CN113930344B - 一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌及其应用，它涉及微生物学、植物学、土壤学领域。本发明的木霉菌为木霉属(Trichoderma sp.)MGNJ21001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2021年7月28日，保藏编号：CCTCC NO:M 2021873。它用于在盐碱胁迫条件下促进植物种子萌发、促进植物幼苗生长、提高植物幼苗耐盐生理生化以及改良盐渍土壤的应用。本发明用于植物抗逆、土壤改良、生态修复等领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学、植物学、土壤学领域，具体涉及一种抗盐碱胁迫真菌菌株选育和其应用的方法。
背景技术
松嫩平原盐碱土是世界三大苏打盐碱土集中分布区之一，盐碱化土地面积约327万hm2,占该平原面积的21％，是我国苏打盐碱化土壤的最大分布区。土地盐碱化是制约农林业发展的重要因素之一。盐渍化严重限制了植物生长，从而对作物产量造成很大影响。近年来，盐碱化程度不断加深，形成草原盐碱化，耕地盐碱化和沼泽湿地盐碱化，使盐碱化土地面积逐年增加，土地利用难度不断加大，严重影响了经济和环境的可持续发展。随着土地盐碱化形势日益加剧，土地盐碱化是制约耕地面积的主要因素之一，盐碱地的治理和有效利用对生态修复和农业生产迫在眉睫。将盐碱地改良成为可利用的后备耕地意义重大。盐碱地的治理一直是一大科学难题，传统的物理和化学治理方法虽然见效快，但是成本高、持续性不好，化学方法还容易造成二次污染。相比之下，生物治理虽然没有物理和化学方法见效快，但是成本低、效果好且持续力强，其中盐生植物与土壤微生物之间的互利作用，在盐碱地土壤改良和植被恢复方面具有巨大潜力。蒙古柳(Salix linearistipularisHao)是杨柳科、柳属植物，木本灌木或小乔木，主要分布于河畔、平原湿地及盐碱地区，喜光、耐寒、耐旱，耐水湿，具有较强的耐盐碱特性，能够影响和改善土壤的pH值，是松嫩平原盐碱地自然群落分布中唯一的木本植物，可作为松嫩平原盐碱地植被恢复的重要树种。
木霉菌在自然界中广泛分布，具有生长速率快、生命力强和适应性好等特点。研究发现木霉菌的菌丝能够适应较广的pH值范围，同时木霉菌具有很强的促生和生防效果。目前国内外对木霉菌的促生机制仍在不断地完善，将木霉菌及其菌剂应用于改良松嫩平原盐碱地的研究则更少。
发明内容
本发明从松嫩平原盐碱地木本植物蒙古柳根部筛选得到一株能提高作物耐盐碱性、促进作物生长的木霉菌株，为进一步松嫩平原盐碱地的土壤改良、生态修复以及农业开发利用具有重要意义。
本发明的一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌，该菌株为木霉属(Trichodermasp.)MGNJ21001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2021年7月28日，保藏编号：CCTCC NO:M 2021873。
本发明的木霉菌株在盐碱胁迫条件下促进植物种子萌发的应用。
进一步地，木霉菌株MGNJ21001孢子液在0.1～800mM·L-1NaCl盐胁迫和0.1～40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下促进植物种子萌发的应用。
进一步地，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8～2.2×108cfu·mL-1。
本发明的木霉菌株在盐碱胁迫条件下促进植物幼苗生长的应用。
进一步地，木霉菌株MGNJ21001孢子液在0.1～800mM·L-1NaCl盐胁迫和0.1～40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下促进植物种子萌发方面的应用。
进一步地，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8～2.2×108cfu·mL-1。
本发明的木霉菌株在盐碱胁迫条件下提高植物幼苗耐盐生理生化的应用。
所述的木霉菌株在盐碱胁迫条件下提高植物幼苗耐盐生理生化的应用是指在盐碱胁迫条件下有效提高植物幼苗地上及地下部分的生物量、叶绿素与丙二醛的含量(见表3)。
进一步地，木霉菌株MGNJ21001孢子液在0.1～800mM·L-1NaCl盐胁迫和0.1～40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下提高植物幼苗耐盐生理生化的应用。
进一步地，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8～2.2×108cfu·mL-1。
本发明的木霉菌株在改良盐渍土壤的应用。
进一步地，木霉菌株MGNJ21001孢子液在0.1～800mM·L-1NaCl盐胁迫和0.1～40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下改良盐渍土壤的应用。
进一步地，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8～2.2×108cfu·mL-1。
本发明的木霉菌株MGNJ21001制备的菌剂。
本发明取得了以下有益效果：
本发明的重度盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌，可提高作物在重度盐碱环境中的耐盐碱能力，将本发明的重度盐碱地根部内生木霉菌制成生物菌剂，接种到作物根系周围，经一定时间的盐分胁迫后，同不接种菌剂相比，可促进作物生长，提高作物的根系、叶片及植株含水量。因此，本发明的内生木霉菌可作为接种剂在重度盐碱生境中应用，为提高作物的抗盐碱能力提供了优良的菌株资源。
在盐碱胁迫下，木霉属(Trichoderma sp.)MGNJ21001可提高水稻的耐盐碱性，接种木霉属(Trichoderma sp.)MGNJ21001在NaCl和NaHCO3可提高作物生长量14％和21％，促进了水稻地上部分的生长，侧根分化等。
本发明选育的真菌可制成菌剂，用于在促进盐碱地作物生长，降低盐碱土壤pH值，增加土壤肥力，解除盐碱对作物生长抑制中。
本发明选育的真菌及其产物主要应用于植物抗逆、土壤改良、生态修复等领域。
附图说明
图1为本发明木霉MGNJ21001的形态图、菌丝图、孢子图；
图2为在100mmol·L-1-900mmol·L-1NaCl培养基，培养三天，五种木霉菌菌落直径大小图；其中，A为木霉菌一，B为木霉菌二，C为木霉菌三，D为木霉菌四，E为木霉菌五；
图3为在10mmol·L-1-90mmol·L-1NaHCO3培养基，培养三天，五种木霉菌菌落直径大小图；其中，A为木霉菌一，B为木霉菌二，C为木霉菌三，D为木霉菌四，E为木霉菌五；
图4为木霉MGNJ21001的系统进化树图；
图5为不同盐碱胁迫下，木霉MGNJ21001对水稻种子萌发的影响图；
图6为不同盐碱胁迫下，木霉MGNJ21001对水稻幼苗生长的影响图；
图7为木霉MGNJ21001对蒙古柳幼苗生长的影响图；
图8为木霉MGNJ21001对土壤pH值的影响。接种后土壤pH值明显降低图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
蒙古柳根部内生木霉菌株的分离鉴定
1.1供试材料
1.1.1供试根样
在黑龙江省松嫩平原盐碱地采集蒙古柳的根，装入聚乙烯袋中，编号，将根样带回实验室，随即进行真菌的分离，或将根样暂时保存在4℃冰箱中，随后进行分离。
1.1.2供试培养基
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，20g琼脂，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀。
孟加拉红培养基蛋白胨5g；葡萄糖10g；KH2PO4·3H2O 1g·L-1；MgSO4·7H2O0.5g·L-1；琼脂20g；1/3000孟加拉红溶液100mL；蒸馏水1000mL；氯霉素0.1g。
马丁孟加拉红培养基KH2PO4·3H2O 0.1g·L-1；MgSO4·7H2O 0.05g·L-1；0.1％孟加拉红溶液0.33mL；蒸馏水100mL；(预先灭菌，临用前加入链霉素溶液10000μ/mL)0.33mL(临用前加入)。
1.2木霉菌种的分离
用灭菌水洗掉根表面的泥土和残渣，用75％的酒精和30％的过氧化氢进行消毒，并用无菌水冲洗多次，每个培养皿中放3-4个1cm的根段，在25℃条件下，黑暗培养3-4天。分离使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、孟加拉红培养基、马丁孟加拉红培养基三种进行。当培养基上长上出明显菌丝时，采用尖端菌丝挑取法挑取，转入PDA斜面培养基，20-25℃条件下纯化培养。
1.3木霉菌株形态观察及分子鉴定
将纯化培养后的菌株接种到新的PDA培养基在28℃条件下培养至长满直径9cm平板，气生菌丝呈白色长绒毛状，菌落正面产生大量绿色分生孢子。然后经形态鉴定(见图1)和基于ITS基因片段的分子鉴定，共鉴定出五种木霉菌，分别命名为木霉菌一、木霉菌二、木霉菌三、木霉菌四和木霉菌五。
实施例2
木霉菌的耐盐碱能力
蒙古柳可在pH值8.5以上的内陆盐碱土中正常生长，因此从蒙古柳的根中分离出的木霉耐受高盐高碱环境的可能性很大。将上述实施例1筛选生长快、产孢多的五种木霉菌进行NaCl和NaHCO3耐受试验如下：
2.1耐盐碱实验：
分别向PDA培养基中加入不同浓度的NaHCO3，配成含有10mmol·L-1-90mmol·L-1的NaHCO3培养基。加入不同浓度的NaCl，配成100mmol·L-1-900mmolL-1NaCl培养基。将所选的五种木霉菌株分别转接到100mmol·L-1-900mmol·L-1NaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基、10mmol·L-1-90mmol·L-1的NaHCO3耐盐碱木霉菌选择性培养基平板中央，28℃恒温培养箱培养3d，观察菌株产孢情况并测量菌落直径。每处理重复3次，每个重复设3个平板。该实验中所有的平板完全相同(直径和厚度均相同)(见图2、3)。
试验结果
发现木霉菌五在耐盐和耐碱两方面均表现较强耐性，可耐受高达800mM·L-1NaCl盐胁迫和高达40mM·L-1NaHCO3碱胁迫，这将为盐碱地生物菌株的改良提供良好的生物材料。
通过系统进化树分析(图4)，该菌株为木霉(Trichoderma sp.)，最终命名为木霉菌株MGNJ21001，并进行菌种保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2021年7月28日，保藏编号：CCTCC NO:M 2021873。
实施例3
盐碱胁迫下木霉菌MGNJ21001对水稻种子萌发方面的应用
3.1孢子悬浮液制备：将木霉MGNJ21001菌株接种于PDA培养基上，培养5d至完全产孢，刮取孢子，用去离子水将孢子悬浮液浓度调至2×108cfu·mL-1。
3.2将灭菌滤纸放入灭菌培养皿中，用浓度为100mM·L-1NaCl溶液润湿，用2×108cfu·mL-1木霉MGNJ21001孢子液浸泡水稻种子3-4h，将处理过的种子均匀摆放在润湿的滤纸上，每个皿中20粒，每个处理重复3次，25℃培养箱中培养，统计种子第3、4、5天的萌发率。
3.3将灭菌滤纸放入灭菌培养皿中，用浓度为30mM·L-1NaHCO3溶液润湿，用2×108cfu·mL-1木霉MGNJ21001孢子液浸泡水稻种子3-4h，将处理过的种子均匀摆放在润湿的滤纸上，每个皿中20粒，每个处理重复3次，25℃培养箱中培养，统计种子第3、4、5天的萌发率(见表1)。
表1.盐碱胁迫下木霉菌MGNJ21001对水稻种子萌发的作用
结果：用2×108cfu·mL-1木霉菌MGNJ21001孢子液处理的水稻种子在100mM·L- 1NaCl胁迫下的发芽率检测结果显示，在100mM·L-1NaCl胁迫条件下，木霉菌MGNJ21001对水稻种子的发芽率有明显的影响，100mM·L-1NaCl胁迫下，木霉菌MGNJ21001显著增加水稻种子萌发率，与未用木霉菌株ST02木霉菌MGNJ21001处理的对照相比，分别增加25％；同时在30mM·L-1NaHCO3胁迫下，水稻种子的发芽率有了明显的提高，增加20％。结果表明木霉促进NaHCO3胁迫下水稻种子的萌发(见图5)。
实施例4
盐碱胁迫下木霉菌MGNJ21001对水稻幼苗的促生作用
4.1试验方法：
4.1.1育苗
将水稻种子用75％酒精和5％次氯酸钠作消毒处理，然后将种子置于铺有一层湿润滤纸的培养皿上，放在28℃条件下催芽。
4.1.2移苗
将灭过的土置于600mL的塑料盆钵中，每钵约200g土，播种水稻种子，选取长势一致的水稻幼苗移栽到含基质的盆钵中，定植7d后进行木霉孢子悬液灌根处理，每株水稻幼苗根部接种浓度为2×108cfu·mL-1的孢子悬浮液，同时浇灌含有100mM·L-1NaCl和30mM·L-1NaHCO3的处理液。
4.1.3考苗
培育21天后对水稻植株的生长情况进行测量，测定水稻幼苗的株高和鲜重、根长、叶绿素、丙二醛(见表2)。
4.2试验结果
盐碱胁迫及正常条件下，接种木霉MGNJ21001处理的水稻幼苗长势明显优于不接菌的对照处理。在盐碱胁迫下，对照处理CK的水稻幼苗叶片发黄、根系弱；而接种木霉MGNJ21001处理的生物量大、茎秆粗壮、根系发达(见图6)。
这说明盐碱胁迫下木霉MGNJ21001对水稻均具有显著的促生能力，相对于不接菌对照，接种MGNJ21001可提高作物生物量。而且木霉MGNJ21001本身筛选自盐碱地蒙古柳根部内生菌，能适应盐碱地高盐、高pH值等土壤环境，对水稻在盐碱地的种植具有实际意义。
表2.盐碱胁迫下木霉菌MGNJ21001对水稻幼苗生长的影响
实施例5
正常条件下木霉菌MGNJ21001对蒙古柳幼苗的促生作用
5.1供试材料:木霉菌MGNJ21001；两个月的蒙古柳幼苗。
5.2试验方法
5.2.1孢子悬浮液制备：(同3.1)
5.2.2育苗
将蛭石和土按质量比为3：1的比例混合置于600mL的塑料盆钵中，选取长势一致的两个月蒙古柳幼苗移栽到含基质的盆钵中，移栽7d后，进行木霉孢子悬液灌根处理，每株蒙古柳幼苗根部接种浓度为2×108cfu·mL-1的孢子悬浮液。
5.2.3考苗
培育1个月后对蒙古柳植株的生长情况进行测量，株高，鲜重，根长(见表3)。
5.2.4实验结果
接种木霉菌MGNJ21001处理的蒙古柳苗长势明显优于不接菌的对照处理。在盐胁迫下，对照处理CK的蒙古柳苗叶片发黄，茎秆细长，根系弱；而接种以木霉菌MGNJ21001的处理叶片翠绿，茎秆粗壮，根系发达(见图7)。
表3正常条件下木霉菌MGNJ21001对蒙古柳幼苗的促生作用
实施例6
木霉菌MGNJ21001对盐渍土壤的改良
6.1木霉菌MGNJ21001对土壤滤液pH值的影响
从盐碱地取不同pH值的土壤，制备土壤滤液。培养基选用PD液体培养基，用不同pH值(7.71、8.60、9.48、10.36)的盐碱土壤滤液替代原培养基配方中的水。待完全溶解后，装入150mL三角瓶中，每瓶装100mL，用氢氧化钠和盐酸调节pH值至土壤滤液原pH值(7.71、8.60、9.48、10.36)。用封口膜封好，放入高压灭菌锅中灭菌(121℃)15min。灭菌后，将木霉菌MGNJ21001接入培养基中，130rpm，28℃，培养7d，将液体菌剂过滤，用酸度计测滤液pH值。
6.2结果显示，向不同pH值的土壤滤液中接种木霉菌MGNJ21001，培养液的pH值均较培养前有不同程度的下降(如图8)。
Claims (8)
1.一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌，其特征在于，该菌株为木霉属（Trichoderma sp.）MGNJ21001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2021年7月28日，保藏编号：CCTCC NO:M 2021873。
2.如权利要求1所述的一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌株MGNJ21001的孢子液在0.1~800mM·L-1NaCl 盐胁迫和0.1~40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下促进水稻种子萌发的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8~2.2×108cfu·mL-1。
4.如权利要求1所述的一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌株MGNJ21001的孢子液在0.1~800mM·L-1NaCl 盐胁迫和0.1~40mM·L-1NaHCO3的碱胁迫条件下促进水稻和蒙古柳幼苗生长方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述木霉菌株MGNJ21001孢子液的浓度为1.8~2.2×108cfu·mL-1。
6.根据权利要求4所述的应用，提高蒙古柳幼苗地上及地下部分的生物量、叶绿素与丙二醛的含量。
7.如权利要求1所述的一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌在降低盐碱土壤pH值的应用。
8.如权利要求1所述的一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌制备的菌剂。
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