CN108148785B

CN108148785B - 一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌cz08152及其应用

Info

Publication number: CN108148785B
Application number: CN201810098752.4A
Authority: CN
Inventors: 胡春锦; 曾泉; 史国英; 农泽梅; 岑贞陆; 叶雪莲
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN108148785A

Abstract

本发明公开了一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，伯克霍尔德氏菌CZ08152的分类命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CZ08152，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5743。本发明能够应用于生产具有促进农作物生长以及抑制植物病害、提高植物抗逆境胁迫的微生物菌剂和生物有机肥，增强植物对逆境胁迫的抗性，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。

Description

一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用。

背景技术

广西是我国最大的蔗糖生产产区，甘蔗及蔗糖产量占全国60％以上。但是，一直以来我国甘蔗生产成本高，缺乏国际竞争力。在甘蔗生产的各项农资投入中，化肥尤其是氮肥所占比重最大，其对甘蔗产量的影响也最为显著。此外，我国甘蔗主产区蔗地90％以上为旱坡地，土壤保水、保肥能力差，化肥利用率很低。甘蔗梢腐病是一种普遍发生的甘蔗病害，原菌为串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme Sheldon)，在我国的广西、广东、福建、云南等省蔗区均有该病害的发生。甘蔗梢腐病主要发病部位在甘蔗的梢头嫩叶，感病蔗叶不能正常伸展，严重时导致甘蔗梢头腐烂，致使梢头坏死，最终蔗株枯死。近年来，梢腐病在我国主要蔗区的发生呈逐渐加重的趋势，已成为甘蔗伸长期的一种主要病害，并且对甘蔗的产量和品质造成了严重的影响。蔗田里的病株残余和病株是该病害的主要初侵染源，蔗田高温高湿、长期干旱后遇雨水或灌水过多的情况下容易诱发该病害，甚至导致该病害大面积爆发流行。在我国该病害高发时期为每年的7-9月，这个时期天气高温多雨，该病害病原菌产生的分生孢子极易通过气流、雨水等在田间进行传播扩散，在适宜的温湿度条件下侵入幼嫩叶部导致蔗株发病。

一直以来，我国关于甘蔗梢腐病的防治研究并不多，只是随着近年来该病发生为害的日益严重，该病害的防治及相关研究才逐步得到重视。当前，开发和使用具有生防作用的农业微生物资源已成为现代农业发展的一个方向。结合合理的农业措施、种植抗病品种以及利用生物防治方法控制甘蔗梢腐病的为害，促进甘蔗产业的健康发展是目前亟待解决的问题。

洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌，因其可以产生多种抗菌成分而成为生物防治中的主要成员。近年来的研究表明，洋葱伯克霍尔德氏菌不是一个种，而是一组表型相近但基因型不同的复合物，称为洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex，简称BCC)，至今已发现BCC包括20个不同的基因型，由于这些基因型之间有很低的DNA杂交率，因此可代表不同的种。上个世纪80年代初，人们在研究中发现部分BCC菌株可降解农药和除草剂中一些长期存在且对人有潜在致癌作用的化学物质，还可净化污水，具有非常好的生态和经济价值；同时还发现有些BCC菌株具有防治植物病虫害和促进植物生长的作用，被制成生物杀虫剂和生物杀菌剂，在农业生产中起着重要作用。但是，与此同时，人们又发现该菌的一些菌株是人体条件致病菌。欧美一些国家因其部分菌株为条件致病菌而放弃或者限制BCC生物农药的使用，但目前仍有不少国家在生产和使用以它为原料制成的生物农药，我国也于1996年注册了该类产品。目前已研究发现，BCC致病菌株与特定的毒力基因(BCESM基因)存在相关性。BCESM基因被认为是BCC菌中一种与人体致病性/毒性连锁的遗传标记，对已经注册的洋葱伯克霍尔德氏菌株，一旦发现该类标记的存在，则撤销注册。因此，通过致病因子BCESM基因的检测，可以区分BCC的致病菌株和非致病菌株。当然，为了确保BCC生防菌株使用的安全性，利用动物模型(小白鼠)或植物模型来进一步检测菌株是否有致病性也是必要的。苜蓿是用于医院呼吸道感染细菌致病性测定的模式植物。人们研究发现，苜蓿可以代替老鼠作为模式植物测定BCC菌群对哺乳动物的毒性，苜蓿模型甚至表现出了比老鼠模型更高的灵敏度。因此，用苜蓿模型可简单快捷地检测出BCC菌株对哺乳动物是否具有致病性，为安全利用BCC菌株奠定了基础。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用，能有效的防治甘蔗梢腐病，并且具有较高联合固氮以及拮抗多种病原真菌特性。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，伯克霍尔德氏菌CZ08152的分类命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CZ08152，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年02月07日，保藏号：CGMCCNo.5743。

本发明所提出的菌株是从广西壮族自治区崇左市郊种植的甘蔗品种新台糖22号的茎基部组织分离筛选出来的，通过无氮培养基筛选、固氮酶活性测定、固氮酶基因nif H扩增及序列分析，确定其为甘蔗内生固氮菌。

菌株固氮酶活性采用乙炔还原乙烯法(acetylene reduction assay，ARA)测定，实验结果表明，本发明菌株具有较高固氮酶活性，其乙炔还原乙烯活性约为1752nmol C₂H₄/h。

优选的是，所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在防治植物真菌性病害的病原菌中的应用，对植物真菌性病害病原菌生长具有抑制作用。

优选的是，所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在防治植物真菌性病害的病原菌中的应用：利用平板对峙培养法测定伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对多种植物病原菌的拮抗作用。

优选的是，所述的植物真菌性病害的病原菌为甘蔗梢腐病菌(Fusariummoniliforme Sheldon)、甘蔗凤梨病菌[Ceratocystis paradoxa(Dode)Moreau]、甘蔗赤腐病菌(Colletotrichum Falcatum)、甘蔗虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、玉米大斑病菌[Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard et Suggs]或玉米小斑病菌[Cochliobolusheterostrophus(Drechsler)Drechsler]中的一种。

优选的是，所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在促进农作物生长中的应用。

优选的是，所述的农作物为玉米或甘蔗。

优选的是，所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在促进农作物生长中的应用，操作为：将活化后的伯克霍尔德氏菌CZ08152在LB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1×10⁸-2×10⁸个细胞，即得伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液，根据不同作物将接种军悬液分别作用于作物，即得。

优选的是，当农作物为玉米时，将第二片真叶完全展开的玉米秧苗置于所得接种菌悬液浸泡20分钟并移栽，即得；伯克霍尔德氏菌CZ08152促进玉米生长主要是提高了玉米对干旱胁迫的抗性，促进植株的干物质积累。

优选的是，当农作物为甘蔗时，将100ml所得接种菌悬液倒入每株甘蔗苗中，即得；伯克霍尔德氏菌CZ08152促进甘蔗生长主要是提高了甘蔗的固氮作用；将甘蔗幼苗移栽到含(¹⁵NH₄)₂SO₄的栽培基质上，并于移栽当天以及移栽7d、15d分别以伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液接种，每株每次的接种菌液量为100mL，80d后收获植株并测定植株干重、含氮量及¹⁵N含量，计算固氮效率，通过氮同位素稀释法证明接种菌株CZ08152对甘蔗苗氮素的贡献达到8.62％-15.63。

优选的是，所述LB液体培养基由蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL组成，pH7.0。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152对甘蔗梢腐病菌、甘蔗凤梨病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗虎斑病菌、玉米大斑病菌或玉米小斑病菌具有抑制作用，其中对甘蔗梢腐病病原菌丝生长抑制率高达81.4％，对甘蔗梢腐病菌分生孢子萌发的抑制率高达100％；进一步的，本发明能够应用于生产具有促进农作物生长以及抑制植物病害、提高植物抗逆境胁迫的微生物菌剂和生物有机肥，增强植物对逆境胁迫的抗性，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152对甘蔗生长的促进作用。

图2是本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152显著提高了玉米幼苗对干旱胁迫的抗性。

图3是本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152对甘蔗梢腐病菌生长的抑制作用。

图4是本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152对洋葱的致病性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的培养基除特别声明的外，皆为市售所得；其中，采用的Ashby无氮培养基成分为蔗糖10g，NaCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，CaCO₃ 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0；采用的LB液体培养基由蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL组成，pH7.0；采用的普通秸秆类育苗基质由南宁桂裕鑫农业科技有限公司生产。

实施例1

菌株的分离、筛选及鉴定

一、菌株的分离

供试材料：采自广西壮族自治区崇左市郊种植的甘蔗品种新台糖22号的茎基部组织。

取甘蔗蔗茎，在超净工作台上先用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡1min，70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次。称取1g表面灭菌的组织块浸于10mL磷酸盐缓冲液在无菌的研钵中研碎后静置5min，取上清液用无菌水做10倍梯度稀释，分别取原液和稀释液100μL涂布Ashby无氮培养基平板，在28℃培养2-3d至长出单菌落。菌落长出后，在Ashby无氮培养基平板上用划线法进行菌种纯化。

二、确证菌株为甘蔗内生固氮菌

(一)采用乙炔还原乙烯法(acetylene reduction assay，ARA)测定菌株的固氮酶活性。

将菌株CZ08152活化后在Ashby液体培养基中生长48h，取1mL菌液接种于灭菌的含10mL Ashby液体培养基的60mL磨口小口瓶中，培养24h后从瓶内抽出5mL气体，然后再注入5mL乙炔气体，继续培养24h，用气相色谱仪检测乙烯生成量，以nmolC₂H₄/h.mL表示固氮酶活性。以巴西甘蔗内生固氮菌G.diazotrophicus PAL5为阳性对照，以接种1mL灭活菌液的处理作为空白对照。

实验结果表明，本发明菌株具有较高固氮酶活性，其乙炔还原乙烯活性约为1752nmol C₂H₄/h，高于阳性对照巴西甘蔗内生固氮菌模式菌株G.diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmol C₂H₄/h。

(二)菌株的nifH基因扩增及序列分析。

PCR扩增模板的制备：将菌株CZ08152活化后接种到LB液体培养基，培养20h后离心收集菌体备用。用细菌基因组DNA提取试剂盒，按产品说明书从新鲜的细菌LB培养物中提取本发明菌株的基因组DNA，保存于-20℃，DNA含量约为50-100ng/μL。

nifH基因分析：扩增引物为PolyF(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)如SEQ ID NO.9所示，和PolyR(ATSGCCATCATYTCRCCGGA)如SEQ ID NO.10所示，，PCR反应程序为：94℃3min预变性，然后进行94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，最后72℃10min。PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。以固氮葡糖醋酸杆菌G.diazotrophicus PAL5菌株(Gillis etal.，1989)为阳性对照，以大肠杆菌E.coli DH5α菌株为阴性对照。将nifH扩增产物回收以后克隆到T载体上，按宝生物工程(大连)有限公司(简称TaKaRa)的pMDTM18-T Vector克隆试剂盒说明来操作。经PCR验证的阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。

研究结果表明该菌株含有nifH基因，扩增片段大小为362bp，其序列与NCBI网上公布的登录号为EU938522的Burkholderia cenocepacia的nifH序列完全一致。

(三)菌株的内生性试验

将已生根甘蔗组培苗分成单株，移入装有50ml不含维生素和植物激素的1/10MS培养液的培养瓶中，培养5d后，选没有显见微生物污染的培养瓶内的蔗苗用于接种CZ08152菌株。将用利福平(300mg/mL)标记过的菌株CZ08152过夜培养后离心收集菌体，用1/10MS培养液悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1×10⁸-2×10⁸个细胞，取100μl菌悬液接入甘蔗组培苗的培养瓶中。

取接种7d的甘蔗苗，用无菌水冲洗后放入三角瓶中，加入1％氯胺-T溶液，在25℃，振荡30min后，用无菌水冲洗6次，每次5min，取最后一次冲洗的无菌水100μl铺在LB平板上，检测表面灭菌是否彻底。用灭菌滤纸吸干甘蔗苗表面水分，称重后加入磷酸盐缓冲液研磨，取上清液10倍系列稀释后铺在含利福平的LB平板，30℃培养2-3d，计录平板上的菌落数。

实验结果表明，接种后7d，从甘蔗组培苗的根和地上部分重新分离到CZ08152菌株，数量达到3.76×10⁸cfu/mL，从未接种的甘蔗苗中没有分离到该菌株。经1％氯胺-T溶液表面消毒30min，最后一次冲洗植株的无菌水在培养基上没有长出菌落，表明表面灭菌彻底。说明菌株CZ08152与甘蔗组培苗共培养一周，能够侵入甘蔗苗体内，具有植物内生性。

因此，通过无氮培养基筛选、固氮酶活性测定、固氮酶基因nifH扩增及序列分析，确证菌株CZ08152为固氮菌，内生性试验进一步证明了该菌株为甘蔗内生固氮菌。

三、菌株的分类鉴定

(一)菌株形态特征

菌落形态特征观察：菌株CZ08152为革兰氏阴性细菌，菌落圆形，湿润，隆起，边缘光滑，在Ashby平板上为白色，不透明，在LB平板上呈淡黄色，不透明，生长48h后单菌落直径约2mm。

(二)菌株16S rDNA序列分析

菌株CZ08152的16S rDNA序列分析：利用细菌16S通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)如SEQ ID NO.7所示，和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)如SEQ IDNO.8所示扩增细菌的16S rDNA基因。PCR反应程序为：94℃3min预变性，然后进行94℃55s，50℃50s，72℃1min，35个循环，最后72℃10min。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收以后克隆到T载体上，选择阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。

实验结果表明，菌株CZ08152的16S rDNA片段为1399bp，BLAST比对结果显示与大部分B.cepacia菌株的16S rDNA序列同源性达99％以上，在系统进化上与洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)各属的亲缘关系近。该菌株的16S rDNA已在GenBank上注册，登录号为FJ823011。

(三)菌株的Biolog鉴定

在LB平板上活化菌株，挑取单菌落至Biology鉴定系统提供的BUG琼脂培养基平板，30℃培养16-24h。用无菌棉签将BUG琼脂培养基平板上的菌体悬浮于0.85％NaCl溶液，调节菌悬液OD₆₀₀为0.2，向Biolog-GN2 96孔板的每个孔中加入150μL菌液，30℃培养。分别在4-6h和16-24h用BIOLOG微生物自动鉴定仪及Biolog Microstation 4.20.05系统检测和分析代谢指数。

Biolog微生物鉴定系统检测结果显示，菌株CZ08152的碳源代谢谱与Burkholderia ambifaria的最相似，SIM值为1.0。

(四)BCC菌群的特异性扩增

为确定菌株CZ08152为BCC菌，利用BCC菌种群的特异引物BCR0(ACAGTGTCTGCATTCGTG)如SEQ ID NO.4所示、BCR1(CTTGACCGCCGAGAAGAGCAA)如SEQ IDNO.5所示和BCR2(CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC)如SEQ ID NO.6所示对CZ08152进行PCR扩增。扩增采用巢氏PCR，首轮PCR使用BCR0/BCR2做引物，反应条件95℃预变性3min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环。第二轮PCR使用BCR1/BCR2做引物，2μL首轮PCR产物做模板，除退火温度改为62℃外，其它条件与首轮PCR相同。

PCR扩增产物电泳检测结果获得了一条大小为1000bp左右的BCC菌群特异条带，证明该菌株为BCC菌。

进一步利用BCC的不同基因型鉴定引物对伯克霍尔德氏菌CZ08152进行PCR扩增，PCR反应程序除退火温度参考不同引物的推荐使用温度范围以外，其它条件与菌株16SrDNA的扩增条件相同。PCR扩增产物的检测结果显示，仅基因型B.ambifaria的特异引物BCRBC1(GTCGGGTAAAACCACGCTG)如SEQ ID NO.2所示，和BCRBC2(ACCGCAGCCGCACCTTCA)如SEQ ID NO.3所示能扩增出大小为800bp左右的特异条带，其它不同基因型的特异性引物均未扩增出条带。

因此，综合菌株的菌落形态、16S rDNA序列分析、Biolog细菌鉴定系统、BCC菌群的特异性扩增PCR、BCC的不同基因型鉴定引物检测等分析，将本发明菌株鉴定为两面伯克霍尔德菌(Burkholderia ambifaria)，菌株编号为CZ08152，但在保藏时，将该菌株保藏为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CZ08152，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年02月07日，保藏号：CGMCCNo.5743。

实施例2

伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对甘蔗的固氮促进生长作用

栽培基质为普通秸秆类育苗基质，按比例每kg基质加入10mg(¹⁵NH₄)₂SO₄，分装到塑料盆中。伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株活化后在LB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2×10⁸个细胞，即得伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液。选用甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的组培苗作为接种对象，将炼苗后生长一致的甘蔗组培苗移栽到装有栽培基质的塑料盆中，每盆浇入上述所得伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液100mL，作为实验组“接种CZ08152”。对照接种等量无菌水，即将接种的伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液体替换成等量无菌水，其余操作相同，作为对照组“无菌水”。两种接种处理后的植株置于温室培养，7d以及15d后分别以同样浓度的菌悬液灌根再接种2次，80d后对甘蔗组培苗的生长情况进行记录，收获植株并洗净栽培基质，冷冻干燥后测定植株干重、含氮量及¹⁵N含量，计算固氮效率。固氮效率根据公式Ndfa＝100×[1－(atom％¹⁵N接种植株/atom％¹⁵N对照植株)]计算。

试验测定结果见图1(图1中无接菌对照即为对照组)和表1，接种伯克霍尔德氏菌CZ08152菌悬液能显著促进甘蔗组培苗的生长，甘蔗组培苗的株高和干重分别比对照增加了21.69％和27.90％，植株的根、茎和叶从空气中获得氮的百分率(固氮效率)分别为8.62％、15.63％和12.39％。

表1.伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液对甘蔗生长及氮素利用的影响

实施例3

伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对玉米幼苗生长的促进作用

将伯克霍尔德氏菌CZ08152活化后在LB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2×10⁸个细胞作为接种菌悬液，即得伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液。取大小均匀的玉米种子在2％NaClO中浸泡30min，用无菌水洗数次至无NaClO残留，置于无菌培养皿内30℃下浸泡吸胀1d，倒去多余的水，再置于30℃下催芽。种子露白后播于普通秸秆类育苗基质中，当第二片真叶完全展开时蘸秧根并移栽(具体方法为：选取大小一致的秧苗置于伯克霍尔德氏菌CZ08152菌悬液中，作为实验组“接种CZ08152”；对照置于无菌水中浸根，即将接种的伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液体替换成等量无菌水，其余操作相同，作为对照组“无菌水”；两组处理所得秧苗分别浸泡20min后移栽)。

将浸泡后的秧苗移栽到装普通秸秆类育苗基质的栽培盆中，置于温室生长，定期定量浇水，20d后对玉米的生长情况进行记录、拍照和测定以下各项生理指标：株高、干重和主要营养元素含量。

接种试验测定结果见图2(图2中无接菌对照即为对照组)和表2，伯克霍尔德氏菌CZ08152对玉米具有显著的促生作用，主要表现在能显著提高玉米幼苗抗干旱胁迫的能力，促进植株的干物质积累。经过24-40h的干旱胁迫，无接菌对照处理的玉米幼苗出现了明显的萎蔫症状，而接菌处理的植株仍保持良好的长势(图2)。接种20d后玉米幼苗的株高比对照增加28.32％，干重比对照增加70.89％，接菌处理植株的总氮含量以及磷素含量分别比对照增加了26.95％和21.33％。

表2.伯克霍尔德氏菌CZ08152对玉米幼苗的接种效应

实施例4

伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对多种植物病原真菌的拮抗作用

采用平板对峙法，分别在培养皿中央接种各病原菌菌饼，离该菌饼约3cm处，用接种环沾取培养48h的伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株，在平板对称两测各划一条约3cm的细线，正放于28℃培养，以仅接种病原菌的平板为对照，重复3次。待对照长满全皿时测量病原菌菌落生长直径，计算本发明菌株对病原菌生长的抑制率。

试验结果见表3，本发明菌株对甘蔗梢腐病菌(Fusarium moniliforme Sheldon)、甘蔗凤梨病菌[Ceratocystis paradoxa(Dode)Moreau]、甘蔗赤腐病菌(ColletotrichumFalcatum)、甘蔗虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、玉米大斑病菌[Exserohilumturcicum(Pass.)Leonard et Suggs]、玉米小斑病菌[Cochliobolus heterostrophus(Drechsler)Drechsler]等多种重要真菌性病害的病原菌具有较强的拮抗作用，抑制率达到70.5～84.6％。伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对甘蔗梢腐病菌生长的抑制效果见图3(图3中无接菌对照即为对照组)。

表3伯克霍尔德氏菌CZ08152对多种植物病原真菌的拮抗作用

供试植物病原菌	抑菌率(％)
		甘蔗梢腐病菌F.moniliforme	81.4
甘蔗凤梨病菌C.paradoxa	70.5
		甘蔗赤腐病菌C.Falcatum	79.4
甘蔗虎斑病菌R.Solani	84.6
		玉米大斑病菌E.Turcicum	80.5
玉米小斑病菌C.Heterostrophus	78.5

实施例5

伯克霍尔德氏菌CZ08152对甘蔗梢腐病菌分子孢子萌发的抑制作用

将伯克霍尔德氏菌CZ08152活化后在LB液体培养基上培养20h的发酵液作为待接种菌液。

将F.moniliforme病原菌接入液体马铃薯葡萄糖培养基中，120rpm，28℃摇床培养3d，通过血球计数板，将病原菌分生孢子悬浮液的浓度调节至2×10⁴cfu/mL，取10μL孢子悬浮液涂布于PDA平板。以加入伯克霍尔德氏菌CZ08152发酵液稀释10倍的PDA平板为处理组，不加入发酵液的PDA平板为对照组。每个处理3次重复。28℃，培养3d后观察，统计平板上的菌落数，计算抑制率。抑制率＝[(对照组平均菌落数量-处理组平均菌落数量)/对照组平均菌落数量]×100％。

菌落计数结果如下：不加入伯克霍尔德氏菌CZ08152发酵液的空白对照组的3个PDA平板上的菌落数分别为140个、132个和129个，而加入CZ08152菌株发酵液处理的平板上菌落数为0。由此可见，上述发酵所得CZ08152菌液对F.moniliforme分生孢子的萌发具有强烈的抑制作用，抑制率达100％。

实施例6

伯克霍尔德氏菌CZ08152的安全性评价

(1)菌株对洋葱的致病性检测

对洋葱鳞茎的致病性检测用1ml一次性灭菌注射器吸取100μl含10⁷个细胞的伯克霍尔德氏菌CZ08152菌悬液，针刺接种新鲜且健康的洋葱鳞茎，以无菌水作对照。接种后于人工气候箱内在30℃、相对湿度95％和12h光-12h暗的条件下培养，每天观察洋葱鳞茎是否腐烂。

接种洋葱鳞茎7d后，洋葱鳞茎没有腐烂迹象，表明伯克霍尔德氏菌CZ08152对洋葱没有致病性(如图4所示，图4中无接菌对照即为对照组)，该结果说明本发明伯克霍尔德氏菌CZ08152不是植物病原细菌，对植物安全。

(2)菌株对苜蓿的致病性检测

苜蓿是代替老鼠作为测定BCC对动物毒性的模式植物，用苜蓿模型可简单快捷地检测出BCC菌株对哺乳动物是否具有致病性。

将伯克霍尔德氏菌CZ08152接种到LB培养基中，30℃摇床培养(180rpm)培养24h，离心收集菌体，以无菌水调节菌县液浓度到10⁸用于接种。将紫花苜蓿种子用98％浓硫酸浸泡20min，以无菌水清洗4次，然后泡在无菌水中，30℃浸种7h，再清洗2次，换水后再浸泡10h，然后将种子放在水琼脂平板上准备接种。将琼脂平板上的种子用接种针刺一个小孔，取20μL准备好的伯克霍尔德氏菌CZ08152菌悬液点拉接种在伤口处，以针刺接种无菌水的种子作为对照。接种后的种子置于28℃光照培养箱中培养，7d后检查接种发病情况。

苜蓿接种结果显示，接种伯克霍尔德氏菌CZ08152的处理与无菌水对照一样均无发病症状，接种点附件无坏死现象，种子根和子叶均生长情况，没有出现共黄化现象。该结果表明菌株对哺乳动物是安全的。

(3)菌株是否含有BCC致病因子BCESM的检测

BCC菌群的致病因子B.cepacia epidemic strain marker(BCESM)序列的检测用Mahenthiralingam(1997)设计的引物BCESM1：5'-CCACGGACGTGACTAACA-3'如SEQ ID NO.11所示和BCESM2：5'-CGTCCATCCGAACACGAT-3'如SEQ ID NO.12所示，进行PCR扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析仪成像。经PCR检测，伯克霍尔德氏菌CZ08152没有扩增出约1400bp的BCESM致病因子序列。

本发明菌株为甘蔗内生固氮菌，具有固氮酶活性，含有固氮酶基因nif H，能与甘蔗进行联合固氮为甘蔗生长提供部分氮素营养，对甘蔗的生长具有显著促进作用。利用本发明菌株接种甘蔗组培苗，移栽并接种80d后甘蔗植株的株高和干重分别比对照增加了21.69％和27.90％，植株的根、茎和叶从空气中获得氮的百分率(固氮效率)分别为8.62％、15.63％和12.39％。

利用本发明菌株接种玉米幼苗，结果表明接种处理能显著促进玉米对干旱胁迫的抗性，同时促进玉米的生长。接种20d后玉米幼苗的株高比对照增加28.32％，干重比对照增加70.89％，接菌处理植株的总氮含量以及磷素含量分别比对照增加了26.95％和21.33％。

本发明菌株能抑制甘蔗梢腐菌、甘蔗凤梨病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗虎斑病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌等植物病原真菌的生长。本发明菌株对甘蔗梢腐病菌分生孢子萌发的抑制率达100％，对病原菌菌丝生长的抑制率达81.4％，可作为该病害的生防菌加以利用。

本发明菌株可应用于生产具有促进植物生长以及抑制植物病害、提高植物抗逆境胁迫的微生物菌剂和生物有机肥，增强植物对逆境胁迫的抗性，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西农业科学院微生物研究所

<120> 一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用

<130> 中誉威圣

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用(Burkholderia sp.)

<400> 1

caagtcggaa cggcagcacg ggtgcttgca cctggtggcg agtggcgaac gggtgagtaa 60

tacatcggaa catgtcctgt agtgggggat agcccggcga aagccggatt aataccgcat 120

acgatctacg gatgaaagcg ggggaccttc gggcctcgcg ctatagggtt ggccgatggc 180

tgattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatcagtagc tggtctgaga 240

ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaattttgg acaatgggcg aaagcctgat ccagcaatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 360

tcgggttgta aagcactttt gtccggaaag aaatccttgg ctctaataca gtcgggggat 420

gacggtaccg gaagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc gcaggcggtt tgctaagacc 540

gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattggt gactggcagg ctagagtatg 600

gcagaggggg gtagaattcc acgtgtagca gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaatacc 660

gatggcgaag gcagccccct gggccaatac tgacgctcat gcacgaaagc gtggggagca 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactagt tgttggggat 780

tcatttcctt agtaacgtag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt acggtcgcaa 840

gattaaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg tggattaatt 900

cgatgcaacg cgaaaaacct tacctaccct tgacatggtc ggaatcctgc tgagaggtgg 960

gagtgctcga aagagaaccg gcgcacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc cttagttgct acgcaagagc 1080

actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat 1140

ggcccttatg ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg gaacagaggg ttgccaaccc 1200

gcgaggggga gctaatccca gaaaaccgat cgtagtccgg attgcactct gcaactcgag 1260

tgcatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320

ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt ttaccagaag tggctagtct 1380

aaccgcaagg atggccg 1397

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

Claims

1.一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152的分类命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CZ08152，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年02月07日，保藏号：CGMCC No.5743。

2.一株如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在防治植物真菌性病害的病原菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152在防治植物真菌性病害的病原菌中的应用为利用平板对峙培养法测定伯克霍尔德氏菌CZ08152菌株对多种植物病原菌的拮抗作用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的植物真菌性病害的病原菌为甘蔗梢腐病菌、甘蔗凤梨病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗虎斑病菌、玉米大斑病菌或玉米小斑病菌中的一种。

5.根据权利要求1所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152在促进农作物生长中的应用。

6.根据权利要求5所述的所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：所述的农作物为玉米或甘蔗。

7.根据权利要求5所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：所述的伯克霍尔德氏菌CZ08152在促进农作物生长中的应用，操作为：将活化后的伯克霍尔德氏菌CZ08152在LB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1×10⁸-2×10⁸个细胞，即得伯克霍尔德氏菌CZ08152接种菌悬液，根据不同作物将接种军悬液分别作用于作物，即得。

8.根据权利要求7所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：当农作物为玉米时，将第二片真叶完全展开的玉米秧苗置于所得接种菌悬液浸泡20分钟并移栽，即得。

9.根据权利要求7所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：当农作物为甘蔗时，将100ml所得接种菌悬液倒入每株甘蔗苗中，即得。

10.根据权利要求7所述的甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152，其特征在于：所述LB液体培养基由蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL组成，pH7.0。