CN117551556B

CN117551556B - 一种新型解钾菌被孢霉2k4及其应用

Info

Publication number: CN117551556B
Application number: CN202310079865.0A
Authority: CN
Inventors: 金锋杰; 朱瑞
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2023-01-13
Filing date: 2023-01-13
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2043-01-13
Also published as: CN117551556A

Abstract

本发明公开了一种新型解钾菌被孢霉2K4及其应用，属于微生物技术领域。该新型解钾菌被孢霉2K4的分类命名为被孢霉Mortierellasp.2K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.3.26002，保藏日期：2022年12月13日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明被孢霉2K4不仅可以溶解难溶钾矿石，同时在植物的生长中起促进作用，可以制备微生物肥料，用于解决农林用地中钾利用效率低的问题，具有良好的应用推广价值。

Description

一种新型解钾菌被孢霉2K4及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及一种新型解钾菌被孢霉2K4及其应用。

背景技术

在氮(N)和磷(P)之后，钾(K)是植物体所需的主要营养元素之一。其以离子态或可溶性盐类被吸附在原生质表面上而存在于高等植物中，起着促进蛋白质的合成、光合作用的进行和催化重要的酶促反应等重要作用。我国土壤中92-98％的钾元素以矿物质的形式存在，不容易被植物直接吸收利用，进而影响植物的生长、产量、品质等。

目前，我国为了提高作物产量，一般也会采取施用化学肥料的方式。至2020年，中国已成为世界上最大的化肥使用国，占世界化肥使用量的35％。这不仅增加了种植成本，还极易造成环境污染问题。长期施用也会导致土壤板结，地力衰退，最终影响产量。解钾微生物在土壤中种类繁多，主要包括细菌，放线菌和真菌等。解钾细菌在数量和种类上占优势，但在解钾的能力上还是真菌更强。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型解钾菌被孢霉2K4，满足解钾和促生的使用需求。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述新型解钾菌被孢霉2K4的应用，不仅可以溶解钾矿石，同时在植物的生长中起促进作用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种新型解钾菌被孢霉2K4，其分类命名为被孢霉Mortierella sp 2K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3.26002，保藏日期：2022年12月13日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的被孢霉2K4在溶解钾矿石中的应用。

所述的被孢霉2K4在解钾中的应用。

所述的被孢霉2K4在促进植物生长中的应用。

所述的被孢霉2K4的培养液在溶解钾矿石中的应用。

所述的被孢霉2K4的培养液在解钾中的应用。

所述的被孢霉2K4的培养液在促进植物生长中的应用。

所述的被孢霉2K4在分泌有机酸中的应用。

所述的有机酸为琥珀酸。

所述的被孢霉2K4在制备微生物肥料中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本发明的新型解钾菌被孢霉2K4，在pH＝5的解钾液体培养基中，30℃，150rpm振荡培养7天，体系中的可溶性钾含量达到45.2mg/L，具有很好的解钾能力。

2)将本发明的新型解钾菌被孢霉2K4制成10⁶cfμ/mL浓度的孢子悬液，接种到玉米苗中，玉米株高增加了6.68％、地上幼苗的鲜重和干重分别增加了19.30％和10.64％，地下根的鲜重和干重分别增加了38.46％和34％；与对组组相比，苗中全钾含量增加17.9％，根中全钾含量增加42.07％；与对照组组盆栽土壤相比，处理组植株盆栽土壤的有效钾含量增加了6.6％，具有很好的促生能力。

3)本发明的新型解钾菌被孢霉2K4，不仅可以溶解难溶钾矿石，将其转化为可供作物直接吸收利用的有效钾，还可以溶磷固氮、改善作物氮磷营养，促进作物生长，改良土壤环境，可用于解决农林用地中钾利用效率低的问题，具有良好的应用推广价值。

附图说明

图1为菌株2K4分别在MEA(A/D)，PDA(B/E)，SDA(C/F)培养基上的菌落图(30℃，7天)；

图2为菌株2K4在100倍显微镜下和扫描电镜下的孢子形态图，G-J：显微镜观察，K-L：扫描电镜观察；

图3为菌株2K4的ITS+28S序列构建的系统发育树；

图4为菌株2K4在不同培养条件下的解钾能力图，不同碳源(A)、不同氮源(B)、不同初始pH值(C)、不同温度(D)和不同钾长石粉量(E)，误差条表示三个重复的标准偏差，不同小写字母表示治疗之间的显著差异(P＜0.05)；

图5为菌株2K4分泌的有机酸含量图，误差条表示三个重复的标准偏差，不同小写字母代表相同的有机酸含量在不同培养时间显著不同(P＜0.05)，不同的大写字母表示同一培养时间不同有机酸之间的显著差异(P＜0.05)；

图6为培养上清液(A)和菌丝聚集体(B)中的多糖含量图，误差条表示三个重复的标准偏差，不同小写字母表示治疗之间的显著差异(P＜0.05)；

图7为接种和未接种被孢霉(2K4)的玉米生长情况图；

图8为玉米促生试验植株苗、根的全钾数据图与盆栽土壤有效钾数据图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的被孢霉(Mortierella sp.)2K4，在下述实施例或附图中简称为菌株2K4。MEA、PDA和SDA培养基以及其他的化学试剂或仪器设备，如无特殊说明，均为常规试剂或仪器设备，均可通过商业化途径购买获得。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：被孢霉(Mortierella sp.)2K4的分离、鉴定

1、菌株的分离

采集江苏东台黄海国家森林公园人工林杨树根际土壤，加无菌水充分震荡，取悬浊液进行10^-2到10^-6的梯度稀释；取每个稀释梯度的稀释液，涂布到无机磷固体培养基上，并放到30℃的培养箱中培养；然后将长势好的菌接种到解钾固体培养基上；将能在解钾固体培养基上生长的菌株的孢子悬液，接种到解钾液体培养基中，通过测定菌液中可溶性钾的含量，筛选出效果较好的解钾真菌2K4。

解钾固体培养基配方为：蔗糖5g，磷酸氢二钠2g，硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，碳酸钙0.1g，钾长石粉1g，琼脂18g，去离子水1000mL，pH调至7.0。

解钾液体培养基配方为：蔗糖10g，磷酸氢二钠2g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，碳酸钙1g，硫酸铵1g，酵母膏0.5g，钾长石粉10g，去离子水1000mL，pH调至7.0。

2、菌株的鉴定

1)菌株2K4的菌落特征：在PDA(图1B/E)培养基上菌落呈白色花型，气生菌丝茂盛，孢子为白色；在解钾固体培养基上菌丝呈白色，气生菌丝稀疏但较长，无孢子。在培养基上30℃(温度生长范围为4～35℃，最适生长温度25～30℃)培养7天，MEA(图1A/D)培养基上菌落直径为54～56mm；PDA(图1B/E)培养基上菌落直径为60～62mm；SDA(图1C/F)培养基上菌落直径为73～76mm。

2)菌株2K4的微观形态特征(见图2)：在PDA培养基上生长3天后，挑取一些菌体制片后置于显微镜下观察。在100倍放大下可以看到菌株2K4有厚垣孢子；其分生孢子梗为无色，单支，梗上产生椭球状分生孢子。孢囊孢子(G)；菌丝体肿胀(H)；脱落的孢子囊孢子和孢子囊柄(J)；扫描电镜下的孢子囊和孢子囊杆(K-L)。比例尺：G-J，20μm；K-L，5μm。

3)ITS+28S序列分析：提取菌株2K4中的DNA并进行ITS和28S序列分析，模板引物(ITS4/ITS5和NL1/NL4)的序列如下所示：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，

NLl：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，

NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。

30μL的PCR反应体系包括模板引物各1μL、模板DNA 1μL、taq酶预混液15μL、无菌水12μL。反应条件为：在温度为94℃预变性4min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min，35个循环，4℃保存。PCR产物由擎科有限公司测序，ITS序列如SEQ ID NO.1所示，28S序列如SEQ ID NO.2所示。

将所得ITS序列在GenBank中进行BLAST相似性比对，分析发现与Linnemanniaamoeboidea相似性为97.63％，28S序列对比分析发现与Mortierella globalpin相似性为98.62％，属于被孢霉属。后运用MEGA7.0软件构建菌株的系统发育树(图3)。综合上述形态学观察及ITS+28S序列分析结果，能够确定菌株2K4是Mortierella属的新成员，将其命名为被孢霉(Mortierella sp.)2K4。

3、菌株的保藏

被孢霉(Mortierella sp.)2K4已于2022年12月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.3.26002。

实施例2：菌株2K4的解钾条件优化

1、菌株2K4的解钾能力

钾标准曲线制作：称取110℃烘干2h的氯化钾(分析纯)0.1907g，用水溶解后定容至1L，即为钾标准贮备液；分别吸取此钾标准贮备液1、2.5、5、10、20mL加入50mL容量瓶中定容，得2、5、10、20、40μg/mL钾标准系列溶液；在火焰光度计上制作钾标准曲线。

将菌株2K4接种到解钾液体培养基中，得到初始体系；30℃，150rpm振荡培养7天，得到终止体系；取50mL终止体系，6000rpm离心10min，取10mL上清液，稀释5倍后用火焰光度计测定。火焰光度计上的读数乘以5即为体系中有效钾浓度。空白对照：等体积解钾液体培养基为对照液，代替所述上清液进行上述步骤；空白对照用于调零。测得终止体系可溶性钾含量33.5mg/L。

2、培养体系中2K4解钾培养优化

1)碳源：10g/L(淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇)替代解钾液体培养基中的碳源。

将培养的菌体制成孢子悬液，接种到上述液体培养基中，30℃，150rpm振荡培养7天。结果如图4A所示，不同碳源对菌株2K4溶解K能力的影响为：葡萄糖＞蔗糖＞淀粉＞麦芽糖＞蛋白胨。当葡萄糖作为碳源时，接种菌株2K4的培养基中可溶性钾含量最高(29.18mg/L)，其次是蔗糖和淀粉；当甘露醇作为碳源时，溶解的含量最低，降至14.20mg/L。总之，葡萄糖是溶解钾的真菌2K4释放有效K的最佳碳源，但是培养上清液中的pH值与不同碳源培养条件下测得的可溶性钾浓度相反，即当葡萄糖用作碳源时，液体培养基的pH值最低。

2)氮源：1g/L((NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NaNO₃、蛋白胨)替代解钾液体培养基中的氮源。

将培养的菌体制成孢子悬液，接种到上述液体培养基中30℃，150rpm振荡培养7天。如图4B所示，与碳源相比，氮源对菌株2K4的钾溶解能力的影响更为显著，其中，最合适的氮源是蛋白胨，培养7天后菌株的可溶性钾含量达到22.94mg/L。此外，NH⁴⁺-N作为氮源的钾溶解效果显著优于NO^3--N，在本实验中，当NaNO₃作为唯一氮源时，2K4的可溶性钾浓度最低(7.1mg/L)。pH测量结果表明，除蛋白胨外，最终pH值越低，在不同氮源培养条件下液体培养基中的K释放能力越高。

3)原始pH：初始pH值(5、6、7、8、9)替代解钾液体培养基中的pH。

将培养的菌体制成孢子悬液，接种到上述液体培养基中30℃，150rpm振荡培养7天。如图4C所示，结果表明，培养上清液中的可溶性钾浓度在pH5时达到峰值(45.2mg/L)；当初始pH值调整为6时，可溶性钾含量开始显著下降；当初始pH升至9时，可溶性钾含量达到最低水平19.4mg/L，表明pH值对菌株2K4的钾溶解度有显著影响。菌株2K4更适合在酸性环境中生长，以提高土壤钾利用率。

4)温度：温度(25、30、37℃)。

将培养的菌体制成孢子悬液，接种到解钾液体培养基中分别在三种温度(25、30、37℃)下，150rpm振荡培养7天，通过测定菌液中可溶性钾的含量，筛选出最优的解钾条件。如图4D所示，结果表明，培养上清液中的可溶性钾浓度在温度为25℃时达到峰值(33.6mg/L)；当培养温度调整为30℃时，可溶性钾含量开始显著下降；当培养温度升至37℃时，可溶性钾含量达到最低水平18.2mg/L，表明培养温度对菌株2K4的钾溶解度有显著影响。

5)钾长石粉量：钾长石粉量(1、1.5、2.5、5、10g)替代解钾液体培养基中的钾长石粉。

将培养的菌体制成孢子悬液，接种到上述液体培养基中30℃，150rpm振荡培养7天。如图4E所示，结果表明，培养基中钾长石粉增加越多，其可溶性钾含量越高。

实施例3：菌株2K4的解钾机制

1、有机酸测定

有机酸标准液制作：把有机酸用超纯水稀释成梯度标准液，其中草酸、柠檬酸、乙酸浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30mg/L；酒石酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸浓度梯度为0、20、40、60、80、100mg/L；将上述有机酸分别用0.22μm尼龙过滤器过滤到液相小瓶中。

将菌株2K4在解钾液体培养基(包括钾长石粉末)中，于30℃，150rpm培养7天，离心取上清液；然后将有机酸标准液和待测液放入高效液相色谱仪(赛默飞，美国)中，色谱分离条件为：0.02moL/L磷酸缓冲液(KH₂PO₄∶甲醇＝98∶1混合)，用1moL/L磷酸将混合流动相的pH调节至2.6，流动相流速为0.5mL/min，总操作时间为15min；使用5C18-PAQ柱(4.6×250mm，5μm；日本COSMOSIL)在30℃下分离有机酸，样品体积为10μL；在210nm处记录每个信号的保留时间。

如图5所示，在整个过程中，在菌株2K4的培养上清液中检测到七种有机酸，包括草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。有机酸的分泌在第一天最高，其中琥珀酸的含量最高，其次是草酸和酒石酸，但此后继续减少；苹果酸、乳酸和乙酸在第3天显著增加，第5天开始减少；在这些有机酸中，琥珀酸分泌最多，在K溶解过程中发挥主导作用。

2、多糖测定

将菌株2K4在解钾液体培养基(含有/不含有不溶性钾长石粉末)中于30℃，150rpm培养7天，离心将菌块60℃烘干，将菌块磨碎成粉末；称取0.1g菌体粉末，加入2mL蒸馏水，超声波处理30min，离心取上清液，得到多糖样品；配制6％的苯酚，准确称取葡萄糖20mg于500mL容量瓶，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL各以蒸馏水补至2.0mL，然后加入6％苯酚1.0mL及浓硫酸5mL摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0mL水按同样显色操作为空白；取多糖样品1.0mL，加1.0mL蒸馏水，然后加入6％苯酚1.0mL，迅速加入浓硫酸5.0mL，在紫外分光光度计490nm处测取OD值；根据标准曲线，计算出浓度。

如图6所示，两组培养上清中多糖浓度无显著差异。含钾长石粉的菌丝颗粒中的多糖含量显著高于不含钾长石的菌丝颗粒，这表明菌株2K4菌丝体集合体中的多糖含量仅在暴露于钾长石粉末时显著增加。

实施例4：菌株2K4的促生作用

将菌株2K4接种到PDA培养基上，30℃，培养7天后用无菌水收集孢子，制成孢子悬液，并稀释至10⁴、10⁶、10⁸cfμ/mL浓度，以无菌水作为对照；挑选颗粒饱满的玉米(郑单958)种子，用75％的乙醇进行表面消毒，用无菌水冲洗至少6次；用湿的灭菌纱布上下两层把玉米种子夹在中间，28℃培养箱内培养，直至发芽；挑选长势一致的发芽的玉米种子用镊子轻轻夹出摆放在盛有2kg土壤的花盆中，再薄薄铺上一层土，每盆放置3粒种子，处理组及对照组均设置4次重复；种子移入花盆后一周，每天浇水，用喷壶把土壤表面喷湿，利于玉米出苗；玉米出苗后，分别接种10⁴、10⁶、10⁸cfμ/mL浓度的菌液，每株玉米苗接种3mL；此后隔20天接种一次，70天后收获，分别测量玉米的株高，苗的鲜重及干重，苗和根的全钾含量，盆栽土壤的有效钾含量。

如图7所示，接种菌株2K4的玉米的生长优于未接种溶液(CK)的玉米，接种液浓度为10⁶cfμ/mL的玉米地上部分与其他接种液的差异很小，而地下部分的生长情况优于其他处理，差异明显。

表1玉米促生试验植株生物量数据

不同处理	株高(cm)	叶鲜重(g)	叶干重(g)	根鲜重(g)	根干重(g)
						玉米(空白对照)	72.45±3.27	14.82±2.13	2.82±0.07	0.78±0.19	0.50±0.10
玉米+2K4(106cfμ/mL)	77.29±6.78	17.68±2.66	3.12±0.48	1.08±0.16	0.67±0.21
						增长率(％)	6.68	19.3	10.64	38.46	34

如表1所示，菌株2K4的施用增加了玉米株高、地上幼苗和地下根重。施用10⁶cfμ/mL菌株2K4可使玉米株高增加6.68％，地上幼苗的鲜重和干重分别增加19.30％和10.64％，表明施用菌株2K4可促进玉米幼苗地上部分的生长。此外，相同浓度的菌株2K4还分别提高了玉米地下根的鲜重和干重38.46％和34％，这有助于玉米更好地从土壤中吸收养分并进一步改善其生长。然而，在其他浓度下，例如10⁴或10⁸cfμ/mL的2K4，这些指标不如10⁶cfμ/mL的指标有效，这表明只有适当浓度的菌株2K4孢子溶液才能更有效地促进玉米株高和生物量的生长。

制作钾标准曲线：称取110℃烘干2h的氯化钾(分析纯)0.1907g，用水溶解后定容至1L，即为钾标准贮备液；分别吸取此钾标准贮备液1、2.5、5、10、20mL加入50mL容量瓶中定容，得2、5、10、20、40μg/mL钾标准系列溶液，在火焰光度计上制作钾标准曲线。

取接种10⁶cfμ/mL菌株2K4的玉米植株苗和根，65℃烘干，研磨并过0.25mm孔径筛；称取约0.2g样品置于50mL开氏瓶中(精确到0.0001g)，加浓硫酸5mL，摇匀，瓶口盖一弯颈小漏斗，在电炉上先缓缓加热，待浓硫酸分解冒大量白烟时再升高温度，消煮至溶液呈均匀的棕黑色时，取下开氏瓶，稍冷后提起弯颈漏斗，滴加30％过氧化氢3mL，并不断摇动开氏瓶，再加热(微沸)约5min，取下，稍冷后重复滴加30％过氧化氢2mL，再消煮，如此反复进行3～5次，每次添加的过氧化氢应逐次减少，消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热5～10min(以赶尽剩余的过氧化氢)，取下开氏瓶冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液流入开氏瓶中，用水定容至50mL，即为消煮液；吸取消煮好的的待测过滤液5mL置于50mL容量瓶中，用水定容，用火焰光度计测定植物样本全钾含量。植物样本全钾浓度计算公式如下：

(g/kg)＝ρ×V×D×10^-3/m

p是从标准曲线上测得的钾元素浓度(μg/mL)，V是测定液体积(mL)，D是分取倍数，即消煮液定容体积/吸取消煮液体积，m是样品质量(g)。

如图8所示，与对组植株相比，处理组植株苗和根中的全钾含量也均有增加，苗中全钾含量增加17.9％；根中全钾含量增加42.07％，且处理组与对照组在苗的全钾含量及根的全钾含量上的差异均达到显著水平；与对照组植株盆栽土壤相比，处理组植株盆栽土壤的有效钾含量也均有增加，其中土壤有效钾含量增加6.6％。

综上所述，本发明的新型解钾菌被孢霉(Mortierella sp.)2K4不仅可以溶解难溶钾矿石，同时在植物的生长中起促进作用，可以制备微生物肥料，用于解决农林用地中钾利用效率低的问题，具有良好的应用推广价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种解钾菌被孢霉2K4，其分类命名为被孢霉Mortierella sp 2K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3.26002，保藏日期：2022年12月13日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的被孢霉2K4在溶解钾矿石中的应用。

3.权利要求1所述的被孢霉2K4在解钾中的应用。

4.权利要求1所述的被孢霉2K4在促进植物生长中的应用。

5.权利要求1所述的被孢霉2K4的培养液在溶解钾矿石中的应用。

6.权利要求1所述的被孢霉2K4的培养液在解钾中的应用。

7.权利要求1所述的被孢霉2K4的培养液在促进植物生长中的应用。

8.权利要求1所述的被孢霉2K4在分泌有机酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的有机酸为琥珀酸。

10.权利要求1所述的被孢霉2K4在制备微生物肥料中的应用。