CN113073067A - 一种假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种假单胞菌及其应用，一种假单胞菌，其分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为：CGMCC No.16020，保藏日期为2018年7月9日。具体应用为：（1）将改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁的假单胞菌的试管种接种于PS液体培养基中，振荡速度为180‑240r/min，培养温度为25~30℃，培养至对数期，得到菌液，即为应用于作物缺铁的假单胞菌。若要制作固体平板则再往配方中加入琼脂粉13.60g/L。本发明，培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种假单胞菌及其应用，尤其涉及一种假单胞菌及其在改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
铁是植物生长必需的营养元素之一，它涉及植物叶绿素的合成、呼吸作用和氧化还原反应等生理过程，此外，铁还是多种酶反应的关键因素，控制着生命的进程。地壳中储藏着丰富的铁元素，但这些铁元素大多以难以被植物吸收利用的形态存在着，这种情况在石灰性土壤中尤其明显，高pH条件下，绝大部分铁元素被氧化固定，溶解性和流动性都极差，很难被植物根系吸收。此外，铁还会影响作物对氮和磷的吸收，从而影响作物品质。
据报道，地球上大约40%的土壤中有效铁含量较低，这些土壤容易导致植物出现缺铁症状，降低作物的产量和品质。除此之外，铁也是人类生存所必需的元素，植物缺铁，会减少人类吸收铁的来源，人类对铁的摄入量不够标准，就会引发缺铁性贫血，还会降低人体免疫力。目前，我国市场上销售的铁肥仍以价格低廉的无机铁肥为主，因其性质不稳定而导致效率低成本高。一些土壤微生物可分泌嗜铁素，螯合土壤中难溶性铁并将其转化植物可利用态，从而有效解决石灰性土壤上作物缺铁的难题，同时可降低铁肥进口费用。因此，从自然环境中筛选得到能够产嗜铁素的有效菌种具有较高的应用价值。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于针对上述问题，提供一种假单胞菌及其应用。
本发明的第一目的在于提供一种能够高产嗜铁素的假单胞菌。本发明的第二目的在于提供一种假单胞菌在改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用。
为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为：一种假单胞菌，其分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为：CGMCC No.16020，保藏日期为2018年6月29日。
为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为：所述假单胞菌在缓解农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用。
具体应用为：
（1）将改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁的假单胞菌的试管种接种于PS液体培养基中，振荡速度为180-240r/min，培养温度为25~30℃，培养至对数期，得到菌液，即为应用于作物缺铁的假单胞菌。
更进一步的，所述步骤（1）中PS培养基的配方为：蛋白胨20.00g/L、氯化镁（MgCl2.6H2O）2.99g/L、硫酸钾10.00g/L、三氯森0.025g/L、丙酮酸钠0.30g/L、甘油20.00mL/L。若要制作固体平板则再往配方中加入琼脂粉13.60g/L。
本发明中所述的假单胞菌的生理活性特征如下：
所述假单胞菌主要生物学特性为G-，无鞭毛，卵圆形，PS培养基上菌落成圆形，表面粗糙，边缘呈锯齿状，干燥，半透明。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
（1）本发明公开的一种假单胞菌具有分泌能与Fe3+特异性螯合的嗜铁素的能力，能在环境中可溶性铁浓度较低的情况下，分泌嗜铁素活化土壤中的铁，促进植物对铁的吸收。嗜铁素可以高效地与难溶性Fe3+螯合，使土壤中难溶性铁转变成可悲植物根系吸收利用的可溶性铁，从而为植物提供铁素营养，这一过程不受pH影响，能有效解决植物缺铁，尤其是石灰性土壤上植物缺铁问题。该菌种可一定程度上降低植物病害风险，减少农药化肥的使用，保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求，并可一定程度上改善土壤条件，对于维护生态环境，保护人类健康，提高农产品的品质与产量具有重要的意义。
（2）假单胞菌培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
具体实施方式
下面结合实验例详细阐述本发明假单胞菌的应用。
假单胞菌的筛选、分离和鉴定：
（1）取从有效铁含量较低的区域得到的新鲜土样1.0g，加入30.0ml纯水，混匀。取上面得到的土壤悬浊液1.0mL，加入9.0mL无菌水中，配成10-1的菌液，再吸取1.0mL配好的10-1的菌液加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10-2的菌液，以此类推，对菌液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1mL涂布于PS固体培养基（培养基配方为：蛋白胨20.00g/L、氯化镁（MgCl2.6H2O）2.99g/L、硫酸钾10.00g/L、三氯森0.025g/L、丙酮酸钠0.30g/L、琼脂粉13.60g/L、甘油 20.00mL/L）上，28℃培养2天。
（2）2天后从培养基上挑取单菌落，平板划线，并对原平板进行鉴定。以60mL为例，在烧杯中加入54ml 去离子水，然后准确称量1.814g PIPES（哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸））和0.54g琼脂，逐个加入其中，尽量搅拌均匀，接下来使用氢氧化钠和盐酸将培养基的pH调节为6.8。加热培养基直至沸腾，使其中的琼脂完全溶解。放置冷却，待温度降至约50℃，将6mLCAS检测溶液加入其中，搅拌均匀，此时溶液应呈蓝色或绿色。将配置好的检测培养基慢慢倾倒在已经生长2~3天的菌株之上，没过菌株即可。
CAS检测溶液制作方法为：
Fe（Ⅲ）溶液：准确称取0.027g FeCl3. 6H2O溶于100ml浓度为10mM的 HCl溶液中，溶解后溶液呈无色。
CAS溶液：在烧杯中将60.5mg铬天青溶解于50ml去离子水，完全溶解后溶液将呈橙色或红色。
HDTMA溶液：准确称取72.9mg HDTMA置于烧杯中，再加入40ml 去离子水，待固体完全溶解，溶液呈无色。
CAS检测溶液（100ml）：首先在50ml CAS溶液中缓慢加入10ml Fe（Ⅲ）溶液，等溶液均匀混合后会呈现深红色或紫色。接下来将CAS-Fe（Ⅲ）溶液缓慢加入到40ml HDTMA溶液中。混合均匀后溶液将呈现深紫色或蓝色。然后将溶液放入高压灭菌锅于121℃条件下灭菌20min。制作完成后的CAS检测溶液，可以在室温下长期保存。
（3）将倒入检测培养基的菌株静置2~3天，检测培养基本身为蓝绿色，该菌株周围出现明显橘黄色光晕，说明该菌株具有分泌嗜铁素的能力。经鉴定该菌株为假单胞菌属，命名为：假单胞菌Pseudomonas sp.。
假单胞菌属缓解作物缺铁中的应用：
实施例1：
（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL PS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl2 2.99g，K2SO410.00g，三氯森0.025g，丙酮酸钠0.30g，甘油 20.00mL，pH7.0；
（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl2 0.299%，K2SO4 1%，三氯森0.0025%，丙酮酸钠 0.030%、甘油 2%，pH值7.2。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180r/min，无菌空气通入量为1:0.6；
（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180r/min，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于缓解作物缺铁中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例2：
（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL PS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl2 2.99g，K2SO410.00g，三氯森0.025g，丙酮酸钠0.30g，甘油 20.00mL，pH7.0；
（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl2 0.299%，K2SO4 1%，三氯森0.0025%，丙酮酸钠 0.030%、甘油 2%，pH值7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至35℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为240r/min，无菌空气通入量为1:1.2；
（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为240r/min，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于缓解作物缺铁中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例3：
（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mLPS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl2 2.99g，K2SO410.00g，三氯森0.025g，丙酮酸钠0.30g，甘油 20.00mL，pH7.0；
（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl2 0.299%，K2SO4 1%，三氯森0.0025%，丙酮酸钠 0.030%、甘油 2%，pH值7.4。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220r/min，无菌空气通入量为1:0.9；
（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在33℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.9，搅拌速度为220r/min，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于农用土壤尤其是石灰性土壤上缓解作物缺铁的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
核苷酸序列
<110>扬州大学
<120>一种产嗜铁素的假单胞菌及其应用
<160>1
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>1501
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
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序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccgca 1440
agggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggttagccg 1500
t 1501
Claims (6)
1.一种假单胞菌，其分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC No.16020，保藏日期为2018年6月29日。
2.权利要求1所述的假单胞菌在改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用以下生产流程得到应用于改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁的假单胞菌：
将改善农业土壤上作物缺铁的假单胞菌的试管种接种于PS液体培养基中，振荡速度为180-240r/min，培养温度为25~30℃，培养至对数期，得到菌液，即为应用于作物缺铁的假单胞菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改善农业土壤为石灰性土壤。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PS液体培养基的配方为：蛋白胨20.00g/L、氯化镁2.99g/L、硫酸钾10.00g/L、三氯森0.025g/L、丙酮酸钠0.30g/L、甘油20.00mL/L。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：若要制作固体平板则再往配方中加入琼脂粉13.60g/L。
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