CN112553129B - 一株贝莱斯芽孢杆菌ln9-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株贝莱斯芽孢杆菌LN9‑2及其应用，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis LN9‑2，于2020年11月06日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21110；本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌LN9‑2用于防治由粉红聚端孢引起的苹果霉心病或苹果黑点病；本发明结果表明该菌株对粉红聚端孢有较强的抑菌能力，为防治苹果霉心病和黑点病提供了良好的生物防治资源。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2及其应用。

背景技术

苹果是世界性的果品，耐储藏，供应周期长富含多种维生素和微量元素，营养丰富，深受人们的喜爱。苹果霉心病是苹果的重要病害之一，造成成熟果实霉心，心腐，储藏期果实腐烂，一些发生严重的果园发病率高达50%（胡清玉，胡同乐，王亚南，等．中国苹果病害发生与分布现状调查［J］．植物保护，2016, 42(1): 175-179），严重影响苹果的质量和产量。该病害由多种病原真菌引起，在我国引起苹果霉心病的病原真菌主要是链格孢（Alternaria spp.）、枝孢霉（Cladosporium spp.）、粉红聚端孢（Trichothecium roseum）（高玲玲. 2010. 陕西省富士苹果霉心病病原菌多样性研究. [D].西北农林科技大学），而在50%以上的心腐样品中均能分离到粉红聚端孢，并且粉红聚端孢单独存在于25%的心腐样品中（戴蓬博. 粉红聚端孢引致富士苹果心腐病的侵染特征及致病机制[D].西北农林科技大学, 2019.），该结果暗示着在引起苹果霉心病的诸多病原菌中粉红聚端孢所占比例较高。粉红聚端孢除了可以引起苹果霉心病外，还可以引起苹果的黑点病，极大地影响了苹果的品质（孟祥龙,张祺,石朝阳,王树桐,王亚南,曹克强,胡同乐.河北省苹果果实黑点病的症状与病原研究初报[J].植物病理学报:2020,1-15）。

目前，防治苹果霉心病和黑点病的主要方法是化学防治，可以使用的化学药剂有甲基硫菌灵、多菌灵、代森锰锌、吡唑醚菌酯等，生物源药剂主要为多抗霉素和中生菌素，对苹果霉心病的防效达到42.68%~73.03%（郑军庆,谢谦,卢凯洁,韩晓荣,党雷.苹果花露红期霉心病田间药效试验初报[J].中国果树,2018(06):57-59.李广旭,杨华,王家民.岳帅苹果霉心病药剂防治研究[J].北方果树,2005(02):10-11.栾梦,潘彤彤,董向丽,练森,王彩霞,李保华.套袋苹果黑点病的发病诱因、机制与条件[J].植物病理学报,2019,49(04):520-529.）。然而近年来，套袋苹果面积逐年扩大，纸袋内高温高湿有利于该病害的发生，而且多数化学药剂，例如多菌灵和代森锰锌等对苹果坐果率有显著影响（郑军庆,谢谦,卢凯洁,韩晓荣,党雷.苹果花露红期霉心病田间药效试验初报[J].中国果树,2018(06):57-59.）。

实现化学农药零增长的主要技术是生物源农药和生物制剂替代化学农药。然而，在苹果生产过程中，缺少生物制剂防治苹果霉心病和黑点病，目前只发现了枯草芽孢杆菌和深绿木霉对其有一定的效果（张文军,毛维兴,张树武,薛应钰,徐秉良.深绿木霉T2菌株对苹果霉心病的防治效果研究[J].中国果树,2018(05):11-14. 辛玉成,秦淑莲,刘希光,李彩霞,孙竹生,王元庆.几种拮抗菌株对苹果霉心病菌抑制作用的研究[J].中国果树,1999(03):3-5.）。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是2005年由Ruiz-García等新命名的，后被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，为革兰氏阳性、杆状、菌落米白色，表面褶皱，不透明，好氧，化能异养型细菌。国内已发现该菌对棉花黄萎病(大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb)、白菜黑斑病(芸薹链格孢菌Alternaria brassicae)等有拮抗作用，有研究者利用该菌作为生物制剂并用于防治植物真菌和细菌性病害。

专利号为：CN 109266586 A，专利名称为：专利贝莱斯芽孢杆菌BMF 03及其用途与发酵方法，该专利中测试了多种病原菌，包括苹果腐烂病菌和苹果炭疽病菌，而未测试对苹果霉心病菌和黑点病菌的效果，引起苹果霉心病和黑点病的病原菌为粉红聚端孢，与苹果腐烂病菌和炭疽病菌为不同属真菌。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提出一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2及其应用。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌分离于山西省吕梁市临县申王坡村保护地土样中。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。

一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis LN9-2，所述贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，于2020年11月06日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC NO.21110。

一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，将贝莱斯芽孢杆菌LN9-2用于防治由粉红聚端孢引起的苹果霉心病或苹果黑点病。

一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，对植物病原真菌的抑制用途，所述的植物病原真菌选自：苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果树腐烂病菌（Valsa mali）、苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternata）、马铃薯黑痣病菌（Rhizoctonia solani）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（F. solani）。

优选的，贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的菌种使用的培养基为LB培养基；配制原料：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，NaCl 8-12g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min。

优选的，防治苹果霉心病或苹果黑点病的防治方法是将贝莱斯芽孢杆菌LN9-2接种于LB培养基中制备得到OD₆₀₀=0.1的芽孢杆菌悬液，将所述芽孢杆菌悬液喷在苹果表面。

本发明相对于现有技术所产生的有益效果为：

与现有技术相比，本发明的贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对粉红聚端孢表现出较强的抑菌作用，可以防治由粉红聚端孢引起的苹果黑点病和苹果霉心病。本发明结果表明该菌株对粉红聚端孢有较强的抑菌能力，为防治苹果霉心病和黑点病提供了良好的生防资源，其抑菌机理有待于进一步研究，为开发新型的微生物菌剂和化学药剂奠定基础。

附图说明

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合以下附图进行说明：

图1是本发明所述贝莱斯芽孢杆菌菌株LN9-2显微镜(1000X)观察照片(A)及平板正面菌落形态；A中箭头表示芽孢杆菌，星号表示芽孢。

图2是基于本发明所述贝莱斯芽孢杆菌菌株LN9-2的串联16S rRNA、gyrB、recNf、recAf基因核酸序列构建的Neighbor-Joining联合系统发育树（采用neighbor-joining法，bootstrap 1000）。

图3是平板对峙法测试贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果霉心病菌(Trichothecium roseum)的拮抗作用；A：苹果霉心病菌；B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与苹果霉心病菌对歭培养。

图4是抑菌圈法测试贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果霉心病菌(Trichothecium roseum)的拮抗作用；A：苹果霉心病菌对照；B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2抑制苹果霉心病菌生长。

图5是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果黑点病的防治效果；A：接种粉红聚端孢；B：经贝莱斯芽孢杆菌LN9-2处理后接种粉红聚端孢。

图6是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的拮抗作用；A:苹果炭疽病菌对照，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与苹果炭疽病菌对歭培养。

图7是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的拮抗作用；A:苹果树腐烂病菌，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与苹果树腐烂病菌对歭培养。

图8是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternaria)的拮抗作用；A:苹果斑点落叶病菌对照，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2与苹果斑点落叶病菌对歭培养。

图9是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗作用；A:马铃薯黑痣病菌，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与马铃薯黑痣病菌对歭培养。

图10是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)的拮抗作用；A:马铃薯晚疫病菌对照，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与马铃薯晚疫病菌对歭培养。

图11是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的拮抗作用；A:玉米大斑病菌，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与玉米大斑病菌对歭培养。

图12是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对茄病镰刀菌(Fusarium solani)的拮抗作用；A:茄病镰刀菌对照，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与茄病镰刀菌对歭培养。

图13是贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的拮抗作用；A:尖孢镰刀菌对照，B：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2 与尖孢镰刀菌对歭培养。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基NA(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，分装后高温高压灭菌(121℃、20min)。

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，分装后高温高压灭菌(121℃、20min)。

PDA固体培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，最后定容至1000mL，分装后高温高压灭菌(121℃、20min)。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的分离、筛选与纯化

1、贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的分离和筛选

（1）贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的分离

称取山西省吕梁市临县申王坡村保护地土样，放入无菌水中，室温振荡后进行梯度稀释，取0.1ml涂布在NA培养基上。

（2）贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的筛选

将粉红聚端孢的菌饼放在PDA培养基中间，周围放置4个在NA培养基上长出的细菌。

（3）菌株的纯化与保存

采用平板划线法：将对粉红聚端孢有抑制效果的细菌在新的NA平板上进行划线，在28℃培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落摇培后加入无菌甘油保存，置于-80℃长期保存，编号为LN9-2。

实施例2：菌株LN9-2的16S rRNA、gyrB、recN、recA基因鉴定

使用细菌的16S rRNA引物L10 5’-AGTTTGATCCTGGCTC-3’和R1451 5’-AAGGACGTGATCCAGCC-3’，UP-1 5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGG NGGNAARTTY-3’和UP-2r 5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGC RTCNGTC-3’，recAf 5’-TGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG-3’和recAr 5’-TTCTTCA TAAGAATACCACGAACCGC-3’，recNf5’-CTTTTGCGATCAGAAGGTGCGTATCCG-3’和recNr 5’-GCCATTATAGAGGAACTGACGATTTC-3’，并以菌株LN9-2的基因组DNA为模板，配制25μL PCR反应体系（见表1）：

表1 Taq聚合酶链式反应体系

成分	终浓度
		2×Taq mix	1×Taq mix
正向引物	200nM
		反向引物	200nM
DNA模板	100ng
		水	补齐至25 μl

PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火25s， 72℃延伸90s，35个循环；72℃预延伸5min。PCR反应结束后，将菌株LN9-2扩增的PCR产物通过用1％琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，而后送至上海生工生物技术有限公司进行测序。

在NCBI网站上用16S rRNA、gyrB、recN、recA基因序列进行BLAST比对，确定近缘细菌菌株的分类地位。比对结果显示：菌株LN9-2与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)亲缘关系较近。使用MEGA6.0构建菌株LN9-2的联合系统发育树，LN9-2与贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)WLYS23较为相近（见图2）。

其中，16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示，gyrB基因的序列如SEQ IDNO.2，recA基因的序列如SEQ IDNO.3，recN基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3：菌株LN9-2的形态及生理生化鉴定

本发明的菌株LN9-2形态观察，发现菌株LN9-2的菌落为乳白色，不规则，边缘不光滑，表面粗糙；革兰氏染色结果呈现的结果为阳性。本发明的菌株LN9-2的生理生化测试结果显示，该表菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇。不能利用鼠李糖、柠檬酸盐、乳糖、阿拉伯糖、苦杏仁甙、蜜二糖、山梨醇、肌醇。V-P试验、脲酶试验、淀粉水解试验试验呈阳性（见表2）。

结合实施例2的系统发育树和实施例3的形态特征、生理生化的结果，最终将菌株LN9-2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)。该贝莱斯芽孢杆菌已在中国普通微生物培养物保藏中心保藏，样品名称为芽孢杆菌LN9-2，保藏编号为CGMCC NO.21110。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对粉红聚端孢的拮抗活性测定

采用平板对峙培养法：由于LN9-2对尖孢镰刀菌的拮抗效果较弱，因此以尖孢镰刀菌为实验对照。挑取活化的贝莱斯芽孢杆菌LN9-2于LB中，28℃，220rpm摇培过夜。将粉红聚端孢和尖孢镰刀菌在PDA培养基上培养3-6天后，在菌落边缘打取菌饼，而后将其接种到新的PDA培养基上，在距离菌饼2.5cm处点接种5μL摇培的贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，每个处理3个重复，对照只接种病原真菌。在25℃培养箱中进行培养，5-7天后测量拮抗菌和病原真菌的直径，而后根据拮抗系数公式进行计算。拮抗系数=（抑菌圈半径-拮抗菌半径）/拮抗菌半径（余小兰,邹立飞,邹雨坤,李光义,李晓亮,李勤奋.甜瓜枯萎病拮抗菌的筛选及鉴定[J].南方农业学报,2018,49(06):1118-1124.）。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对粉红聚端孢具有显著的抑制效果，拮抗系数为3.50±0.44，对照尖孢镰刀菌的拮抗系数为1.31±0.22（见表3、附图3）。

采用抑菌圈法：挑取活化的贝莱斯芽孢杆菌LN9-2于LB中，28℃，220rpm摇培过夜。用无菌水将粉红聚端孢和尖孢镰刀菌的孢子进行洗脱，而后配置为1×10⁵个/ml的孢子悬浮液，取1ml加入50 ml PDA培养基中，摇匀后倒入培养皿中，待其凝固后，在培养皿中间滴加10 μl LN9-2的菌悬液，每个处理3个重复，4天后测量抑菌圈的直径。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对粉红聚端孢具有显著的抑制效果，抑菌圈直径为3.2±0.16cm，对尖孢镰刀菌的抑菌圈直径为1.23±1.25cm（见表3，附图4）。

实验例5：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对由粉红聚端孢引起的苹果黑点病的防治效果

将贝莱斯芽孢杆菌LN9-2接种于LB培养基中，28℃摇培3天后，将OD₆₀₀=0.1的芽孢杆菌悬液喷在苹果表面，24h后将粉红聚端孢的孢子悬浮液（1×10⁴个/ml）喷在已经芽孢杆菌处理的苹果表面，以未接种芽孢杆菌的苹果为对照，14天后测量病斑大小。

接种粉红聚端孢的苹果在保湿14天后出现明显病斑，平均病斑直径为0.93±0.39cm，而将LN9-2喷雾在苹果表面后接种粉红聚端孢的苹果在保湿14天后只在伤口处显现较小病斑，无伤口处无病斑，平均病斑直径为0.25±0.05cm，经统计学t-test分析具有显著性差异（表4，附图5）。结果表明，LN9-2对由粉红聚端孢引起的苹果黑点病具有明显的防治效果。

因此，利用本发明提供的一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，对引起苹果霉心病和黑点病的粉红聚端孢具有较好的拮抗作用，为苹果霉心病和黑点病的生物防治提供了新资源。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对苹果炭疽病菌等真菌和马铃薯晚疫病菌的拮抗活性测定：

采用平板对峙培养法，将苹果炭疽病菌、苹果树腐烂病、苹果斑点落叶病菌、马铃薯黑痣病菌、马铃薯晚疫病菌、玉米大斑病菌、茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌分别在PDA培养基或黑麦番茄培养基上培养3-6天后，在菌落边缘打取菌饼，而后将其接种到新的PDA或黑麦番茄培养基上，在距离菌饼2.5cm处点接5μL贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，每个处理3个重复，对照只接种病原真菌。在25℃培养箱中进行培养，5-7天后测量拮抗菌和病原真菌的直径，而后根据拮抗系数公式进行计算。拮抗系数=（抑菌圈半径-拮抗菌半径）/拮抗菌半径。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌LN9-2对玉米大斑病菌、苹果斑点落叶病菌、马铃薯晚疫病菌具有显著的抑制效果，拮抗系数分别为3.91±0.22、3.43±0.32、3.39±1.50；其对苹果炭疽病菌、苹果树腐烂病菌、马铃薯黑痣病菌、茄病镰刀菌、尖孢镰刀病菌的拮抗系数分别为2.27±0.09、2.68±0.27、1.93±0.20、1.83±0.14、1.31±0.22（附图6~附图13）。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110> 山西农业大学

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2及其应用

16S rRNA

SEQ ID NO.1

GACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC GTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGATTGGGGGAAGTCGAA

gyrB

SEQ ID NO.2

TTGCTCCGATTCCTGTTCCGAGGGCCGTGATCATTGATCTGACCTCATTGTTTGAGAGAATCTTATCAAGTCTGGCTTTCTCAACGTTCATAATCTTACCGCGCAGCGGCAGAATGGCTTGGAAATGACGGTCCCGTCCCTGTTTCGCTGATCCGCCCGCAGAGTCACCCTCTACGATATACAGCTCGGAAATGCTCGGATCTTTAGAAGAACAGTCCGCCAGTTTGCCCGGCAGATTGGAAATCTCAAGCGCACTTTTGCGGCGGGTCAATTCCCGCGCTTTTTTCGCTGCCATCCGCGCTCTTGCGGCCATTAAACCTTTTTCAACGATTTTGCGGGCTGAGTCCGGATTTTCAAGAAGGAATGTTTCCAGCGCAGAAAAAAACAGCGTATCAGTGATCGTTCTCGCTTCGGAGTTGCCGAGCTTCGTTTTCGTCTGCCCTTCGAATTGCGGATCAGGGTGCTTAATTGAAATAATGGCAGTCAGCCCTTCCCTCACATCATCCCCGCTTAAATTCRGATCATTTTCTTTGARAATCCCTTTTCTTCTTGCATAGTCGTTTATAACACGGGTCAGACCGGTTTTAAATCCGGCTTCGTGCGTGCCGCCTTCGTATGTGTTGATATTATTTGTGAAAGAATAAATATTGCTTGTATAGCTGTCGTTGTATTGCAATGCAACTTCAACCGTTATGCCGTCTTTCTCGCCTTCGATATAAATCGGCTCTTCATGAACGACTTCTTTGGAACGGTTTAAGTACTCAACATAGCTTTTGATTCCGCCTTCGTAGTGGTACTCGTTTTTCCGTTCTTGTCCTTCACGTTTGTCTTCAATCGTGATGTTTACACCTTTTGTCAGGAAGGCCAATTCCCGGACACGGTTTGAAAGCAGGTCATAGTCGTATTCGGTTGTTTCTTTGAAAATTTCCGGATCCGGAACGAAGTGCGTAATCGTTCCGGTCTTATCAGTATCACCGATCACTTCAAGATCGGCCACAGGTACACCGCGCTCGTACGCCTGATAGTGGATTTTTCCGTCACGATGAACCGTAACGTCAAGAGTGGTCGACAAGG

recN

SEQ ID NO.3

CTGCGGCAGGTGTGTAATGCAGAGCACCTGTGAACCGGTCGATACTTTATGGATTTTTTCCGCGATGGCTTGGGCAACCCGCCCGCTTACACCGGTGTCCACTTCGTCAAAGATGATGGAGGTGACATCCTGCTGGGAAGAAAAAATACTCTTCATCGCCAGCATCACCCTTGAAAGCTCGCCTCCGGAAGCGACCTTTGACAGCGGTTTTAAAGGCTCACCGGTGTTTGTTGAAATTAAAAACTTCACAAGGTCAATCCCCTTTTGGGTAAGCTGCACAGGCTGCCCGTTAACAACCGGTGCTTCACTGGCTGACGGATCGGTTTTCACGAGAAATTCCGTATCAAACGTTGATTTGCCCATATACAGACTTTTTAATTCCTGATGAATCGCTTCCGCCAGTTTTTTAGCCCAAGCTTTTCTGATTTTTGATAAATTGGCGGCTTCTACGGCCACATCTTTGCCGACCGACTCCAATTCCTTCTTCAGCGCTTCAAGGTGGCTGTCGCGGTTCTCGATTTGATCGATTTCCTCTTCTATTTTGGAGCCGTATTCCAAAATGTCTTCTACCGTCGCTCCGTATTTGCGCTTCAGCTGTTTGATCTCATTTAAACGGGTTTCAATAAAATTCAGCCGTTCCGGGTCATATTCCAGATCATCTAACAGATTGCGCATCTGAAAGGTTGCATCCTCCAGCAGATAATAGGAACTTGACACACTTTCTGACAGCTTTTGCAGCGGTTCATTGATATCCGAAATATCTTCAAGCTGGGCAGAGGCCATTCCGACCCAGTCAAGCCCCCCCTGCTCGCTGCGGAGCGCATTATAGGCGTTTTGCA

recA

SEQ ID NO.4

CAAAGGTTCCATCATGAAGGCTCGGAGAAAAAACAGATACAAGAATTTCAACGGTGCCAAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAAGTATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCACGCAATCGCTGAGGTTCAGGAAAAAGGCGGACAGGCAGCATTTATTGATGCTGAGCATGCTCTTGATCCTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGTCAATATCGAAGAGCTTCTGCTTTCTCAGCCGGATACGGGAGAGCAGGCGCTTGAGATTGCTGAAGCGCTGGTGCGAAGCGGAGCTGTTGATATCGTAGTCGTTGACTCTGTTGCGGCGCTTGTTCCAAAAGCTGAAATTGAAGGTGACATGGGTGATTCACACGTCGGTTTACAGGCGCGTCTCATGTCTCAGGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGCGCCATCAATAAATCTAAAACAATTGCAATCTTTATTAACCAGATTCGTGAAAAAGTCGGCGTTATGTTCGGAAATCCGGAGACGACACCGGGCGGCCGCGCGCTGAAATTCTATTCTTCCGTGCGCCTTGAAGTGCGCCGTGCCGAGCAATTAAAGCAGGGCAACGACGTCATGGGGAATAAAACGAGAATTAAAGTCGTAAAAAACAAAGTCGCTCCTCCGTTCCGTACGGCTGAAGTGGAC

Claims (5)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，其特征在于，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LN9-2，所述贝莱斯芽孢杆菌LN9-2，于2020年11月06日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21110。

2.如权利要求1所述的一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，其特征在于，用于防治由粉红聚端孢引起的苹果霉心病或苹果黑点病。

3.根据权利要求1所述的一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，其特征在于，用于对植物病原真菌的抑制，所述的植物病原真菌选自：苹果炭疽病菌、苹果树腐烂病菌、苹果斑点落叶病菌、马铃薯黑痣病菌、马铃薯晚疫病菌、玉米大斑病菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌。

4.根据权利要求2所述的一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的菌种使用的培养基为LB培养基，配制原料：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，NaCl 8-12g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min。

5.根据权利要求4所述的一株贝莱斯芽孢杆菌LN9-2的应用，其特征在于，防治苹果霉心病或苹果黑点病的防治方法是将贝莱斯芽孢杆菌LN9-2接种于LB培养基中制备得到OD₆₀₀=0.1的芽孢杆菌悬液，将所述芽孢杆菌悬液喷在苹果表面。

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