CN104017759A - 一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株与应用，菌株编号为PA94，分类名称为Pseudomonas aeruginosa，保藏编号：CGMCCNo.9180，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明采集蓟运河的土壤样品，在MMSA-CAS平板上共筛选到15株产嗜铁素的菌株。在MMSA培养基中，培养PA94菌株24h，测得嗜铁素活性单位SU＝63.54％，As/Ar＝0.36，产嗜铁素的能力为++++。产生的嗜铁素为氧肟酸型和柠檬酸型的混合型，对致病菌和真菌具有拮抗作用，嗜铁素可以用于蔬菜种植中疾病的防控，并能够促进植物的生长。

Description

一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株与应用。

背景技术

铁对大多数微生物的正常生长至关重要，一般需要0.4-1.0μM铁来维持自身的正常生长，虽然铁在地球上的含量很高，但多以不溶的形式存在，生物有效性极低。在这样一种胁迫作用下，微生物进化出多条途径来获得所必须的铁元素。嗜铁素介导的铁元素摄入是微生物获取铁元素的最普遍方式，许多微生物甚至合成和分泌超出自身细胞干重的嗜铁素，来满足铁元素的营养需求。

嗜铁素广泛存在于细菌、真菌和植物体内，是一种相对低分子量(500-1000D)的铁螯合物质，是在铁缺乏的情况下合成的，对三价铁有较强的亲和力，通过降低环境pH值来增加铁的溶解性，还原三价铁为生物利用性更高的亚铁形式帮助微生物从环境中获取必需的铁元素。至今研究者已经鉴定出至少500种不同的嗜铁素，虽然嗜铁素在整体结构上差别很大，但是按与Fe³⁺结合的功能基团的不同将嗜铁素分为3种：异羟肟酸型(hydroxamate)嗜铁素、儿茶酚型(catecholate)嗜铁素和羟基羧酸型(hydroxycarboxylate)嗜铁素。从产生嗜铁素微生物的不同将嗜铁素分为2种：由细菌产生的嗜铁素和由真菌产生的嗜铁素两大类。

假单胞菌在土壤环境中分布广泛，种类繁多，能够产生不同结构的嗜铁素。铜绿假单胞菌螯铁蛋白(Pyochelin)和脓青素(pyoverdine)是假单胞菌产生的最主要的两类嗜铁素，其中铜绿假单胞菌螯铁蛋白与Fe³⁺的螯合能力小于脓青素的螯合能力。嗜铁素不仅能够为细菌自身提供铁元素，也能够为其它生物提供铁营养，但是假单胞菌属细菌合成的脓青素嗜铁素，却不能被本属外的其它生物利用，而且假单胞菌产生的嗜铁素的高效螯铁能力，使其产生菌与同一环境中的其它微生物在对铁素营养的竞争中占据优势，这是利用土壤有益微生物防治土传病害的作用机理之一。

嗜铁素制剂的使用，既可避免大量使用杀虫剂和杀菌剂，减少病原菌和害虫产生抗药性及化学试剂难降解对环境的危害，同时又能为植物的生长提供铁营养元素。因此假单胞菌属细菌相比其它微生物在对铁素营养的竞争上具有很大优势，使该属细菌在生物防治领域具有诱人的潜力和前景。

发明内容

本发明的目的在于一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株与应用，本发明从环境中样品中分离到能高产嗜铁素的假单胞菌菌株，通过双层培养基法定性和液体培养法定量筛选出一株高产嗜铁素的假单胞菌株，又确定了嗜铁素对对常见致病菌株-副溶血性弧菌、藤黄球菌和金黄色葡萄球菌的拮抗作用，并对真菌生长具有抑制作用，该菌株合成的嗜铁素，能够用于蔬菜种植过程中对于疾病的生物防治，并对植物生长具有促进作用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，菌株名称为PA94，分类名称为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，保藏编号：CGMCCNo.9180，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年05月21日。

而且，利用MMSA-CAS平板，筛选产嗜铁素的菌株，其中菌株PA94经过16SrRNA基因序列分析，鉴定为铜绿假单胞菌。

而且，所述菌株PA94在MMSA液体培养基中培养，24h后测得嗜铁素活性单位SU＝63.54％，As/Ar＝0.36，产嗜铁素的能力++++。

而且，所述菌株PA94产生的嗜铁素为氧肟酸型和柠檬酸型的混合型。

而且，所述菌株PA94产生的嗜铁素对致病菌和真菌具有拮抗作用。

高产嗜铁素的铜绿假单胞菌菌株PA94产生嗜铁素用于蔬菜种植中疾病的防护制剂的应用。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明提供的菌株能够用于发酵嗜铁素，在制备成嗜铁素制剂，该制剂使用后能够降低病原菌对抗菌素产生抗药性的可能，避免有毒有害化学试剂对环境的危害，能够为植物的生长提供铁营养元素，促进蔬菜的生长，在生物防治领域具有重要的应用价值，同时能够避免大量使用杀菌剂，达到对蔬菜疾病实行生物防控的目的。

附图说明

图1为本发明PA94菌株在MMSA-CAS平板上的菌落形态。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。

一株高产嗜铁素的假单胞菌菌株的分离鉴定，步骤如下：

1.1培养基

LB培养基：每L中含有酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl10g，琼脂15g，其余为水。

MMAS培养基：每L中含有蔗糖20g、天冬氨酸2g、K₂HPO₄1g、MgSO₄0.5g、琼脂15g，其余为水。

CAS固体培养基：每L中含有铬天青S1.21g、十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)1.82g、无水哌嗪30.24g、FeCl₃(10mMHCL溶解)0.27g，琼脂15g。液体CAS所有成分含量不变，但不需要添加琼脂。

1.2试剂

Arnow方法检测试剂用于检验儿茶酚型嗜铁素，其配方为：0.5MHCl；10g亚硝酸钠和10g钼酸钠溶于少量水后加水至100mL；1MNaOH。

羧酸型嗜铁素检测试剂配方为：250μMCuSO₄和0.2MpH4.0醋酸盐缓冲液。

氧肟酸型嗜铁素检测试剂为：100mMFeCl₃溶解在0.1MHCl中。

1.3产嗜铁素菌株的分离与筛选

收集环境中土壤样品，采用梯度稀释法涂布在MMSA平板上，待菌落长出后倾倒一层CAS蓝色培养基，观察板上颜色的变化。将板上有颜色变化的菌株划线纯化，挑单菌落接种于LB培养基中，过夜培养后按照1％的接种量转接到20mLMMSA液体培养基中,30℃,200rpm振荡培养24h。

发酵液离心过滤，与等体积CAS溶液混合，室温下静置1h后测定OD₆₈₀，通过SU＝(Ar-As)/Ar，计算出嗜铁素的活性单位；通过As/Ar来估计出产生嗜铁素的能力，As/Ar从1.0-0之间以0.2为间隔,每减小0.2增加一个“+”,一般产嗜铁素能力较高(+++)的细菌其As/Ar低于0.5(其中Ar代表等体积的MMSA培养基与CAS溶液混合，室温下静置1h后OD₆₈₀，As代表等体积的菌株发酵液上清与CAS溶液混合，室温下静置1h后OD₆₈₀)。

1.4嗜铁素类型的鉴定

(1)Arnow方法(检验儿茶酚型嗜铁素)：

假单胞菌株的发酵液10000rpm离心5min，取1mL上清与1mL0.5MHCl、1mL钼酸-亚硝酸钠、1mLNaOH混合，然后添加1mL水至体积为5mL，如果有儿茶酚型嗜铁素存在，该混合液的颜色会变成红色，在1h内测定该混合液的OD₅₁₀。颜色越深，OD₅₁₀值越大，表明儿茶酚型嗜铁素的含量越大。

(2)羧酸型嗜铁素检测方法：

取1mL上清与1mL250μMCuSO₄和2mL0.2MpH4.0醋酸盐缓冲液混合后，添加1mL水至体积为5mL，测定在190nm-400nm的光吸收。如果有羧酸型嗜铁素存在，则该混合液在190nm-280nm有最大光吸收。

(3)FeCl₃方法：

取1mL上清液200μL100mMFeCl₃混合，如果有三羟基氧肟酸嗜铁素存在，则混合液会变成桔黄色；如果有二羟基氧肟酸存在，则混合液混变成粉红色。

1.5分离菌株的分子鉴定

对分离到的PA94菌株，采用苯酚-氯仿-异戊醇抽提法提取菌体DNA，并以此做模板，利用PCR方法扩增16SrRNA基因。将PCR产物进行测序，将得到的序列使用NCBIBlast和Ribosomal Database ProjectⅡ软件Classifier，对PA94菌株进行分析与鉴定。其中，扩增16SrRNA基因通用引物27F和1492R，引物序列如下：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

聚合酶链式反应体系：

PCR反应条件：

1.6嗜铁素对致病菌和真菌生长的拮抗作用

1.6.1测定嗜铁素对致病菌的拮抗作用

将培养24h的PA94菌液离心过滤，制备嗜铁素粗提液，采用牛津杯方法，分别检测嗜铁素制剂对致病菌的抑制作用，将牛津杯置于事先涂布有副溶血性弧菌、藤黄球菌和金黄色葡萄球菌三种指示菌的MKB培养基上，加入嗜铁素制剂，37℃培养12h，测定抑菌圈的大小。

1.6.2嗜铁素制剂对毛霉生长的拮抗作用

将培养24h的PA94菌液离心过滤，制备嗜铁素粗提液，然后以10％、20％和30％的比例，加入到3％接种量的液体察氏培养基中，48h后将发酵液抽滤，烘箱干燥称量菌丝体的重量。

筛选实施例1

1、高产嗜铁素假单胞菌株的筛选：

从MMSA-CAS平板上共分离到15株产生嗜铁素的菌株，其中PA94的颜色变化最快。图1所示PA94菌株的MMSA平板在倾倒CAS蓝色培养基后，15min左右时菌落周围蓝色开始变浅，30min左右变成桔红色，随后颜色变化圈随时间的延长变大，3h后不再扩大。将15株产生嗜铁素的菌株划线纯化，挑单菌落接种于液体MMSA培养基中，培养24h后离心，上清液与等体积CAS溶液混合，其中PA94菌株As＝OD₆₈₀＝0.174，对照Ar＝OD₆₈₀＝0.478嗜铁素活性单位最大，SU＝63.54％，产生嗜铁素的能力As/Ar＝0.36，++++，菌株PA94能够产生较高水平的嗜铁素。

2、鉴定菌株PA94产生嗜铁素的类型：

(1)PA94菌株发酵液上清与Arnow试剂混合后为无色透明，说明上清液中无儿茶酚型嗜铁素的存在。

(2)与200μL100mMFeCl₃混合后出现桔黄色，说明上清液中含有三羟基氧肟酸类型的嗜铁素。

(3)与CuSO₄和醋酸盐缓冲液混合后，针对柠檬酸型嗜铁素鉴定要求，进行全波长扫描，在220nm处出现最大吸收峰，因此PA94菌株产生的嗜铁素含有柠檬酸性嗜铁素。

综合上述结果，判断菌株PA能够合成分泌两种嗜铁素，是氧肟酸型和柠檬酸型的混合型嗜铁素。

3、高产嗜铁素菌株PA94的分子鉴定

提取菌株PA94的基因组DNA，依次为模板，扩增菌株PA94的16SrRNA基因的片段，将PCR产物直接测序，对所或得的DNA序列通过Blast检索，在GenBank中的已知序列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列，利用Ribosomal Database ProjectII软件Classifier，对分离的菌株进行分类。分析结果显示PA94与铜绿假单胞菌PA5-2-1同源度达到100％，因此，菌株PA94为铜绿假单胞菌。

4、分析嗜铁素对病原菌的抑制作用

分别将致病菌副溶血性弧菌、藤黄球菌和金黄色葡萄球菌涂布于相应培养基上，利用牛津杯方法，测定嗜铁素制剂对致病菌的抑制作用。在藤黄球菌和金黄色葡萄球菌平板上的抑菌圈较大且透明，抑菌圈直径分别为15.8mm和16.2mm。在副溶血性弧菌平板上，嗜铁素形成的抑菌圈较小，只有13.7mm。

5、分析嗜铁素对于真菌生长的抑制作用

采取液体培养方法，观察不同嗜铁素制剂的添加量，对毛霉生长的抑制作用。将培养24h的PA94菌液离心过滤，制备嗜铁素粗提液，然后以10％、20％和30％的比例，加入到3％接种量的液体察氏培养基中，48h后将发酵液抽滤，烘箱干燥称量菌丝体的重量。

如表1所示，PA94的无细胞上清对毛霉有微弱的抑制作用，当添加量为30％时对毛霉的抑菌率为13.22％。

表1.嗜铁素制剂对毛霉生长的抑制作用

抑菌率＝(对照菌丝干重-添加PA94上清的菌丝干重)/对照菌丝干重

嗜铁素通过螯合环境中的铁元素，使致病性微生物由于缺乏铁元素，而生长缓慢或停滞，从而达到对致病微生物的控制目的。本发明中来源于假单胞菌的嗜铁素制剂，可以用于植物种植特别是蔬菜种植过程中，对细菌性疾病和真菌性疾病的生物防治，避免了抗菌素和其它化学试剂的使用，提高了食品的安全性，降低了对环境的压力，对于发展蔬菜种植的绿色模式至关重要。

Claims (6)

1.一株高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，其特征在于：菌株名称为PA94，分类名称为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，保藏编号：CGMCCNo.9180，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年05月21日。

2.根据权利要求1所述高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，其特征在于：利用MMSA-CAS平板，筛选产嗜铁素的菌株，其中菌株PA94经过16SrRNA基因序列分析，鉴定为铜绿假单胞菌。

3.根据权利要求1所述高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述菌株PA94在MMSA液体培养基中培养，24h后测得嗜铁素活性单位SU＝63.54％，As/Ar＝0.36，产嗜铁素的能力为++++。

4.根据权利要求1所述高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述菌株PA94产生的嗜铁素为氧肟酸型和柠檬酸型的混合型嗜铁素。

5.根据权利要求1所述高产嗜铁素的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述菌株PA94产生的嗜铁素对致病菌和真菌具有拮抗作用。

6.权利要求1所述高产嗜铁素的铜绿假单胞菌菌株PA94产生嗜铁素作为蔬菜种植中疾病的防护制剂的应用。