CN103320360B - 一株巨大芽孢杆菌sj-7菌株及其应用 - Google Patents
一株巨大芽孢杆菌sj-7菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株巨大芽孢杆菌SJ-7菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明通过常规的方法从自然界中进行菌株分离、纯化、培养，获得该巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7菌株。巨大芽孢杆菌SJ-7菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.7169。巨大芽孢杆菌SJ-7菌株具有较强解磷解钾和固氮作用，并对多种病原真菌具有较好拮抗作用，能作为制备防治植物真菌病害药物的应用。本发明的巨大芽孢杆菌SJ-7菌株同与报道的其他巨大芽孢杆菌相比，其优点在于：具有较好的解钾、降解土壤难溶无机磷和固氮作用，能促进植物生长，同时对引起的赤霉病、棉花立枯病、小麦纹枯病、及灰霉病的多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。
Description
技术领域：
本发明涉及一株巨大芽孢杆菌SJ-7菌株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
生物防治是利用生物或它的代谢产物来控制有害动、植物种群或减轻其危害程度的方法。现在，植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等很多种群。其中，芽孢杆菌是一类重要的生防菌，其生理特征丰富多样，分布极其广泛，极易分离培养，是土壤和植物体表、根际的重要微生物种群。芽孢杆菌突出的特征是能产生耐热抗逆的芽孢，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种较理想的生防微生物。
芽孢杆菌属于革兰氏染色阳性菌，由于其能够产生芽孢，而芽孢具有很强的抗逆性，能忍受多种不良环境。芽孢杆菌中存在很多特殊功能的菌株，在农业、科学研究、工业和医学中有广泛的应用价值。在农业方面，现在发现芽孢杆菌具有许多功能，如有研究表明，巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、侧孢芽孢杆菌Bacillus laterosporus等可降解土壤中难溶的含磷化合物，使之成为作物易吸收的可溶形态。自1958年Hino首次从日本土壤中分离到一株具有高固氮活性的芽孢杆菌固氮菌株后，土壤中新发现的芽孢杆菌固氮菌株越来越多，如多粘芽孢杆菌的一个变种(亦称为固氮芽孢杆菌Bacillus azotofixans)。此外，也有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）的部分菌株有一定固氮能力的报道。此外，国内外还有许多关于Bacillus subtilis对植物病原真菌的抑制作用及防治实验的报道。因此芽孢杆菌可以作为生物肥料或生物农药。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)，在农业上常用于制造磷细菌肥料，还能用于防治生姜细菌性青枯病和兰花炭疽病，但兼具解磷解钾固氮和防治真菌病害的多功能菌尚不多见。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株巨大芽孢杆菌SJ-7菌株及其应用。
本发明从在云南玉溪地区的西红柿、黄瓜、韭菜、大蒜、大葱、白菜、及烟草种植地的土壤样品中获得。通过16SrDNA测序和生理生化指标鉴定，鉴定结果表明该细菌为巨大芽孢属，该菌株命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7，该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年01月18日；保藏号为CGMCC No. 7169。
本发明的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7对多种植物病原真菌具有较强的抑制，能够作用作为制备防治植物真菌病害药物的应用。
本发明的优点在于：具有较好的解钾、降解土壤难溶无机磷和固氮作用，能促进植物生长，同时对引起的赤霉病、棉花立枯病、小麦纹枯病、及灰霉病的多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。
附图说明：
图1显示巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7对赤霉病菌（禾谷镰刀菌Fusarium graminearum）的平板抑制结果
图2显示巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7对棉花立枯病菌（立枯丝核菌Rhizoctonia solani）的平板抑制结果、
图3显示巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7对小麦纹枯病菌（禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis）的平板抑制结果
图4显示巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7对灰霉病菌（灰葡萄孢Botrytis cinerea）的平板抑制结果
具体实施方式：
下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）SJ-7菌株的获得
2012年1月在云南玉溪地区的西红柿、黄瓜、韭菜、大蒜、大葱、白菜、及烟草种植地的土壤样品中获得。土壤样品采自表层下5-20cm深度（将表层5cm的浮土除去）土样,从田间采回的土样风干，称取5g干燥的土样，放入已盛有50ml灭菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡1h，然后放在85℃水浴30min，然后分别稀释到10-2、10-3，取200ml涂牛肉膏蛋白胨平板，置于28℃，培养1-2d，观察菌落的形态特征。并调取单菌落，用孔雀绿染色法染色进一步镜检观察。孔雀绿染色法染色的具体步骤如下：
(1)将菌苔按革兰氏染色法涂片后，用7.6％饱和的孔雀绿水溶液(质量百分比))染10min。
(2)用自来水冲洗。
(3)用0.5％（质量百分比）番红液复染30s。
(4)水洗，吸干。
(5)镜检，观察是否产生芽孢，芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊成为红色。从中挑出产芽孢的菌落，记录结果。
然后将分离获得的芽孢杆菌进行固氮、解钾、解磷以及拮抗病原真菌能力的筛选，具体方法如下：
固氮能力筛选，将分离筛选到的芽孢杆菌接种到Ashby培养基平板上，置于30℃恒温箱倒置培养，培养4-5d。观察生长情况。将能够在平板上生长的菌株挑出，进一步通过划线法纯化，直到得到纯菌株。记录结果，并于斜面4℃保藏，如果长期保藏用20%的甘油（体积百分比）封存，放入-80℃冰箱冷冻保存。
解钾能力筛选，将分离筛选到的芽孢杆菌接种到Aleksandrov培养基平板上，置于30 ℃恒温箱倒置培养，按2d、3d、4d、5d取出观察生长情况。将有透明圈的菌株挑出，进一步通过划线法纯化，直到得到纯菌株。记录结果，并于斜面4℃保藏。
解磷能力筛选，将分离筛选到的芽孢杆菌接种到无机磷培养基平板上，置于30 ℃恒温箱倒置培养，按2d、3d、4d、5d取出观察生长情况。将有透明圈的菌株挑出，进一步通过划线法纯化，直到得到纯菌株。记录结果，并于斜面4℃保藏。
拮抗植物病原菌能力筛选，红腐病菌（串珠镰刀菌Fusarium moniliforme）病原菌为指示菌，采用PDA平板对峙生长法将进入初筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4个角点上，平板中央同时移入一直径0.3cm的病原菌的琼脂块，置于25℃培养箱培养3-5天，选出对病原菌生长有抑制作用的菌株。
通过上述筛选结果获得一株具有较强解磷解钾和固氮作用、并对多种病原真菌具有较好拮抗作用的巨大芽孢杆菌SJ-7。
实施例2：巨大芽孢杆菌SJ-7的鉴定
采用16SrDNA序列比对结合生理生化特征测定的方法将SJ-7鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。具体步骤如下：
（1）16SrDNA序列分析
提取SJ-7菌体的基因组DNA，用细菌16SrDNA通用引物（16s F： 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'；16s R： 5' TACGGCTACCTTGTTACGACT 3'）进行PCR扩增，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将回收后纯化的PCR产物送到上海生工生物技术公司测序（SEQ ID NO1）。使用NCBI网站对SJ-7菌的16SrDNA序列与数据库中各种菌的16S rDNA序列进行相似性比较分析，结果表明SJ-716SrDNA序列与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的16SrDNA序列同源性非常高，达99%。
（2）形态和生理生化特征
形态特征：
采用LB固体培养基培养，接种后在30℃恒温条件下培养，48h后形成明显菌落，菌体充分成熟后大部分形成芽孢，成熟菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。芽胞直径大于1.0μm，革兰氏阳性。芽孢直径大于1.0μm1，圆形中生，无伴胞晶体。在LB培养基上生长，最高温度为50℃，最低为10℃，最适合温度为30℃。菌株的适宜pH值为6.5-7.5，菌苔表面光滑有光泽，菌落乳白色且边缘光滑。
生理生化特征：
接触酶+，V-P测定-，V-P培养物终pH:<6和>7 -，葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖发酵产酸，明胶水解+，淀粉水解+，苯丙氨酸脱氨酶-，卵黄卵磷脂酶-，硝酸盐还原-，吲哚形成-。
结合16SrDNA序列分析结果并参考东秀珠、蔡妙英等编著、2001年科学出版社出版的《常见细菌系统鉴定手册》，鉴定为巨大芽孢杆菌。
实施例3：巨大芽孢杆菌SJ-7固氮能力的测定实验
采用全氮比色法测定芽孢杆菌的固氮能力。
准确称取在(l05土5)℃烘1h的0.4716g (NH4)2SO4，溶于水，稀释至100ml，该液含氮1.0mg/ml，取此液（0、2.5、5、10、15、20）μl 放入试管中，加水至3.4ml，每管加入奈氏试剂1.0ml，摇匀，水浴加热 l5min，使之充分显色，冷却后，于420nm处比色计测定，并记录吸光度。用吸光度为横坐标，相应的标准液的氮含量为纵坐标，绘制氮标准曲线。
在250ml三角瓶中加入50ml Ashby培养基，121℃灭菌20min。无菌操作，每瓶分别接入被测菌，同时做不接菌的空白对照，均于30℃、200r/min培养5 天。
固氮菌液0.5ml于30ml 消化管中，加1ml硫酸，加 0.05g 催化剂和4滴双氧水消煮至清亮，若反应液久煮不清，冷却后加1-2滴双氧水，继续煮至无色透明，取下冷却。滴加NaOH（400g/L）至出现Cu(OH)2沉淀(4ml)，加 10 滴酒石酸钾钠，以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁，加少许蒸馏水，摇匀，稀释至28.5ml，摇匀。过滤，滤液3.00ml于比色管中，加0.3ml NaOH（80g/L），0.3ml酒石酸钾钠，1.0ml奈氏试剂，摇匀，显色2-3min后，即倒入比色杯中，于420nm 处比色计测定，读取吸光度。
另外，取1.5ml菌液6500r/min，离心5min，取1ml的上清于试管中，加入2.4ml蒸馏水，0.3ml NaOH（80 g/L），0.3ml 酒石酸钾钠，1.0ml奈氏试剂，摇匀，显色2-3min后，即倒入比色杯中，于420nm 处比色计测定，读取吸光度。结果见表1（P418，YKT41分别为对照菌株分别为本实验室保藏的具有解磷解钾和固氮作用的伯克霍尔德氏菌和褐球固氮菌）。
表1被测菌液及上清中的氮含量
实施例4：巨大芽孢杆菌SJ-7解钾能力的测定实验
采用四苯硼钠比浊法测定芽孢杆菌的解钾能力。
取KCl标准储备液（0、100、200、300、400、500、600）μl放入试管中，加水至1ml，每管加入0.2ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH4.5)和4%四苯硼钠溶液0.8ml，摇匀，形成均匀的、微乳白色透明溶胶。于520nm处测其吸光度，即OD值。用吸光度为横坐标，相应的标准液的磷含量为纵坐标，绘制钾标准曲线。
在250ml三角瓶中加入50ml Aleksandrov培养基，121℃灭菌20min。无菌操作，每瓶分别接入被测菌，同时做不接菌的空白对照，均于30℃、200 r/min培养 5 天。
取1.5ml菌液6500 r/min，离心5min，取1ml的上清于试管中，加入0.2ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液和4%四苯硼钠溶液0.8ml，摇匀，形成均匀的、微乳白色透明溶胶。于520nm波长，1cm 比色皿中，以阴性对照（未接菌的培养液）为参比溶液，测定该溶胶的吸光度。根据标准工作曲线的回归直线方程，计算出被测菌液中氯化钾含量。
表2被测菌液上清中的钾含量
实施例5：巨大芽孢杆菌SJ-7解磷能力的测定实验
采用磷钒钼黄比色法测定芽孢杆菌解无机磷的能力。
取磷酸储备液（0、10、20、40、100）μl放入试管中，加水至2.5ml，每管加入颜色终止液2.0ml，摇匀，37℃水浴加热30min，使之充分显色，冷却后，于415nm处比色计测定，并记录吸光度。用吸光度为横坐标，相应的标准液的磷含量为纵坐标，绘制磷标准曲线。
在250ml三角瓶中加入50ml无机磷培养基，115 ℃灭菌30min。无菌操作，每瓶分别接入被测菌，同时做不接菌的空白对照，均于30 ℃、200r/min培养1-2天。
培养1天后，取1ml菌液6500 r/min，离心5min，取0.8ml的上清加入到含1.7ml蒸馏水的试管中，然后加入2ml颜色终止液终止反应，37℃水浴保温30min，显色后于415nm处用分光光度计测其OD值。第2天再测定一次OD值。然后根据磷标准曲线读出磷的含量。
表3被测菌液上清中的磷含量
实施例6：巨大芽孢杆菌SJ-7的拮抗植物病原菌能力测定
以赤霉病菌（禾谷镰刀菌Fusarium graminearum）、、棉花立枯病菌（立枯丝核菌Rhizoctonia solani）、小麦纹枯病菌（禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis）、灰霉病菌（灰葡萄孢Botrytis cinerea）、共4种病原菌为指示菌，采用PDA平板对峙生长法将进入初筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4个角点上，平板中央同时移入一直径0.3cm的病原菌的琼脂块，置于25℃培养箱培养3-5天，观察结果（图1-4）。从图1-4知：巨大芽孢杆菌SJ-7对赤霉病菌（禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum）、、棉花立枯病菌（立枯丝核菌Rhizoctonia solani）、小麦纹枯病菌（禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis）、灰霉病菌（灰葡萄孢Botrytis cinerea）、共4种病原菌具有明显抑制效果。
实施例7：巨大芽孢杆菌SJ-7的液体发酵
巨大芽孢杆菌SJ-7的液体发酵，按以下步骤进行：
（1）斜面菌种：采用固体NA培养基，将试管菌种接种在试管培养基中，30℃恒温条件下培养24小时。
（2）摇瓶菌种：采用液体NA培养基，将斜面菌种的单菌落接种在液体NA培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时。
（3）液体发酵：采用培养基（质量百分比），即：2%玉米粉、6%豆粕粉、1%蔗糖、0.5%（NH4）2SO4、KH2PO4.2H2O 0.2%、K2HPO4.2H2O0.4%、FeSO4·5H2O 0.05%、CaCl2.2H2O 0.02%，pH 7.0-7.5,121℃灭菌20分钟，将（2）的种子接种于10升发酵罐内（接种量为2%），30℃培养，每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1，搅拌速度为250r/min，培养时间为36-48小时，在芽孢脱落70%时终止发酵。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草公司玉溪市公司;昆明保腾生化技术有限公司;山东省科学院中日友好生物技术研究中心
<120> 一株巨大芽孢杆菌SJ-7菌株及其应用
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<160> 1
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> Bacillus megaterium
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<221> gene
<222> (1)..(1452)
<223> 16srDNA
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cgtcacacca ggagagtttg taacacccga agtcggtgga gtaaccgtaa ggagctagcc 1440
gctaaggtga ca 1452
Claims (2)
1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SJ-7菌株，其保藏号为：CGMCCNO.7169。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SJ-7菌株的应用，其特征在于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SJ-7对引起赤霉病、棉花立枯病、小麦纹枯病、灰霉病的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)4种植物病原真菌具有较强的抑制，同时兼有较强解磷解钾和固氮作用，能够作为制备防治上述4种植物病原真菌所引起的植物病害的防治药物的应用。
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| 巨大芽孢杆菌B1301分泌物的抑菌作用及其特性的研究;曹燕鲁等;《山 东 轻 工 业 学 院 学 报》;20040630;第18卷(第2期);51-55 * |
| 通过导入几丁质酶基因提高巨大芽孢杆菌的生防效果;张新建等;《云南植物研究》;20071231;第29卷(第6期);666-670 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103320360A (zh) | 2013-09-25 |
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