CN109452312B - 一种甘蔗内生伯克氏菌及其生防应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蔗内生伯克氏菌及其生防应用。筛选到一株高效抑制丝状真菌的伯克氏菌CGB10菌株。该菌株来源于甘蔗叶片内部，对希金斯炭疽菌（菜心炭疽病）、尖孢镰刀菌（香蕉枯萎病）、稻瘟病菌（稻瘟病）、荔枝炭疽菌（荔枝炭疽病）、荔枝霜疫霉菌（荔枝霜疫霉病）、甘蔗鞭黑粉菌（甘蔗鞭黑穗病）等丝状真菌病害具有强烈的抑制作用，具有优异的防治丝状真菌生防作用，尤其是对稻瘟病的防治。而且该生物来源环保无毒性，具有广谱抗病性，将其喷施到作物表面用于病害的防治，对生态环境影响小，不影响作物品质。将其制备丝状真菌病害防止制剂，制备方法简单，具有极好的应用前景。

Description

一种甘蔗内生伯克氏菌及其生防应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种甘蔗内生伯克氏菌及其生防应用。

背景技术

真菌在植物致病菌中占据约80%，其中大部分真菌通过菌丝侵染植物进而为害植物，并且在高温高湿的条件下会在病斑处长出绒毛（菌丝），这些特征是真菌性病害与细菌病害的主要区别之一。如香蕉枯萎病、稻瘟病、甘蔗黑穗病分别在香蕉、水稻、甘蔗的种植过程中带来了严重的经济损失。

在生物防治病害出现之前的很长一段时间内，植物病害防治主要以化学防治为主。农药防治呈现的趋势是高效即高毒，所以寻找高效低毒甚至无毒的病害防治方法也十分迫切。生物防治病害是解决化学防治高效高毒的方法中最为安全的之一。

已报道的芽孢杆菌对菜心炭疽病具有明显的拮抗作用（况福元等，2009）、链霉菌、荧光假单孢菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷菌和荚壳布克氏菌对香蕉枯萎病菌都具有明显的抑制作用（孙海彦等，2010 ）、芽孢杆菌对稻瘟病菌具有很好的抑制作用（王巧兰等，2005）、枯草芽孢杆菌对荔枝炭疽菌具有很好的拮抗作用（黄曦等，2011）、枯草芽孢杆菌多荔枝霜疫霉菌具有很好的抑制作用（姜子德等，2013）、荧光假单胞菌对甘蔗鞭黑粉病具有很好的防治作用（习平根，2014），假单胞菌对甘蔗鞭黑粉病有很好的防治作用（刘诗胤等，2016）。因此，筛选高效生防菌对于真菌病害的防治具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为稻瘟病等真菌病害提供一种新的生防菌。本发明从甘蔗叶片中分离出一株对不同属真菌菌丝生长具有抑制作用的伯克氏菌。大多数丝状真菌通过形成发达的菌丝对植物进行危害，而本发明中的甘蔗叶片内生伯克氏菌对菌丝生长具有强烈的抑制作用，所以在病害真菌病害防治中具有潜在的应用价值。

本发明的目的是提供伯克氏菌（Burkholderia sp.）在防治真菌病害方面的应用。

本发明另一目的是提供一株甘蔗内生伯克氏菌CGB10。

本发明再一目的是提供所述甘蔗内生伯克氏菌CGB10在防治真菌病害方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，伯克氏菌（Burkholderia sp.）对多种丝状真菌病害病原菌具有很强的抑制作用，并筛选到一株高效伯克氏菌CGB10菌株，该菌株于2018年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60471。保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼五楼。

将伯克氏菌CGB10置于丝状真菌病害病原菌周围培养，发现其能够直接具有强烈的抑菌作用，且造成了稻瘟病菌孢子萌发畸形。将本发明伯克氏菌的发酵粗提物应用于水稻稻瘟病的防治，发现其具有明显的防治效果。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内。

伯克氏菌在抑制真菌或制备抑制真菌制剂方面的应用。

伯克氏菌在防治真菌病害或制备防治真菌病害制剂方面的应用。

甘蔗内生伯克氏菌CGB10在抑制真菌或制备抑制真菌制剂方面的应用。

甘蔗内生伯克氏菌CGB10在防治真菌病害或制备防治病害制剂中的应用。

具体地，所述真菌是指丝状真菌。所述真菌病害是指丝状真菌病害病原菌引发的植物病害。

优选地，所述丝状真菌病害病原菌为包括但不限于希金斯炭疽菌（菜心炭疽病）、尖孢镰刀菌（香蕉枯萎病）、稻瘟病菌（稻瘟病）、荔枝炭疽菌（荔枝炭疽病）、荔枝霜疫霉菌（荔枝霜疫霉病）、甘蔗鞭黑粉菌（甘蔗鞭黑穗病）中的一种或多种。

所述伯克氏菌CGB10菌株可应用于防治菜心炭疽病、香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、荔枝炭疽病、荔枝霜疫霉病或甘蔗鞭黑穗病中的一种或多种。

另外，含有伯克氏菌的防治真菌病害的微生物制剂，也应在本发明的保护范围之内。优选地，所述伯克氏菌为本发明的甘蔗内生伯克氏菌CGB10。

另外，所述微生物制剂可含有伯克氏菌发酵粗提物。

优选地，所述发酵粗提物的制备方法为：将伯克氏菌活化，培养得到菌悬液，接种至PDA固体培养基中，在28℃~30℃培养过夜，乙酸乙酯浸泡，旋蒸至干，得到发酵粗提物。

其中，优选地，菌株活化的培养基为LB培养基，活化的条件为：28℃~30℃，摇床速率为150~350rpm，时间为22~25小时。

另外，基于上述研究，本发明还提供了一种防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害的方法，是使用上述微生物制剂对植物进行处理，可防治多种丝状真菌病害。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10代谢产物粗提物对多种丝状真菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，对于多数丝状真菌具有优异的防治作用。

2、本发明得到的甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10是来自健康的甘蔗植株种，排除了菌株对植物的致病性的风险。由于与植物长期共生，代谢产物施用于植株表面并不会对植物生长产生负面的影响。施用之后并不会带来残留的危害。

3、本发明得到的甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10，培养条件要求低，通过萃取可以制得有活性的粗提物，具有很好的开发应用价值。

附图说明

图1为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10在LB培养基上得单菌落图。

图2为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10的系统发育树。

图3为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10对多种丝状真菌的抑制效果图。

图4为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10对多种丝状真菌的抑制效果图。

图5为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10抑制稻瘟菌孢子萌发图。

图6为甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10对水稻稻瘟病的防治效果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10的分离、纯化、保存。

1、LB培养基的配制：

称取胰蛋白胨（Tryptone，Oxoid LTD LP0042，England）10 g，酵母提取物（Yeastextract，Oxoid LTD LP0021，England）5 g，氯化钠（NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318）10 g，加水1000 mL搅拌均匀，再加15 g琼脂，充分加热溶解后分装，121 ℃灭菌20 min后贮存备用。

2、甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10的分离、纯化：

（1）叶片采集：用于分离的甘蔗叶片是由崔国兵于2017年10月15日采自华南农业大学农学院沈万宽研究员的甘蔗种田，并且根据叶片的空间位置（上、中、下）粗略的分为新叶、成熟叶、老叶三组。

（2）叶片消毒：用灭菌的超纯水洗 3 次；用 3 % 过氧化氢浸泡 1 min；100 乙醇浸泡 1 min；6.15 % 含有吐温-20 的次氯酸浸泡 5 min；3 %过氧化氢浸泡 1 min，灭菌的超纯水洗 5 ~6 次，收集最后一次洗涤叶片的水。

（3）消毒检测：最后一次洗涤的水，涂在无抗生素的 LB 平板上，吹干封口，37 ℃保存三天，观察是否有菌落产生，如果有说明消毒不完全，需要重新采集叶片进行消毒。

（4）叶片研磨：取消毒成功的叶片 2 ~ 3 块的叶片，研磨完全，加 1 mL 灭菌的超纯水，转移到 2 mL 无菌的离心管，低速离心，取上清稀释，按照稀释倍数 10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。叶片研磨液加等体积的 60 %甘油，-80 ℃保存。

（5）菌落纯化：稀释后的叶片提取液，每个梯度涂 3 个 LB 平板，吹干，封口，28℃培养 3 ~ 5 天。根据菌落形态挑选不同的形态的菌，用 LB 液体培养基 37 ℃过夜摇菌，后在 LB 固体培养基上划线。挑取单菌落，用 LB 液体培养基 37 ℃过夜摇菌，取 1 mL菌液添加等体积的 60 %甘油，-80 冻存，待用。

（6）菌株挑选：通过平板对峙筛选对丝状真菌抑制作用、对菌丝生长具有抑制活性的菌株，筛选出抑制作用最强的菌株，标记为菌株CGB10。

3、菌株CGB10的鉴定：

（1）伯克氏菌CGB10在LB培养基上37 ℃培养22~26 h后，菌落表面及边缘光滑，菌落微黄光滑且不透明（见图1）。

（2）对菌株CGB10进行16s_rDNA测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。

通过美国国立生物技术信息中心（NCBI , National Center for BiotechnologyInformation）Blast序列别对与Burkholderia sp. FSGSA12 相似度达到 99 %，并构建了系统发育树（见图2）。

综合鉴定结果显示，菌株CGB10为伯克氏菌（Burkholderia sp.）。

以上伯克氏菌CGB10菌株于2018年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60471。保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼五楼。

实施例2：对峙培养法测定伯克氏菌CGB10的活性

1、培养基的准备：

（1）LB培养基的配制：LB培养基的制备同实施例1；LB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与LB固体培养基的配方相同，将称得的配方药剂充分溶解后分装于锥形瓶（每瓶100mL培养液），加塞、包扎，121 ℃灭菌20 min，冷却后贮存备用。

（2）胡萝卜培养基的制备：称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL，再加15 g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶（每瓶100 mL培养液），121 ℃灭菌20 min，冷却后贮存备用。

（3）PDA培养基的制备：PDA肉汤（购自鼎国昌盛），用法见其说明书。

（4）CM培养基的配制：硝酸钙（10g/100mL）10mL，盐溶液（2g磷酸二氢钾、2.5g七水合硫酸镁、1.5g氯化钠溶于100mL水）10 mL，酵母浸粉 1.0g，酪蛋白水解物0.5g，酸性酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖10g，水 980mL。（所用试剂均为市面所售）

（5）YEPSA培养基的配制：（试剂均购买自鼎国昌盛）蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉 10g/L，蔗糖 20 g/L，琼脂 4 g/L，加1000ml水混匀后121 ℃灭菌20 min，冷却后贮存备用。

2、伯克氏菌CGB10单菌落的制备：将伯克氏菌划线接种至LB培养基平板上活化24h后，挑取单菌落进行划线保存。

3、伯克氏菌CGB10平板菌悬液和粗提物的制备：

取步骤2制备得到的伯克氏菌CGB10单菌落介入步骤1中制备的LB培养液锥形瓶中，置于30 ℃，摇床速率为200 rpm下培养24 h，即可得到菌悬液；将获得的菌悬液于取200μl涂于13×13cm 的PDA平板上（共10个平板），吹干封口后置于28 ℃培养箱培养24 h，转移带有伯克氏菌的培养基到容器中，加500 mL乙酸乙酯浸泡后旋转蒸发至干，即可获得粗提物。

4、活性测定：

（1）伯克氏菌CGB10对6种丝状真菌的抑制作用测定：

将步骤2制得得伯克氏菌接种到菌饼周围，与菌饼距离约2cm左右，实验中以不接种伯克氏菌为对照，3个重复，置于28 ℃下恒温培养，当约三天后观察实验结果，结果如图3、图4所示。

（2）伯克氏菌CGB10对稻瘟菌孢子萌发的影响：

取接稻瘟菌菌饼于倒好的CM培养基平板中，28 ℃培养约一周左右，取无菌水于平板中清洗孢子制成孢子悬浮液（镜检调节孢子浓度到约每毫升10¹⁰个孢子）。按照步骤3中摇菌方法，待伯克氏菌到OD₆₀₀≈0.8时，取菌液于平板中洗孢子制成孢子悬液。孢子悬浮液均取20 μl点在疏水玻片上，28 ℃培养6 h后镜检观察孢子附着孢形成情况。

5、结果分析：

由图3、图4和图5可以看出甘蔗叶片内生伯克氏菌CGB10对六种丝状真菌的生长具有强烈的抑制作用，且造成了稻瘟病菌孢子萌发畸形（部分真菌孢子实验室条件下不能收集，故未全做验证）。

其中，菌株CGB10的发酵粗提物对稻瘟菌孢子萌发具有显著的抑制作用。

实施例3伯克氏菌对稻瘟病的防治效果

1、实验方法

LB培养基的制备同实施例1。CM、PDA培养基的制备同实施例2。

伯克氏菌CGB10平板菌悬液和粗提物的制备同实施例2。

挑选长势均一的大麦叶片及水稻叶片，取稻瘟病菌菌饼覆盖在叶片上，设置清水组与发酵粗提物组（提取过程同实施例2中步骤3操作），每组取5 μL添加到菌饼与叶片之间。28 ℃避光培养一天后转移至28 ℃光照（12 h黑暗：12 h光照）培养箱培养3天，观察发病情况并记录（如图6）。

2、结果分析：

由图6可以看出伯克氏菌CGB10发酵粗提物对稻瘟病病斑的形成具有抑制作用。大麦作为辅助验证手段，同样可以指示稻瘟病的病发情况，抑制率约为100%。从图6中看出，与清水对照比起来，CGB10粗提物在稻瘟菌的防治上作用显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种甘蔗内生伯克氏菌及其生防应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1423

<212> DNA

<213> 甘蔗内生伯克氏CGB10的16s_rDNA序列片段(CGB10 16s_rDNA)

<400> 1

tggcgcagct taacatgcag tcgaacggca gcacgggtgc ttgcacctgg tggcgagtgg 60

cgaacgggtg agtaatacat cggaacatgt cctgtagtgg gggatagccc ggcgaaagcc 120

ggattaatac gcatacgatc tacggatgaa agcgggggac cttcgggcct cgcgctatag 180

ggttggccga tggctgatta gctagttggt ggggtaaagg cccaccaagg cgacgatcag 240

tagctggtct gagaggacga ccagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300

ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagca atgccgcgtg 360

tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac ttttgtccgg aaagaaatcc tgagggctaa 420

tatccttcgg ggatgacggt accggaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc 480

gcggtaatac gtagggtgcg agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgcaggc 540

ggtttgttaa gaccgatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat tggtgactgg 600

caagctagag tatggcagag gggggtagaa ttccacgtgt agcagtgaaa tgcgtagaga 660

tgtggaggaa taccgatggc gaaggcagcc ccctgggcca atactgacgc tcatgcacga 720

aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgtcaac 780

tagttgttgg ggattcattt ccttagtaac gtagctaacg cgtgaagttg accgcctggg 840

gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggat 900

gatgtggatt aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta cccttgacat ggtcggaatc 960

ctggagagat ccgggagtgc tcgaaagaga accgatacac aggtgctgca tggctgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtccttagt 1080

tgctacgcaa gagcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatac 1140

gtcaagtcct catggccctt atgggtaggg cttcacacgt catacaatgg tcggaacaga 1200

gggtcgccaa cccgcgaggg ggagctaatc ccagaaaacc gatcgtagtc cggattgcac 1260

tctgcaactc gagtgcatga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttttaccag 1380

aagtggctag tctaaccgca aggaggacgg tcaccacgta gat 1423

Claims (8)

1.一株甘蔗内生伯克氏菌（Burkholderia sp.）CGB10，其特征在于，该菌株于2018年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60471。

2.权利要求1所述甘蔗内生伯克氏菌CGB10在抑制植物病原真菌方面的应用。

3.权利要求1所述甘蔗内生伯克氏菌CGB10在防治植物病原真菌病害方面的应用。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述植物病原真菌是指丝状真菌病害病原菌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述丝状真菌病害病原菌为希金斯炭疽菌、尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、荔枝炭疽菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗鞭黑粉菌中的一种或多种。

6.一种防治植物病原真菌病害的微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述甘蔗内生伯克氏菌CGB10。

7.根据权利要求6所述微生物制剂，其特征在于，含有所述伯克氏菌CGB10的发酵粗提物。

8.一种防治丝状真菌病害病原菌引发的植物病害的方法，其特征在于，使用权利要求6或7所述微生物制剂对植物进行处理。

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