CN112961807B

CN112961807B - 一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用

Info

Publication number: CN112961807B
Application number: CN202110340307.6A
Authority: CN
Inventors: 李东; 艾爽; 陈意超; 周攀
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-01-20
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN112961807A

Abstract

本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用。具体技术方案为：一种微生物组合物，至少包括：水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)中的至少两种。本发明筛选出三种新的微生物，耐酸能力强，可在无前体物质的情况下产IAA，提供前体物质时，产IAA能力均非常优异；解磷能力优越，还具有一定的产嗜铁素的能力。将三种微生物制备为菌制剂，用于种子尤其是青稞种子的萌芽、促生根及幼苗生长上，具有显著效果。

Description

一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用

技术领域

本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用。

背景技术

青稞是禾本科大麦属的禾谷类作物，主要分布于中国西藏、青海、四川、云南等地，是当地居民的主要粮食来源之一。现有的青稞种植方法比较简单，系统化种植较弱，导致青稞的产量较低。近年来，为了追求青稞的高产，这些地区的农业生产普遍存在化肥使用超量的情况。过量的施用化肥不但不会高效提高青稞产量，反而还会导致土壤养分比例失衡、农产品品质下降，同时破坏当地生态环境。

生物菌肥是一种新型的环境友好型肥料，主要是由对植物生长起促进作用的植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria， PGPR)组成，目前针对PGPR菌肥的应用主要集中在果蔬方面，在青稞上的研究比较少见。因此，研制出高效的生物菌肥应有于青稞，对当地地区的农业发展、土壤修复具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种微生物组合物，所述微生物组合物至少包括：水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)中的至少两种。

优选的，所述微生物组合物同时包括水生拉恩菌、路德维希肠杆菌、阴沟肠杆菌。

优选的，所述水生拉恩菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21824；和 /或；所述水生拉恩菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述路德维希肠杆菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21823；和/或；所述路德维希肠杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述阴沟肠杆菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21822；和 /或；所述阴沟肠杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。

相应的，所述微生物组合物在促进植物生长、提高植物生防能力、促进种子萌发上的应用。

优选的，所述植物为青稞，所述种子为青稞种子。

优选的，水生拉恩菌、路德维希肠杆菌和阴沟肠杆菌的活菌浓度均 ≥10⁸CFU/mL。

优选的，将微生物组合物制备为菌悬液应用，所述菌悬液中，按体积比，水生拉恩菌：路德维希肠杆菌：阴沟肠杆菌＝1:1:1。

优选的，将微生物组合物制备为菌悬液，对植物种子进行浸种，或对植物进行浸根，或喷施在植物根系附近；或；将微生物组合物制备为粉剂，对植物种子进行拌种，或与其他可用于植物上的肥料混合后一并使用。

本发明具有以下有益效果：本发明筛选出三种新的微生物，耐酸能力强，可在无前体物质的情况下产IAA，提供前体物质时，产IAA能力均非常优异；解磷能力优越，还具有一定的产嗜铁素的能力。将三种微生物制备为菌制剂，用于种子尤其是青稞种子的萌芽、促生根及幼苗生长上，具有显著效果。

附图说明

图1为PD4的菌落形态图；

图2为PD4菌株的电镜扫描图；

图3为PC2的菌落形态图；

图4为PC2菌株的电镜扫描图；

图5为PB7的菌落形态图；

图6为PB7菌株的电镜扫描图；

图7为微生物组合物不同成分对青稞种子发芽率的影响示意图；

图8为微生物组合物不同成分对幼苗株高的影响示意图；

图9为微生物组合物不同成分对青稞种子根长的影响示意图；

图10为微生物组合物不同成分对青稞种子根数的影响示意图；

图11为微生物组合物不同成分对青稞种子地上鲜重的影响示意图；

图12为微生物组合物不同成分对青稞种子地上干重的影响示意图；

图13为微生物组合物不同成分对青稞种子地下鲜重的影响示意图；

图14为微生物组合物不同成分对青稞种子地下干重的影响示意图；

图15为利用不同基质中的组1种植的青稞幼苗照片；

图16为利用不同基质中的组2种植的青稞幼苗照片；

图17为利用不同基质中的组3种植的青稞幼苗照片；

图18为利用不同基质中的组4种植的青稞幼苗照片；

图19为利用不同基质中的组5种植的青稞幼苗照片；

图20为利用不同基质种植青稞后培养基质中可溶性磷及IAA含量示意图；

图21为利用不同基质种植青稞后幼苗中磷及IAA含量示意图；

图22为利用土壤种植青稞后幼苗中磷及IAA含量示意图；

图23为利用土壤种植青稞后处理组的幼苗照片；

图24为利用土壤种植青稞后阳性对照组的幼苗照片；

图25为利用土壤种植青稞后空白对照组的幼苗照片；

图26为利用土壤种植青稞后各组幼苗倒伏青稞对比照片。

具体实施方式

本发明提供了一种可促进青稞种子萌芽和生长的微生物组合物。所述微生物组合物至少包括：水生拉恩菌PD4、路德维希肠杆菌PC2、阴沟肠杆菌PB7中的至少两种，优选为同时包括三种。水生拉恩菌PD4 (Rahnella aquatilis)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.21824；路德维希肠杆菌PC2 (Enterobacter ludwigii)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.21823；阴沟肠杆菌PB7 (Enterobactercloacae)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.21822。

优选的方案为：所述微生物组合物中，水生拉恩菌PD4、路德维希肠杆菌PC2和阴沟肠杆菌PB7的活菌浓度均≥10⁸CFU/mL，三种微生物的体积比为1:1:1。

本发明还基于所述微生物组合物提供了一种促进植物种子萌芽，尤其是促进青稞种子萌芽的方法。具体方法为：将微生物组合物制备为粉剂，与待处理种子充分混合后再进行播种；或者将微生物组合物制备为菌悬液，菌悬液中各微生物的活菌量均≥10⁸CFU/mL，将待处理种子完全浸泡到菌悬液中1～24h后，取出种子进行播种。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：微生物的筛选与鉴定

全文涉及的培养基及试剂如下：

(1)LB培养基(1L)：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g，pH＝7.0。

(2)PKO固体培养基(1L)：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.003g、MnSO₄·4H₂O 0.003g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、Ca(PO₄)₂ 5g、琼脂15g，pH7.0～7.2。PKO液体培养基中不含琼脂，其余组分相同。

(3)Salkowski试剂：0.5M FeCl₃ 5g、浓H₂SO₄ 150mL，定容至250mL。

(4)钼锑抗混合显色剂：A液与B液按照体积比1：2进行混合150mL，定容至250mL。

A液：钼酸盐溶液：将①缓缓加到300mL的③中，加入②混匀。

①：溶解13g钼酸铵(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O于100mL水中；

②：溶解0.35g酒石酸氧锑钾(K(SbO)C₄H₄O₆·1/2H₂O)于100mL 水中；

③：配置体积比1：1的H₂SO₄溶液。

B液：10％抗坏血酸溶液：溶解10g抗坏血酸于100mL水中，将此贮存液保存在棕色玻璃瓶中，现配现用，颜色变黄则弃去重配。

(5)革兰氏染色用试剂：85％的生理盐水、结晶紫、卢戈氏碘液、酒精、番红试剂，均为国产分析纯试剂。

(6)全素营养液(1L)：Ca(NO₃)₂ 945mg、KNO₃ 506mg、NH₄NO₃ 80mg、 KH₂PO₄ 136mg、MgSO₄ 493mg、铁盐溶液2.5mL、微量元素5mL，pH 6.0。

(7)难溶磷营养液(1L)：Ca₃(PO₄)₂ 420mg、NH₄NO₃ 640mg、KNO₃ 708mg、MgSO₄493mg、铁盐溶液2.5mL、微量元素5mL，pH＝6.0。

(8)缺磷营养液：缺磷营养液：Ca(NO₃)₂ 945mg，KNO₃ 506mg， NH₄NO₃ 80mg，MgSO₄493mg，铁盐溶液2.5ml，微量元素5ml，pH 6.0

铁盐溶液(500mL)：FeSO₄·7H₂O 2.78g，Na₂EDTA 3.73g，把去离子水加热至沸腾后，分别加入Na₂EDTA和FeSO₄·7H₂O，搅拌溶解混合，冷却。

微量元素(1L)：KI 0.83mg、HO₃BO₃ 6.2mg、MnSO₄·H₂O 22.3mg、 ZnSO₄·7H₂O8.6mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、Na₂MoO₄0.25mg、CoCl₂ 0.025mg。

(9)有机磷卵黄固体培养基(1L)：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g， NaCl 0.3g，KCl0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.003g，MnSO₄·4H₂O 0.003g，蛋黄卵磷脂0.2g，CaCO₃ 5g，酵母膏0.4g，琼脂15g，pH 7.0～7.5。有机磷卵黄液体培养基中不含琼脂，其余组分相同。

(10)CAS检测液：将1.5mL 1mM FeCl₃溶液与7.5mL 2mM刃天青溶液混合均匀得到a液。取10mM十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液6mL 加入100mL容量瓶，将a液缓缓加入容量瓶中。取40％的二甲胺水溶液 10.8mL稀释至30mL，再加入6.25mL 12mM HCl，加入到上述容量瓶中，用双蒸水定容至100mL。

1、获得原始样本。收集来自西藏拉萨青稞、成都郊区的小麦以及禾本科的植物的根系土壤。收集方法为：小心抖落植物根系表面土壤，用灭过菌的软毛刷将紧紧附着在跟表的土壤轻轻刷入装有无菌水的试剂瓶中，为了混合均匀，瓶中装有20粒玻璃珠。随后在150r/min的摇床上震荡10min，得到土壤原液。

2、筛选解磷能力强且能合成吲哚乙酸(IAA)的微生物。将土壤原液分别稀释10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，涂布到PKO固体培养基与有机磷卵黄固体培养基上，将培养皿倒置，30℃恒温培养5～7天。随后挑取出现明显溶磷圈的菌落平板纯化，4℃斜面保藏。

将出现明显溶磷圈的菌株制备为种子液，取1mL种子液分别接种到 50mL的PKO液体培养基及有机磷卵黄液体培养基上，每个菌株三个重复，对照组接种等量无菌水。在30℃、180r/min下摇床中培养7天，在第7 天测定培养液pH值，随后将培养液10000r/min离心10min，取0.5mL 上清液超纯水稀释100倍，加入3mL钼锑抗混合显色剂，30min后测定 700nm处的OD值，在标准曲线上查到相应的磷浓度(mg/L)，即为该微生物的解磷量。

将出现明显溶磷圈的菌株接种于50mL LB液体培养基上中，30℃、 180r/min恒温震荡培养箱中培养24h，得到种子液。将种子液接种于含 L-色氨酸的LB液体培养基中(在LB培养基中添加200mg/L的L-色氨酸)，每种菌株三个重复，以不接菌的培养基作为对照。30℃、180r/min培养 5d后取200μL菌悬液滴于白色陶瓷板，同时加入等量的Salkowski显色液，室温避光条件下放置30min后观察，颜色变红即表示能够分泌 IAA，颜色越深，分泌能力越大。

将具有分泌IAA能力的菌株接种于含L-色氨酸(200mg/L)的5mL LB 液体培养基中，每种菌株三个重复，不接菌的相同培养基作为对照。 30℃、180r/min恒温震荡培养箱中培养5d。随后10000r/min离心10min，取1mL离心后的上清液，加入等量的Salkowski显色液，室温避光条件下放置30min后，测定530nm下的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA 含量(mg/L)，即为对应的IAA产量。

结果如表1所示。需要说明的是，表1中只展示了兼具解磷和产IAA 能力的微生物，并非指发明人只进行了表1的试验。表1中各菌株均用编号表示。除本发明涉及的几种微生物外，其余微生物的品种信息在本专利不再赘述。

表1各微生物的解磷能力、培养基pH及IAA合成能力展示

菌株	解磷量(mg/L)	pH	IAA合成量(mg/L)
				Si6	41.95±0.78	5.71	28.64±3.19
Si4	20.41±0.75	6.62	75.11±1.28
				PC2	221.76±3.98	3.63	188.8±4.46
Si7	49.96±1.21	5.69	40.44±0.52
				Si16	38.21±0.81	5.91	33.56±1.45
PD4	204.48±2.71	3.71	181.51±6.84
				PXA9	58.79±1.37	5.32	23.48±1.85
PB9	263.21±5.75	3.5	87±4.46
				PB7	196.97±4.91	3.74	117.49±4.69
Si9	108.73±3.34	4.25	34.24±2.94
				Si14	71.55±1.45	5.79	74.38±2.72
Si3	86.47±4.69	4.83	17.57±1.97
				Si13	29.64±2.19	6.01	54.3±0.93
Si11	64.3±1.63	5.11	53.8±0.58

3、根据表1，筛选出解磷能力强、IAA合成能力强且生长适宜环境可能近似(培养终期pH趋近)的三种微生物：PD4、PC2和PB7。将其分别接种于5mL LB液体培养基(不含IAA的前提物质L-色氨酸)中，每种菌株三个重复，不接菌的相同培养基作为对照。30℃、180r/min 恒温震荡培养箱中培养5d。随后10000r/min离心10min，取1mL离心后的上清液，加入等量的Salkowski显色液，室温避光条件下放置30min 后，测定530nm下的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA含量(mg/L)，即为对应的IAA产量。结果如表2所示。

表2各微生物不添加L-色氨酸产IAA的能力对照表

菌株	IAA合成量(mg/L)
		PC2	13.97
PD4	14.57
		PB7	20.69

4、嗜铁素在植物生长中也具有重要作用，同时测量三种微生物产嗜铁素的能力，测量方法为：将供试菌株接种于LB液体培养基，30℃ 培养24h后，取培养液上清过0.22μm滤膜除菌，再与CAS液等体积混合，充分反应后测定OD₆₃₀，得到吸光值A，以双蒸水作为对照调零。以未接种的LB培养基与CAS检测液等体积混合，测定OD₆₃₀，得吸光值Ar。 A/Ar值代表样品中嗜铁素的相对含量，嗜铁素含量测定重复3次。结果如表3所示。

表3各微生物产嗜铁素的能力对照表

菌株	分泌嗜铁素A/Ar
		PC2	0.85
PD4	0.93
		PB7	0.91

表3中，A代表样品在630nm处测定吸光值，Ar代表未接菌的空白对照的吸光值，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量，数值在0～1.0之间代表菌株具有合成嗜铁素的能力，数值越小，合成能力越强，一般合成能力较强的菌株，数值低于0.5。结果显示：三种微生物都有一定的产嗜铁素的能力。

5、鉴定PD4、PC2和PB7。

(1)将三种微生物菌接种到LB固体培养基中，30℃培养24h，PD4 的菌落形态如图1所示，电镜扫描图如图2所示；PC2的菌落形态如图 3所示，电镜扫描图如图4所示；PB7的菌落形态如图5所示，电镜扫描图如图6所示。

(2)分子生物学鉴定：利用试剂盒分别提取PD4、PC2和PB7基因组 DNA，采用细菌16S rDNA基因通用引物扩增各微生物的的16S rDNA基因片段。PD4的16S rDNA序列如SEQID NO：1所示，PC2的16S rDNA 序列如SEQ ID NO：2所示，PB7的16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。将扩增得到的PCR产物交至上海生工公司进行测序，将测序所得基因序列提交GenBank数据库，用BLAST进行序列对比分析，选用同源性高的相关序列采用MEGA6.0软件进行比对分析，用邻接法构建进化树并自行分析。结果如表4所示。菌株PC2与路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)的序列相似性达99％，并且在系统发育树上亲缘关系最近；菌株PD4与水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)的序列相似性达99％，并且在系统发育树上亲缘关系最近；菌株PB7与阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)的序列相似性达99％，并且在系统发育树上亲缘关系最近。

表4各微生物的分子生物学鉴定结果

菌株	拉丁文名	中文名
			PD4	Rahnella aquatilis	水生拉恩菌
PC2	Enterobacter ludwigii	路德维希肠杆菌
			PB7	Enterobacter cloacae	阴沟肠杆菌

(3)生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》测定。PC2、PD4 和PB7的最适生长温度均为30℃，且三株细菌均属于革兰氏阴性菌，其余鉴定结果如表5所示，其中“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。

表5各微生物的生理生化鉴定结果

菌株

接触酶

葡萄糖发酵

甲基红

V-P测定

淀粉水解

明胶液化

PD4

+

-

+

-

+

PC2

-

+

-

+

-

+

PB7

+

-

+

-

+

将上述三种微生物进行微生物保藏：水生拉恩菌PD4(Rahnella aquatilis)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21824；路德维希肠杆菌 PC2(Enterobacter ludwigii)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21823；阴沟肠杆菌PB7(Enterobacter cloacae)，于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21822。

实施例二：微生物组合方式对青稞种子萌芽的影响

1、将经过筛选得到PD4、PC2和PB7，分别接种于50mL LB液体培养基内，在30℃，180r/min恒温震荡培养箱中培养48h，将培养好的菌液分别稀释至菌体浓度为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹CFU/mL，按照表6的组合方式进行组合。组合方式及体积比指：将具有相同活菌浓度的PD4、PC2 和PB7的种子液按对应的体积比混匀，制备获得微生物组合物。活菌浓度单位均为CFU/mL。需要说明的是，发明人做了非常多的组合试验，表 6只展示了其中具有代表性的一部分。

表6各组的微生物组合方式

2、挑选大小一致、颗粒饱满的干燥青稞种子(取自西藏省山南市，于2019年10月收获)，先用75％的酒精处理5min，无菌水冲洗，反复重复2～3次，得到无菌种子。将无菌青稞种子完全浸入表6各组稀释后的菌悬液中，浸泡2h，随后取出种子，放置在湿润的灭菌滤纸上，在 25℃，湿度为90％的培养箱中培养7天。培养结束后测定各处理种子发芽率、茎长、根长、根数、鲜重以及干重。每组设置30粒种子，设置浸泡清水的组别为空白对照组，记为CK。结果如表7所示。

表7各组微生物组合促种子萌芽结果展示。

根据表7可以看出：活菌浓度为10⁸CFU/mL效果最好，浓度过低，效果不理想，浓度过高，反而会抑制青稞的根长以及根数。低浓度菌悬液一定程度上增加了青稞的地上鲜重和地下鲜重，高浓度的菌悬液对青稞的生长起明显的抑制作用。另外，高浓度菌悬液抑制了种子的萌发生长，导致种子内部的营养无法被很好地利用，所以高浓度菌悬液组的干重明显相对更高，干重数据也证明高浓度菌悬液确实会抑制青稞种子的萌发和生长。另外，微生物组合物对青稞种子的处理明显优于单一菌剂处理，按1:1:1组合的微生物组合物效果最佳。

实施例三：微生物组合物不同成分对青稞种子萌芽的影响

1、按实施例二组33的方式制备微生物组合物悬液(三者比例为 1:1:1，活菌浓度为10⁸CFU/mL)。离心后，获得离心上清液、菌体沉淀、菌体破碎液。同时以清水作为空白对照组，以新制、未接种微生物的灭菌LB液体培养基作为阳性对照组。

每组30颗种子，将青稞种子分别完全浸入上述各组中2h，随后取出种子，放置在湿润的灭菌滤纸上，在25℃，湿度为90％的培养箱中培养7天。培养结束后分别测定各处理种子发芽率、幼苗茎长、根长、根数、鲜重以及干重。发芽率如图7所示，幼苗株高如图8所示，根长如图9所示，根数如图10所示，地上鲜重如图11所示，地上干重如图12 所示，地下鲜重如图13所示，地下干重如图14所示。

结果显示：离心上清液的促生效果最好，说明主要是细胞分泌物起到了促生作用。

实施例四：促进青稞幼苗生长效果展示

1、按实施例二组33制备微生物组合物悬液(三者比例为1:1:1，活菌浓度均为10⁸CFU/mL)。将灭菌的青稞种子完全浸泡于悬液中浸泡 2h，放置湿润的滤纸上催芽。一周后选取长势一致的幼苗进行播种：分别放置在含有石英砂的塑料杯中。石英砂150g/杯，试验共设置五组处理，分别为：组1：复合菌剂+难溶磷营养液；组2：灭菌LB液体培养基+难溶磷营养液；组3：难溶磷营养液；组4：缺磷营养液；组5：全素营养液。每组营养液初次使用总量为50mL，组1中，复合菌剂为5mL；组2中，灭菌LB液体培养基为5mL。将各组营养液与培养基质混合均匀后装入塑料杯，每杯培养4株植物，每个试验组3个平行，每三天补充一次营养液，补充的营养液为各组对应实际，单次添加量为50mL。

2、25天后测量青稞幼苗茎高、根长、根数、幼苗鲜重以及干重，同时测定培养基质与青稞幼苗中P与IAA的含量。组1的幼苗照片如图 15所示，组2的各组幼苗照片如图16所示，组3幼苗照片如图17所示，组4幼苗照片如图18所示，组5幼苗照片如图19所示。处理培养基质中的可溶性磷含量及IAA含量结果如图20所示，各组处理的青稞幼苗中磷含量及IAA含量结果如图21所示；其余结果如表8所示。

表8各组幼苗生长情况对照表

根据图20可以看出：添加复合菌剂处理(组1)与全素营养液处理 (组5)的可溶磷含量相差不多，说明添加菌剂能够达到溶解难溶磷的效果，并且溶解量与全素营养液中磷含量处于相同水平。而难溶磷处理 (组3)与添加灭菌培养基处理(组2)的可溶性磷含量均低于复合菌剂处理组(组1)，说明植物本身在面对磷胁迫条件能够通过自身调节溶解一部分难溶磷，但是与添加菌剂处理组相比效果不好。缺磷处理组的磷含量几乎测量不到，且青稞幼苗生长效果最差，这也证明了磷是植物的生长中必不可少的元素之一。添加菌剂处理组(组1)的IAA含量最多，其他处理组虽然也能检测到IAA含量，但是含量较低，这也表明菌剂在不添加L-色氨酸的条件下也能够分泌IAA促进植物生长。同时，当面对磷胁迫时，植物自身分泌的IAA含量也会受到限制。

根据表8可以看出：组1的生物量略高于全素营养液处理组，这表明复合菌剂的添加确实能在一定程度上促进青稞幼苗的生长，与难溶磷处理组(组3)和添加灭菌培养基处理组(组2)相比，促生效果特别明显，也从侧面说明灭菌培养基对青稞幼苗的生长影响不大，主要是菌剂的分泌物发挥了促进幼苗生长的作用。缺磷处理组(组4)是所有处理生长效果最差的，也再次证明了磷在植物生长的重要性。

根据图21可以看出：添加菌剂处理组(组1)无论是磷含量还是 IAA含量均与全素处理组(组5)差不多，而难溶磷处理组(组3)与添加灭菌培养基处理组(组2)的磷含量及IAA含量明显低于菌剂处理组 (组1)与全素处理组(组5)，这表明在磷胁迫条件下添加复合菌剂，能够完全达到全素培养的效果甚至更好。

实施例五：盆栽实验展示微生物复合物促进青稞幼苗生长的效果

1、实施例四证明了在确定基质的情况下，本发明提供的微生物组合物确实对青稞幼苗的生长有很好的促进作用。考虑到实践中土壤环境的复杂性，及青稞实际种植的环境。本实施例采用盆栽实验进一步验证微生物复合物的有效性。盆栽用土来自西藏省山南市。土壤的各项理化性质如表9所示。

表9盆栽用土的各项理化性质测定方法及数据

测定指标	测定方法/设备	测定数据
			pH	pH测定仪	7.33
电导率(EC25)	电导仪	323dS/m
			全磷	HClO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>法	1.11g/kg
速效磷	0.5mol/L NaHCO<sub>3</sub>浸提-钼锑抗比色法	6.52mg/kg
			全钾	火焰光度法	31.73g/kg
速效钾	火焰光度法	113.33mg/kg
			全氮	半微量开氏法	12.90g/kg
碱解氮	碱解扩散法	112mg/kg
			有机质	重铬酸钾容量法-热稀释法	1.79/kg

根据表9，山南市土壤的全氮、全磷、全钾元素处于中等偏上水平，速效钾与碱解氮处于中等水平，而速效磷含量偏低，这表明土壤中存在大量很难被植物直接吸收利用的难溶性磷。

2、取青稞种子放置清水中浸泡24h，挑取大小一致的发芽种子移入装有土壤的盆栽中，共设置一组处理组及两组对照组(阳性对照组和空白对照组)，每组(每盆)5个平行，每盆中播种五粒种子。将盆栽放置在人工气候培养室中培养，温度为25℃，湿度为45％，每日光照时间为12h。待青稞发芽破土后(播种后一周左右)，向处理组添加菌体浓度为10⁸CFU/mL的复合菌剂5mL(实施例二组33)，阳性对照组添加等量的灭菌培养基，空白对照组不添加任何物质。三组均每三天加一次水，其余处理完全相同。2个月后，测量青稞幼苗茎高、根长、根数、幼苗鲜重以及干重，同时测定青稞幼苗中磷与IAA的含量。

幼苗中的磷与IAA含量结果如图22所示，其余结果如表10所示。

表10各组幼苗生长情况对照表

经两个月培养后，处理组幼苗生长照片如图23所示，阳性对照组幼苗生长照片如图24所示，空白对照组幼苗生长照片如图25所示。可以看出，添加菌剂处理组的生长效果好于对照组。而且，添加菌剂处理组的青稞幼苗茎杆直立生长，而另外两组均出现倒伏现象。不同处理组之间的倒伏情况对比如图26所示(图26从左到右依次为：空白对照、阳性对照、处理组)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种微生物组合物及在促进青稞种子发芽和生长上的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1084

<212> DNA

<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)

<400> 1

gtcgagcggc agcggaaagt agcttgctac tttgccggcg agcggcggac gggtgagtaa 60

tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 120

gacctcgaaa gagcaaagtg ggggatcttc ggacctcacg ccatcggatg tgcccagatg 180

ggattagcta gtaggtgagg taatggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga 240

ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 360

tagggttgta aagcactttc agcgaggagg aaggcatcac acttaatacg tgtggtgatt 420

gacgttactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 480

ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca 540

gatgtgaaat ccccgcgctt aacgtgggaa ctgcatttga aactggcaag ctagagtctt 600

gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 660

ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc tgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc 780

cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 840

aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900

tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca cggaattcgc cagagatggc 960

ttagtgcctt cgggaaccgt gaaacaagtg ctgcatggct gtcgtcagct cgggttggaa 1020

atgttgggta agtcccgaac gagggaaccc ttatccttgt tgccacccga atgggggaac 1080

ccaa 1084

<210> 2

<211> 1010

<212> DNA

<213> 路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)

<400> 2

gtcgaacggt agcacagaga gcttgctctc gggtgacgag tggcggacgg gtgagtaatg 60

tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa cggtagctaa taccgcataa 120

cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc atcagatgtg cccagatggg 180

attagctagt aggtggggta acggctcacc taggcgacga tccctagctg gtctgagagg 240

atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300

aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg cgtgtatgaa gaaggccttc 360

gggttgtaaa gtactttcag cggggaggaa ggtgttgtgg ttaataaccg cagcaattga 420

cgttacccgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 480

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc aggcggtctg tcaagtcgga 540

tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcgaaa ctggcaggct agagtcttgt 600

agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccgg 660

tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgacttggag gttgtgccct 780

tgaggcgtgg cttccggagc taacgcgtta agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaactttcca gagatggatt 960

ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1010

<210> 3

<211> 1010

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)

<400> 3

gtcgaacggt agcacagaga gcttgctctc gggtgacgag tggcggacgg gtgagtaatg 60

tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa cggtagctaa taccgcataa 120

cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc atcagatgtg cccagatggg 180

attagctagt aggtggggta acggctcacc taggcgacga tccctagctg gtctgagagg 240

atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300

aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg cgtgtatgaa gaaggccttc 360

gggttgtaaa gtactttcag cggggaggaa ggtgttgtgg ttaataaccg cagcaattga 420

cgttacccgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 480

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc aggcggtctg tcaagtcgga 540

tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcgaaa ctggcaggct agagtcttgt 600

agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccgg 660

tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgacttggag gttgtgccct 780

tgaggcgtgg cttccggagc taacgcgtta agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaactttcca gagatggatt 960

ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1010

Claims

1.一种微生物组合物，其特征在于：所述微生物组合物同时包括：水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）；

所述阴沟肠杆菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21822；所述阴沟肠杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。

2. 根据权利要求1所述的微生物组合物，其特征在于：所述水生拉恩菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21824；所述水生拉恩菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3. 根据权利要求1所述的微生物组合物，其特征在于：所述路德维希肠杆菌于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.21823；所述路德维希肠杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1～3任意一项所述微生物组合物在促进植物生长、提高植物生防能力、促进种子萌发上的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述植物为青稞，所述种子为青稞种子。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：水生拉恩菌、路德维希肠杆菌和阴沟肠杆菌的活菌浓度均≥10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：将微生物组合物制备为菌悬液应用，所述菌悬液中，按体积比，水生拉恩菌：路德维希肠杆菌：阴沟肠杆菌=1:1:1。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于：将微生物组合物制备为菌悬液，对植物种子进行浸种，或对植物进行浸根，或喷施在植物根系附近；或；将微生物组合物制备为粉剂，对植物种子进行拌种，或与其他可用于植物上的肥料混合后一并使用。