CN104541668A - 一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及烟草漂浮育苗领域，旨在提供一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法。该方法是将用液体培养基培养的植物根内生真菌印度梨形孢的菌体和培养滤液与烟草育苗基质混匀，利用印度梨形孢的菌体及其释放在培养滤液中的物质提高烟草漂浮育苗的种子发芽率并促进烟苗生长和抗逆。本发明简便易行，用常规方法培养印度梨形孢，用标准规程混合基质、装盘、播种、漂浮育苗、炼苗和移栽，接种印度梨形孢的方式与漂浮育苗规程相配套。本发明能够使烟草种子发芽率提高；帮助烟苗根系耐受低氧胁迫，使烟苗根系发达、根干重增加；帮助根吸收营养，促进烟苗生长，使烟苗茎杆增粗、茎直径增加，使株高增加；使烟苗移栽后存活率提高。

Description

一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法

技术领域

本发明属于烟草漂浮育苗领域和微生物应用领域，具体涉及用植物根内生真菌印度梨形孢的菌体及其释放在培养滤液中的物质提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法。

背景技术

目前烟草集约化生产以育苗移栽为主，烟草集约化育苗以漂浮育苗为主。全国大部分烟区集约化育苗期的气温低，导致种子发芽时间长，发芽率低。漂浮育苗时，烟苗密度大，根系需氧量多，而育苗池中的营养液液面被聚苯乙烯格盘覆盖，液面与空气接触面小，营养液中的溶氧量小，对生长在水饱和基质中的根系供氧不足，易使烟苗根系受低氧胁迫而活力低，导致烟苗长势弱，不够健壮。漂浮成苗的烟草根系为水生根，移栽后要转化为旱生根，在转化期间对干旱敏感。而且，我国大部分烟区在烟苗移栽时正值旱季，水分供应和烟苗的抗旱能力是烟苗移栽存活和烟叶产量和品质的重要限制因素。烟苗根系发达、地上苗健壮是烟苗移栽存活的关键因素。设法提高种子发芽率，培育根系发达的壮苗，是提高烟草集约化生产效率的重要手段。

从枝菌根真菌能与80％以上的陆生植物共生，通过形成菌根帮助寄主植物吸收水分和矿质营养及抗逆。国内外的研究都发现某些从枝菌根真菌能促进烟草吸收P、K和N，提高烟苗的水分利用效率和耐旱性，降低烟草猝倒病、黑胫病和根黑腐病的发病率。但是，从枝菌根真菌是专性活体营养真菌，人工培养从枝菌根真菌需要活体植物的根或发根，不易大量培养，限制了在田间大规模应用从枝菌根真菌。而且，在常规的烟草漂浮育苗条件下，基质水分饱和，营养液养分浓度高，抑制从枝菌根真菌孢子萌发、菌体生长和侵染寄主植物，不利于形成菌根。在漂浮育苗生产中菌根化烟苗往往需要改变基质和营养液成分和漂浮育苗方式，如中国专利“烤烟菌根化漂浮育苗的营养液配方及其施用方法”(授权号CN 101213928B)，“以砂为基质菌根化烟苗的生产方法”(CN101569284B)和“利用湿润-漂浮育苗方式生产菌根烟苗的方法”(CN 102224787B)，均不利于标准化推广和大规模应用。

印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种属于担子菌(Basidiomycota)蜡壳耳目(Sebacinales)的丝状真菌，因从印度Thar沙漠分离得到且产生梨形状的厚垣孢子而得名(Verma等，1998，Mycologia 90:896-903；楼兵干等，2007，植物保护学报34:653-656)。印度梨形孢主要通过无性繁殖完成生活史，能在多种人工合成的固体培养基上和液体培养基中(如培养真菌常用的马铃薯葡萄糖培养基和植物组织培养用的MS培养基)生长。印度梨形孢能定殖于植物根的表皮和皮层细胞内和细胞间隙，寄主范围非常广泛，能定殖于苔藓类，蕨类，裸子植物和被子植物，包括禾本科、十字花科、豆科和茄科等科的重要农作物，能帮助寄主植物吸收营养和抗逆，促进植物的生长发育，提高果实和种子产量。印度梨形孢促进植物生长的机制主要是通过比根毛还细的根外菌丝帮助植物吸收P、N、S等营养元素，还能通过分泌植物生长调节物质和调节植物内源激素的水平来促进植物的生长发育。印度梨形孢帮助植物抗逆的机制涉及提高植物抗氧化能力，诱导抗逆基因表达，诱导植物产生系统抗病性等(Oelmüller等，2009，Symbiosis 49:1–17；宋凤鸣等，2011，浙江大学学报(农业与生命科学版)37:1–6；Franken，2012，Applied Microbiology and Biotechnology 96:1455–1464)。

印度梨形孢具有从枝菌根真菌与植物共生的特性，能与从枝菌根真菌不能共生的十字花科植物(如模式植物拟南芥)共生，又能用人工合成培养基培养。这些特性使得印度梨形孢成了植物内生真菌基础研究的模式生物，在大规模田间应用上有比从枝菌根真菌更广阔的前景。最近，中国发明专利申请(CN201410092267、CN201410092269、CN201410093085)公开了通过用过滤后的印度梨形孢菌丝悬浮液浇灌4叶期的烟苗，待印度梨形孢定殖后移栽烟苗，从而降低烟叶中铬、镉、铅含量的方法。

但是，迄今还没有论文报告过在漂浮育苗条件下印度梨形孢对烟草种子萌发和烟苗生长发育的作用，也没有专利申请公开过与烟草漂浮育苗规程配套的接种印度梨形孢的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前烟草漂浮育苗种子发芽率低，烟苗水生根受低氧胁迫且移栽后抗旱性弱的问题，针对从枝菌根真菌菌根化烟苗技术在大规模集约化生产上的不足，提供一种用人工培养基培养的根内生真菌印度梨形孢的菌体及其释放在培养滤液中的物质提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案如下：

提供一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法，是将用液体培养基培养的植物根内生真菌印度梨形孢的菌体和培养滤液与烟草育苗基质混匀，利用印度梨形孢的菌体及其释放在培养滤液中的物质提高烟草漂浮育苗的种子发芽率并促进烟苗生长和抗逆。

上述方法包括以下步骤：

(1)用人工液体培养基培养印度梨形孢，获得菌液；菌液包括菌体和培养滤液，菌体包括印度梨形孢菌丝和孢子；

(2)将前述菌液与烟草育苗基质(以下简称基质)混匀得到菌液基质混合物；

(3)将菌液基质混合物装入聚苯乙烯格盘后播种烟草，或者，按常规方法播种烟草后覆盖一薄层菌液基质混合物；

(4)按常规方法进行漂浮育苗、炼苗和移栽。

作为优选方案，所述步骤(1)中，所得印度梨形孢菌液中包括菌丝和孢子的菌体鲜重达到每升大于50g，孢子的数量达到每升大于1×10⁹个。

作为优选方案，所述步骤(2)中，所得菌液基质混合物中菌体重量占基质重量的0.5％–5％，培养滤液重量占基质重量的5％–20％。

作为优选方案，所述步骤(3)中，装入聚苯乙烯格盘的菌液基质混合物中菌体重量占基质重量的0.5％–2％；或者，按常规播种后覆盖的菌液基质混合物中菌体重量占基质重量的2％–5％。

本发明的实现过程可以具体描述如下：

提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法，包括以下步骤：

(1)培养印度梨形孢

用人工培养基培养印度梨形孢以获得菌液，菌液包括菌体和培养滤液，菌体包括菌丝和孢子，培养程度控制为：使每升菌液抽滤后能获得的菌体鲜重大于50g，每升菌液中孢子的数量大于1×10⁹个。

(2)混合印度梨形孢菌液与烟草育苗基质

将印度梨形孢菌液与基质混匀，所得菌液基质混合物中菌体的重量是基质重量的0.5％–5％，培养滤液的重量是基质重量的5％–20％，所得菌液基质混合物的最终含水量为30％–40％。

(3)接种印度梨形孢和播种烟草

将步骤(2)所得菌液基质混合物装入聚苯乙烯格盘，在菌液基质混合物表面播烟草包衣种子，接种菌体的重量是基质重量的0.5％–2％；或者，将没有混合菌液的基质装入聚苯乙烯格盘，在基质表面播烟草包衣种子，然后在种子和基质上覆盖一层菌液基质混合物，覆盖厚度约3mm；接种菌体的重量是基质重量的2％–5％。

(4)按常规方式进行漂浮育苗、炼苗和移栽。

本发明所述印度梨形孢(Piriformospora indica)菌株是公众可以从生物材料样品国际保藏单位购买到的生物材料，在美国American type culture collection保藏库的保藏编号是204458^TM，在德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen保藏库的保藏编号是DSM 11827。

本发明所述烟草育苗基质的配方和配制方法是公知技术，可以自行配制基质，也可以购买厂家生产的基质。

印度梨形孢是广谱的植物根内生真菌，能促进不同品种烟草的生长发育和抗逆，能在多种人工培养基中生长，能适应各种常规的烟草育苗基质。印度梨形孢培养滤液中，含有印度梨形孢产生和释放的植物生长调节物质(如生长素类物质)、诱导植物防卫和抗逆反应的激发子(如细胞壁降解物和肽类)和酶类等多种物质，能够促进烟草生长和抗逆。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的方法简便易行，用常规方法培养印度梨形孢，用标准规程混合基质、装盘、播种、漂浮育苗、炼苗和移栽，接种印度梨形孢的方式与漂浮育苗规程相配套。

2、本发明能够使烟草种子发芽率提高10％–28％；帮助烟苗根系耐受低氧胁迫，使烟苗根系发达、根干重增加25％–50％；帮助根吸收营养，促进烟苗生长，使烟苗茎杆增粗、茎直径增加5％–19％，使株高增加10％–22％；使烟苗移栽后存活率提高6％–15％。

具体实施方式

1.用人工培养基培养印度梨形孢

按常规配制马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，每升培养基含200g去皮煮烂的马铃薯和20g葡萄糖，pH为5.0–6.5，以高压蒸汽方式在121℃灭菌20分钟。取在PDA上生长的新鲜菌丝琼脂块，转入PD中培养4天，再将菌液分装到PD中扩大培养8–14天，培养温度为25℃–30℃。液体培养时，在500-ml玻璃锥形瓶中装100ml–200ml培养基，以200rpm–250rpm摇速在摇床上培养。

印度梨形孢的培养基和培养条件是可变的，可依据培养环境和设备做调整，培养程度控制为：使每升菌液抽滤后获得的菌体鲜重大于50g，每升菌液中孢子的数量大于1×10⁹个。

2.混合印度梨形孢菌液与烟草育苗基质

将印度梨形孢菌液摇匀后与烟草育苗基质混匀，所得菌液基质混合物的终含水量为30％–40％。混合前为了使菌液均一，可以用果汁机等匀浆器短时搅拌打散菌体。基质中混入菌体的重量约是基质重量的0.5％–2％，即每kg基质混入约5g–20g菌体；基质中混入培养滤液的重量是基质重量的5％–20％，即每kg基质混入50ml–200ml(约50g–200g)培养滤液。为使接种菌体的重量大于基质重量的2％，通过抽滤菌液来富集菌体，将富集的菌体在不高于基质重量20％的培养滤液中匀浆，再将匀浆后的菌液与基质混合使菌体重量达到基质重量的2％–5％。

3.接种印度梨形孢和播种烟草

接种印度梨形孢的方式有两种：

(1)菌液基质混合物装盘后播种，即将菌液基质混合物装入聚苯乙烯格盘，在菌液基质混合物表面播烟草包衣种子；接种菌体的重量是基质重量的0.5％–2％。考虑接种效应和成本，最适接种量是菌体重量是基质重量的1％，培养滤液重量是基质重量的10％。

(2)播种后覆盖菌液基质混合物，即将没有混合菌液的基质装入聚苯乙烯格盘，在基质表面播烟草包衣种子，然后在种子和基质上覆盖一层菌液基质混合物，覆盖厚度约3mm；接种菌体的重量是基质重量的2％–5％。

接种方式(2)所需菌液基质混合物的量是接种方式(1)的1/10，相应地，接种方式(2)混合菌液与基质的工作量是接种方式(1)的1/10，但在制备菌剂过程中往往要多一道抽滤富集菌体再匀浆的工序。

接种印度梨形孢的方式和剂量可以根据基质的来源和含水量来调整，使菌液基质混合物的终含水量不超过40％。具体如下：

(1)当自制基质育苗时，适合在混合几种原材料自制基质的同时混合菌液，接种没有增加工序和工作量，适合以菌液基质混合物装盘后播种的方式接种；又因自制基质的原材料含水量较低，可以直接混入占基质重量2％的菌体和20％的培养滤液，所得菌液基质混合物也适用于播种后用菌液基质混合物覆盖种子的方式接种。

(2)当用厂家生产的现成基质育苗时，混合菌液与基质会使烟草育苗多了道工序，适合以工作量小的播种后用菌液基质混合物覆盖种子的方式接种；又因新生产的基质含水量较高，混合20％的培养滤液会使菌液基质混合物含水量超过40％，就需要在制备菌液时抽滤富集菌体并在低于20％的培养滤液中匀浆，使接种菌体重量达到基质重量的2％–5％，混合物含水量不超过40％；或者，在接种前晾晒基质脱水，再混合不经抽滤的菌液使菌体重量达到基质重量的2％，混合物含水量不超过40％。

4.按常规实施漂浮育苗、炼苗和移栽。

实施例1

在实验室条件下模拟漂浮育苗，检验接种印度梨形孢菌液对烟草漂浮育苗的作用。

1.用人工培养基培养印度梨形孢

按常规配制PD和PDA，每升培养基含200g去皮煮烂的马铃薯和20g葡萄糖，pH为6.5，以高压蒸汽方式在121℃灭菌20分钟。液体培养时，在500-ml玻璃锥形瓶中装200ml培养基，以220rpm摇速在摇床上培养。取在PDA上生长的新鲜菌丝琼脂块，转入PD中培养4天，再将菌液分装到PD中扩大培养14天，培养温度为28℃，培养至每瓶菌液含菌体约15g和培养滤液约150ml。这样所得菌液中100g菌体鲜重对应1L培养滤液，含孢子的数量达到每升约2.5×10⁹个。

2.混合印度梨形孢菌液与烟草育苗基质

(1)将印度梨形孢菌液与自制的基质混合。将印度梨形孢菌液抽滤、称重后，按每10g菌体(菌丝和孢子)加100ml培养滤液在果汁机中搅拌10–15秒制成悬浮液。将草炭、珍珠岩、蛭石按重量比2:1:1混合。将每kg基质分别混入含10g菌体的悬浮液加100ml自来水和含20g菌体的悬浮液。这样，用于接种的菌液基质混合物分别含1％菌体与10％培养滤液和2％菌体与20％培养滤液，含水量约40％。不含菌液的基质仅加自来水混合使基质含水量约40％。

(2)将印度梨形孢菌液与厂家生产的基质混合。将印度梨形孢菌液抽滤、称重后，按每10g菌体加100ml培养滤液在果汁机中搅拌10–15秒制成悬浮液。将晾晒过含水量少的每kg烟草育苗基质(遵义大兴复肥有限责任公司生产)分别混入含10g菌体的悬浮液加100ml自来水和含20g菌体的悬浮液。这样，用于接种的菌液基质混合物分别含1％菌体与10％培养滤液和2％菌体与20％培养滤液，含水量约40％。不含菌液的基质仅加自来水混合使基质含水量约40％。

3.接种印度梨形孢和播种

(1)以菌液基质混合物装盘后播种的方式接种。将含1％印度梨形孢菌体与10％培养滤液的菌液基质混合物装入160孔(10列×16行)膨化聚苯乙烯格盘，用木条刮去高出格盘的部分，在菌液基质混合物表面播烤烟(毕纳1号和云烟87)包衣种子，每孔播种1粒，播种后不再覆盖菌液基质混合物，对照用不含印度梨形孢菌液的基质装盘。

(2)以播种后覆盖菌液基质混合物的方式接种。将不含印度梨形孢菌液的基质装盘，每孔播种1粒后在种子上覆盖一薄层(约3mm厚)含2％印度梨形孢菌体与20％培养滤液的菌液基质混合物，对照在种子上覆盖一薄层(约3mm厚)不含印度梨形孢菌液的基质。

4.漂浮育苗

以长方塑料敞口箱(内长60cm，宽40cm，高15cm)为实验育苗池，每池加自来水18升，水深7cm，池中溶解10g育苗专用肥。将播种的格盘放入育苗池。第一周暗培养，相对湿度75％–85％；之后以12h周期昼夜培养，昼温25℃–26℃，相对湿度55％–65％；夜温21℃–22℃，相对湿度75％–85％。

5.测量

播种后14天和21天统计发芽率。播种后35天取样测量根干重，茎直径和株高，每盘选两边和中间2行，共4行幼苗。烟苗根经自来水冲洗后剪下，每行的6–10个幼苗根并成一组，在80℃烘干至恒重后称量。用游标卡尺测茎基部直径，每株苗的茎直径是垂直方向两次测量结果的平均值。株高测茎基处至生长点的生长株高。

结果显示，以菌液基质混合物装盘后播种的方式接种和播种后覆盖菌液基质混合物的方式将印度梨形孢菌液接种在自制基质或厂家生产基质中，经漂浮育苗，相比不接种对照，接种印度梨形孢菌液使烤烟毕纳1号和云烟87包衣种子的发芽率提高10％–23％，使烟苗根干重增加25％–50％，茎直径增加5％–19％，使株高增加10％–22％。播种后覆盖基质会延迟出苗，在播种后14天的出苗率低于相应的不覆盖基质的处理，但在播种后21天两种处理的出苗率没有差异。结果表明，接种印度梨形孢菌液能促进烟草种子萌发，帮助烟苗根系耐受低氧胁迫、吸收营养，促进烟苗根系和地上苗部分生长，使烟苗根系发达、茎杆增粗、烟苗健壮。而且，接种印度梨形孢菌液对烟草育苗的促进作用不受基质来源和烟草品种的限制。

实施例2

在大棚育苗和田间小区条件下，检验接种印度梨形孢菌液对烟草育苗和移栽的作用。

1.用人工培养基培养印度梨形孢同实施例1

2.混合印度梨形孢菌液与烟草育苗基质

2014年2月11日，在贵州省毕节市大方县鸡场镇育苗场育苗棚内，将印度梨形孢菌液与烟草育苗基质(遵义联谷农业科技有限公司生产)混合。

(1)将约300g菌体和3L培养滤液的印度梨形孢培养物混合摇匀，与约30kg基质混匀，即所得菌液基质混合物含约1％菌体和10％培养滤液。

(2)将约60g菌体和600ml培养滤液的印度梨形孢培养物混合摇匀，与约3kg晾晒过含水量少的基质混匀，即所得菌液基质混合物含约2％菌体和20％培养滤液。

3.接种印度梨形孢和播种

(1)以菌液基质混合物装盘后播种的方式接种。将30kg含1％菌体和10％培养滤液的菌液基质混合物分装到24个160孔育苗盘，用80孔播种器在菌液基质混合物表面播毕纳1号包衣种，育苗盘边缘孔和中间2行孔播2粒种子，其余孔播1粒种子，每盘播种224粒。对照用不含印度梨形孢菌液的基质装盘。

(2)以播种后覆盖菌液基质混合物的方式接种。将不含印度梨形孢菌液的基质分装到48个160孔育苗盘，用80孔播种器在基质表面播毕纳1号包衣种，育苗盘边缘孔和中间2行孔播2粒种子，其余孔播1粒种子，每盘播种224粒。在24个育苗盘的种子和基质上覆盖一薄层(约3mm厚)含2％印度梨形孢菌体与20％培养滤液的菌液基质混合物，对照在种子和基质上覆盖一薄层(约3mm厚)不含印度梨形孢菌液的基质。

4.漂浮育苗

(1)将24个以菌液基质混合物装盘后播种方式接种的育苗盘和相应的24个不接种对照盘放入育苗池1，中间隔13个空盘。

(2)将24个以播种后覆盖菌液基质混合物方式接种的育苗盘和相应的24个不接种对照盘放入育苗池2，中间隔13个空盘。

按当地标准管理两个育苗池。播种后40天间苗、统计所有盘出苗率。播种后65天取样，取出每盘边缘第1行和中间第5行的烟苗，测量根干重、茎直径和株高。

5.移栽

2014年4月18日，在大方县黄泥溏镇和平组烟田进行井窖式移栽。

(1)烟田1用于移栽以菌液基质混合物装盘后播种方式接种的烟苗和对照烟苗。烟田1总面积约1.6亩，分4个小区，每个小区长24m，宽11.5m，小区间隔约0.6m。每亩移栽1100株，行距1.0-1.1米，株距0.55-0.60米。每个小区，种植6垄12行烟苗，对照和接种烟苗各半。

(2)烟田2用于移栽以播种后覆盖菌液基质混合物方式接种的烟苗和对照烟苗。烟田2总面积约1.1亩，分4个小区，每个小区长15m，宽12.5m，小区间隔约0.6m。每亩移栽1100株，行距1.0-1.1米，株距0.55-0.60米。每个小区，种植4垄8行烟苗，对照和接种烟苗各半。

按当地标准管理两个烟田，移栽后35天测烟苗存活率。

结果显示，相比不接种对照，以菌液基质混合物装盘后播种方式接种印度梨形孢菌液使毕纳1号包衣种子的发芽率提高27.9％，幼苗的根干重增加48.1％，茎直径增加8.1％，株高增加22％，移栽后存活率提高15.0％；以播种后覆盖菌液基质混合物方式接种印度梨形孢菌液使毕纳1号包衣种子的发芽率提高7.3％，幼苗的根干重增加30.0％，茎直径增加9.6％，株高增加11.5％，移栽后存活率提高6.1％。结果表明，接种印度梨形孢菌液能促进烟草种子萌发，促进烟苗根系和地上苗部分生长，使烟苗健壮，提高烟苗移栽后的存活率。

Claims (5)

1.一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法，其特征在于，是将用液体培养基培养的植物根内生真菌印度梨形孢的菌体和培养液与烟草育苗基质混匀，利用印度梨形孢的菌体及其释放在培养液中的物质提高烟草漂浮育苗的种子发芽率并促进烟苗生长和抗逆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用人工液体培养基培养印度梨形孢，获得菌液；菌液包括菌体和培养滤液，菌体包括印度梨形孢菌丝和孢子；

(2)将前述菌液与烟草育苗基质混匀得到菌液基质混合物；

(3)将菌液基质混合物装入聚苯乙烯格盘后播种烟草，或者，按常规方法播种烟草后覆盖一薄层菌液基质混合物；

(4)按常规方法进行漂浮育苗、炼苗和移栽。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所得印度梨形孢菌液中包括菌丝和孢子的菌体鲜重达到每升大于50g，孢子的数量达到每升大于1×10⁹个。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所得菌液基质混合物中菌体重量占烟草育苗基质重量的0.5％–5％，培养滤液重量占烟草育苗基质重量的5％–20％。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，装入聚苯乙烯格盘的菌液基质混合物中菌体重量占烟草育苗基质重量的0.5％–2％；或者，按常规播种后覆盖的菌液基质混合物中菌体重量占烟草育苗基质重量的2％–5％。