin stock solution、H20 930 mL；
其中20 X Salt stock solution：12.00 g NaN03、10.40 g KCl、10.40 gMgS04·7H20、30.40 g KH2POa、1000 mL H20；
100 X Microelement stock solution：2.20 g ZnSO4·7H20、1.00 g H3B03、0.50g MnS04·H20、0.16 g CoC1·5H20、0.16 g CuS04·5H20、0.11 g (NHa)6MO7O24、1000 mLH20；
Fe-EDTA：0.13 g FeSO4、0.18 g EDTA、100 mL H20；
1000 x Vitamin stock solution：0.10 g Thiamin (B1)、0.04 g Glycin(H2NCH2COOH)、0.01 g Nicotinure (C6H5NO2)、0.01 g Pyridoxin (VitaminB6)、1000 mLH20；
用10% KOH调节pH至6.5-6.8，121℃灭菌20 min。
（2）PDA液体培养基制备：取200 g马铃薯加蒸馏水至1 L煮沸，马铃薯煮成泥后过滤去除马铃薯，留上清液加入20 g葡萄糖，中和溶液PH值至7。将配置好的PDA液体培养基分装为200 ml每瓶，瓶子选用250 ml锥形瓶。
（3）切取KM固体培养基上的印度梨形孢真菌菌丝块，每块菌丝块大小约为1cm2，接入步骤（2）中所得PDA液体培养基中，每瓶接种2块，将接有菌丝块的PDA液体培养基置于150r/min、温度为30℃的摇床中黑暗培养7天。
（4）使用注射器将步骤（3）中获得的菌液抽取20ml，用榨汁机粉碎菌液中的菌丝团，加入无菌水至菌液最终浓度为OD600nm=1.121。
（5）选用生长健壮的“福建百香果1号”品种百香果单株健康的幼苗作为接种植株，植株高度为28-33厘米，将浓度为OD600nm=1.121的菌液注射至百香果幼苗根部附近，每次的注射量为5 ml，注射的位置距离百香果苗的茎5厘米的位置，根部内生真菌印度梨形孢在百香果苗根部附近注射两次，两次注射间隔时间为15天。获得接种根部内生真菌印度梨形孢的百香果幼苗。
1材料与方法
为了检验本方法的效果，将百香果幼苗随机分成对照组（CK）和印度梨形孢处理组各20株。印度梨形孢处理组按照上述方式处理，对照组为蒸馏水。之后将幼苗置于25 ℃培养7天，置0℃低温胁迫处理0，6，12和24 h，记录低温胁迫后植株表型特征，取顶部真叶第2~3片叶用于生理生化指标测定，每个处理设5个生物学重复。
1.1 生理生化指标的测定
采用台盼蓝染色法鉴定印度梨形孢与百香果根系共生情况；参考电导率法测定百香果叶片相对电导率；测定可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸（proline，Pro）含量、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性、过氧化氢酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度等参考王学奎等方法；测定谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）含量、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性、过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）浓度和超氧阴离子（Superoxide anion radical，O2-）浓度参考曹建康等方法。
2 结果与分析
2.1印度梨形孢与百香果共生
参照图1-A，PDA液体培养基（内含P. indica菌丝块）置于摇床上振荡培养时，菌丝呈现团块状生长，团块随时间增加菌丝体逐渐变大。参考图1-B，接种P. indica 15 d后，检测百香果根系定植情况，在10倍显微镜下可清晰地观察到百香果根表皮上的印度梨形孢圆形或梨形的厚垣孢子，说明P. indica成功定植在百香果根系。
2.2印度梨形孢处理对百香果幼苗表型的影响
参照图1-C，低温胁迫开始时，两组处理对百香果表型均无明显差异，而0℃处理24h后两组低温损伤症状差异显著。CK组幼苗叶片表现出卷曲、萎蔫和水渍等受冻症状；P. indica组也出现冷害症状，但叶片卷曲程度明显轻于CK组，水渍面积更少。
2.3印度梨形孢对低温胁迫下百香果叶片细胞膜的影响
参照图2-A，百香果叶片电导率随着低温胁迫时间的延长而升。定植印度梨形孢的百香果叶片在低温胁迫12 h和24 h后相对电导率显著低于对照组(P ＜0.05)，分别下降了21.51%和24.30%。
参照图2-B，低温胁迫后百香果叶片MDA含量升高。在低温胁迫12 h和24 h后对照组MDA含量增加含量是0 h的2.28倍和2.74倍；值得注意的是P. indica处理的百香果叶片显著低于未经P. indica处理的植株(P ＜0.05)，分别降低了25.86%和18.65%。
2.4印度梨形孢对低温胁迫下百香果渗透调节物质的影响
参照图3-A，随着低温处理时间的延长，脯氨酸Pro含量呈上升趋势。两组处理在0h和6 h后Pro含量差异不显著(P >0.05)；低温胁迫至12 h和24 h时，脯氨酸Pro含量与对照组相比差异显著(P ＜0.05)，P. indica处理的百香果叶片脯氨酸Pro含量增强了35.72%和36.42%；P. indica处理在整个过程达到显著水平(P ＜0.05)，24 h与0 h相比升高了108.18%。
参照图3-B，低温胁迫初期，两种处理可溶性蛋白含量逐渐上升。P. indica处理前6 h差异不显著(P >0.05)，第12 h和24 h比对照组显著升高和20.79%和38.51%。
参照图3-C，可溶性糖随着低温胁迫时间的延长呈现上升趋势。P. indica组百香果叶片的可溶性糖含量在低温胁迫6 h、12 h、24 h后显著高于CK组(P ＜0.05)；24 h后的可溶性糖含量是对照组的1.3倍。
2.5印度梨形孢对低温胁迫下百香果抗氧化酶的影响
参照图4-ABC，低温胁迫下P. indica处理增强了百香果叶片的SOD活性、APX活性和CAT活性。参照图4-A，经P. indica处理，低温下百香果叶片SOD酶活性呈现上升趋势。对照组低温胁迫初期呈上升趋势，到达12 h后SOD达到峰值604.32 U/g后，开始下降；与对照组比，P. indica处理的6 h和12 h显著高于对照组(P ＜0.05)；参照图4-B，APX活性随低温胁迫时间的延长表现出上升趋势，接种印度梨形孢的百香果植株叶片APX活性显著高于对照组(P ＜0.05)，在6 h、12 h、24 h分别升高了23.79%、28.27%和32.21%；参照图4-C，P. indica处理的CAT活性呈显著上升趋势，对照组表现出升-降-升的趋势，在胁迫12 h和24 h时P. indica处理的CAT活性显著高于对照组，分别提高了60.16%和49.10%。
参照图4-DEF，低温胁迫下P. indica处理抑制百香果叶片的PPO活性、H2O2浓度和O2-浓度的升高。对照组PPO活性呈先升高后下降趋势，胁迫12 h内诱导PPO活性快速升高（0.66 U/g），然后开始下降；而P. indica处理的PPO活性在24 h内缓慢增加且显著低于对照组(P ＜0.05)，低温胁迫6 h和12 h后分别降低63.49%和81.06%。两组H2O2浓度均呈现先上升后下降的趋势，低温胁迫6 h后对照组迅速升高，比0 h增加了43.55%，随着胁迫时间延长逐渐降低；而P. indica处理组的变化趋势较平缓，先缓慢升高后缓慢降低。P. indica处理组的H2O2含量在胁迫第6 h、第12 h和第24 h时较对照组存在显著差异(P ＜0.05)，分别降低了28.49%、9.96%和13.63%。两组的O2-浓度呈动态变化，在整体低温胁迫过程中P. indica组显著低于对照组。
2.6印度梨形孢对低温胁迫下百香果叶片抗氧化物的影响
参照图5-A，百香果叶片GSH活性随低温胁迫时间延长整体逐渐增加。与对照组相比，低温处理0 h时P. indica组GSH活性差异不显著，胁迫6 h时GSH活性升高了28.69%，低温胁迫达到12 h时GSH活性最高(2.26 μmol/g)，增加了23.23%。
参照图5-B，在低温胁迫下对照组与P. indica组GR活性随着低温胁迫时间的增加呈先上升后下降的趋势，两组GR活性在12 h达到峰值（162.71和197.38 nmol/min/g），随后开始下降。低温处理0 h，GR活性与对照组相比差异不显著；低温胁迫6 h和12 h时，P. indica处理组GR活性显著高于对照组(P＜0.05)，分别提高了14.71%和21.31%，而胁迫至24h时则出现降低。
综上，印度梨形孢定殖后，显著提高百香果叶片抗氧化酶活性，提高清除活性氧ROS能力。印度梨形孢共生植株细胞膜稳定和抗氧化能力强，提高种苗抗寒性。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：
（一）将印度梨形孢接种在KM固体培养基上，置于28℃的黑暗恒温培养箱中培养5-6天；
（二）切取KM固体培养基上的印度梨形孢真菌菌丝块，接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH值为7；
（三）将接有菌丝块的PDA液体培养基置于150 r/min、温度为30℃的摇床中黑暗培养7天；
（四）用榨汁机粉碎菌液中的菌丝团，加入无菌水至印度梨形孢菌液最终浓度为OD600nm=1.121；
（五）将获得的印度梨形孢菌液注射至百香果幼苗根部附近。
2.根据权利要求1所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：步骤三还包括：使用250 mL锥形瓶，每瓶PDA液体培养基200 mL，每瓶PDA液体培养基中放入2块菌丝块。
3.根据权利要求1所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：每块菌丝块大小约为1 cm2。
4.根据权利要求1所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：根部内生真菌印度梨形孢在百香果苗根部附近注射两次。
5.根据权利要求4所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：两次注射间隔时间为15天。
6.根据权利要求4所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：根部内生真菌印度梨形孢在植物根部附近注射量为每次5 mL菌液。
7.根据权利要求4所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：将印度梨形孢菌液注射在离植株茎干5厘米的位置。
8.根据权利要求1所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：印度梨形孢菌液置于4℃冰箱保存备用。
9.根据权利要求1所述的一种基于植入印度梨形孢提高百香果抗寒性的方法，其特征在于：选取生长健壮的百香果幼苗且高度为28-33 cm。
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