CN103725628A - 一株抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株，该菌株通过发酵培养得到的发酵产物可用于防治核桃溃疡病（Botryosphaeria dothidea）、核桃腐烂病（Valsa sp.)、杨树溃疡病（B.dothidea）和七叶树溃疡病（B.dothidea）等多种林木病害。该菌株已于2013年11月6号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8439。该菌株的获得，有望为核桃溃疡病等的防治提供一个安全、环保、有效的途径，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用领域，特别涉及一株对核桃溃疡病菌有拮抗作用的内生菌及其在防治核桃溃疡病中的应用。
背景技术
植物内生菌是指生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物。内生菌因溶磷、固氮、产生植物激素、诱导抗虫抗病、抗逆等强大生理和生态功能而倍受关注。近年来发现，许多植物内生菌还能够产生具有农药活性的次生代谢产物，引起了人们巨大的兴趣。从微生物中寻找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。由于内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，可以在植物体内繁殖和传递，使之成为生物防治中极具潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌。
中国核桃产业近年来发展迅猛，但由于大规模集中连片的栽培方式，加之树体高大、林内郁闭、通风条件差，使得以核桃溃疡病（Botryosphaeria dothidea）等为代表的树干部病虫害迅速蔓延、发生面积大。其危害造成树势迅速衰弱、死亡。核桃溃疡病是核桃树干上的一种常见病害，早在上世纪的1915年，美国加利福尼亚州即已发现此病，在国内如陕西、河北、河南、山东、江苏、安徽等省均有其分布。病株率一般为20％-40％，重病区可达70％以上，不仅影响当年的产量，而且削弱树势，导致过早衰亡。本病除为害核桃外，还发生于垂柳、刺槐、枫杨、中槐、苹果及多种杨树。
对于核桃溃疡病的防治，目前生产上主要依靠林业栽培管理措施和化学农药进行防治。但由于该病发病初期隐藏潜伏于树皮下危害，侵染初期树皮表面危害症状不明显，果农易忽视其存在，又因其具有较长的潜伏期、较长的发病 周期和多点危害的特点，在防治中需要一个生长周期多次处理、多次施用化学农药，才能较好的控制其危害。存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题。寻求新的经济高效、绿色环保的防治技术与途径已成为当前核桃溃疡病防治中迫切解决的问题。关于利用具有生防作用的内生菌来进行植物病害的防治生产上已有成功的案例，研究开发针对核桃溃疡病防治的内生菌是治疗该病的一条值得期待的新途径。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株（Bacillus subtilis strain WB1）及其应用，并通过试验证明该菌株WB1能够用于防治核桃溃疡病。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株，其特征在于，该抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.8439。
经测定，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的16SrDNA序列如下所示：
1 gcctgagggg gctgacttac gtgcgagtcg agcggacaga tagggtagct tgctccctga
61 tgttagcggc ggacgaggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact
121 ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg
181 tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg
241 gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga
301 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt
361 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag
421 ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac
481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat
541 tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc
601 ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt
661 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc
721 tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt
781 ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct
841 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga
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961 ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg
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1441 tctagagcct cacccccc
经测定，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的抗菌素TasA基因序列如下所示：
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61 aggaggaaca tgggcagcat ttaacgacat taaatcaaag gatgctactt ttgcatcagg
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721 tactgataaa gacggttatg tgaaagaaaa tgaaaaagcg cacagcgagg taataa
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的培养条件为：PDA培养基（pH7.0-8.5)，培养温度25-30℃，黑暗条件。
经试验证明，本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃溃疡病（B.dothidea）、核桃腐烂病（Valsa sp.)、杨树溃疡病（B.dothidea）和七叶树溃疡病（B.dothidea）等几种林木病原菌均有良好的抑制作用。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株发酵培养条件如下：
LB液体培养基，pH值7.0-8.0,转速80-150rpm，25-30℃。
经申请人验证，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株发酵后的发酵液，含有抑制核桃溃疡病、核桃腐烂病、杨树溃疡病和七叶树溃疡病生长的物质，可用于田间防治。
采用上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。
附图说明
图1是组织分离中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃溃疡病菌、腐烂病菌的抑菌结果。其中，图（A）为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株和核桃溃疡病图片，图（B）为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis strain WB1）菌株和核桃腐烂病图片。
图2是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株进化树分析示意图。
图3是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株和核桃溃疡病、腐烂病的对峙培养实验结果。其中，图（A）为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株和核桃溃疡病的划线培养，图（B）为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株和腐烂病的对峙培养，箭头表示杀死带。
图4是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株田间防治核桃溃疡病效果和化学防治比较。
图5是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株田间防治核桃溃疡病后的效果。其中从左至右，A图表示空白对照喷无菌水，B图表示枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃品种1的接种防治，C图表示枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃品种2的接种防治。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
实施例1：核桃溃疡病拮抗菌的筛选及其鉴定
1、申请人的课题组在中国陕西武功地区采集的核桃树皮样品中分离得到一菌株，具体分离方法为：从健康的核桃植株上取新鲜的树皮，利用PDA培养基分离、培养、纯化。然后采用对峙培养法利用PDA平板筛选对核桃溃疡病抑菌作用最强的菌株，结果得到一株对核桃溃疡病具有较强拮抗作用的内生菌菌株，申请人将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃溃疡病菌、核桃腐烂病菌拮抗作用结果如图1，3所示。
2.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的种属鉴定
采用常规生理生化及16S rDNA序列分析对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株进行鉴定，确定该菌属于枯草芽孢杆菌。
PDA培养基上。菌落初乳白色，光滑，湿润，边缘钝化，菌落隆起；2天后，菌落黄白色，表湿润不平滑，边缘不规则，菌落平铺；PA溶液，生长不良，LB溶液中，菌液较透明，菌体白色沉底；喜富氨基酸基质，喜高温（25-30℃）。
以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的基因组DNA为模板，以细菌16SrDNA序列通用引物进行扩增，PCR产物经检测后送上海生工生物工程有限公司测序，得到其16SrDNA序列。
从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株与芽孢杆菌属已有效发表种16SrDNA序列构建出的系统发育树状图（图2）可以看出：所有参比菌株共形成6大分枝，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株与分枝中所有菌株的16SrDNA序列相似性介于98.5%-99.1%之间，与Bacillus subtilis strain TUST018(accession KC456632)的系统发育关系最为密切，它们之间的序列相似性为99.1%，这与目前属的界定中16SrDNA序列相似性不低于95%的标准相符合。但该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株在系统进化树上与已知诸菌株分支长度长，说明该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株与同一分支上的各菌株在进化上存在一定的差异。
申请人将该菌株于2013年11月6日交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏号为CGMCC No.8439。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的16SrDNA序列如下所示：
1 gcctgagggg gctgacttac gtgcgagtcg agcggacaga tagggtagct tgctccctga
61 tgttagcggc ggacgaggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact
121 ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg
181 tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg
241 gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga
301 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt
361 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag
421 ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac
481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat
541 tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc
601 ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt
661 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc
721 tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt
781 ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct
841 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga
901 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta
961 ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg
1021 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac
1081 gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg
1141 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct
1201 acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc
1261 acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc
1321 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc
1381 gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagt taacctccta ggagccagcc
1441 tctagagcct cacccccc。
实施例2：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的室内培养及产生抗生素基因特征
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的种子培养条件为：
PDA培养基（pH7.0-8.5），培养温度25℃-30℃，黑暗条件。
该菌株的发酵液培养条件为：
LB液体培养基，pH7.0-8.0，转速80-150rpm，培养温度25℃-30℃。
以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的基因组DNA为模板，以细菌抗生素序列通用引物为引物，经PCR产物测序，得到了其774pb的抗生素基因序列。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的抗菌素TasA基因序列如下所示：
1 ggagaaaaag aaattgagtt taggagttgc ttctgcagca ctaggattag ttttagttgg
61 aggaggaaca tgggcagcat ttaacgacat taaatcaaag gatgctactt ttgcatcagg
121 tacgcttgat ttatctgcta aagagaattc agagagtgtg aacttatcaa atctaaagcc
181 gggagataag ttgacaaagg atttccaatt tgaaaataac ggatcacttg cgatcaaaga
241 agttttaatg gcgcttaatt atggagattt taaagcaaac ggcggcagca atacatctcc
301 agaagatttc ctcagccagt ttgaagtgac attgttgaca gttggaaaag agggcggcaa
361 tggttacccg aaaaacatta ttttagatga tgcgaacctt aaagacttgt atttgatgtc
421 tgctaaaaat gatgcagcgg ctgctgaaaa aatcaaaaaa caaatagacc ctaaattctt
481 aaatgcaagc ggtaaagtca atgtagcaac aattgacggt aaaaccgctc ctgaatatga
541 tggtgttcca aaaacaccaa ctgacttcga tcaggttcaa atggaaatcc aattcaaaga
601 tgataaaaca aaagatgaaa acgggcttat ggttcaaaat aaatatcaag gcaactccat
661 taagcttcaa ttctcgttcg aagctacaca gtggaacggc ttgacaatca aaaaggacca
721 tactgataaa gacggttatg tgaaagaaaa tgaaaaagcg cacagcgagg taataa。
实施例3：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃溃疡病菌等的拮抗作用的评价
1、室内活性测定
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株在PDA平板对峙 培养中，能强烈抑制核桃溃疡病菌、核桃腐烂病菌、七叶树溃疡病菌、杨树溃疡病菌。图3A显示了在PDA平板上枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株与核桃溃疡病菌的划线培养情况，图3B显示了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株与核桃腐烂病菌的对峙培养情况。
2、田间防治试验
于6月上旬核桃溃疡病、七叶树溃疡病发病期，在田间分别选择发病情况相对一致的植株，用小刀划破溃疡病病斑表皮，涂抹枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株发酵液，于8月下旬统计病斑治愈率及新发病斑数。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对核桃溃疡病的防治效果显著。如图4、5所示，田间实验结果表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对当年溃疡病病斑治愈率达84.1%，新发病斑率低于9.6%，较阴性对照治愈率0，新发率54.6%差异显著，较阳性对照（戊唑醇）治愈率（60.5%)显著。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株对七叶树溃疡病的也具有满意的防治效果，对当年溃疡病病斑治愈率达80.5%，新发病斑率低于15.2%。
Claims (6)
1.一种抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株，其特征在于，该抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.8439。
2.如权利要求1所述的抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株，其特征在于，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的16SrDNA序列如下所示：
1 gcctgagggg gctgacttac gtgcgagtcg agcggacaga tagggtagct tgctccctga
61 tgttagcggc ggacgaggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact
121 ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg
181 tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg
241 gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga
301 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt
361 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag
421 ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac
481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat
541 tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc
601 ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt
661 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc
721 tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt
781 ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct
841 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga
901 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta
961 ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg
1021 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac
1081 gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg
1141 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct
1201 acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc
1261 acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc
1321 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc
1381 gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagt taacctccta ggagccagcc
1441 tctagagcct cacccccc。
3.如权利要求1所述的抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株，其特征在于，该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain WB1）菌株的抗菌素TasA基因序列如下所示：
1 ggagaaaaag aaattgagtt taggagttgc ttctgcagca ctaggattag ttttagttgg
61 aggaggaaca tgggcagcat ttaacgacat taaatcaaag gatgctactt ttgcatcagg
121 tacgcttgat ttatctgcta aagagaattc agagagtgtg aacttatcaa atctaaagcc
181 gggagataag ttgacaaagg atttccaatt tgaaaataac ggatcacttg cgatcaaaga
241 agttttaatg gcgcttaatt atggagattt taaagcaaac ggcggcagca atacatctcc
301 agaagatttc ctcagccagt ttgaagtgac attgttgaca gttggaaaag agggcggcaa
361 tggttacccg aaaaacatta ttttagatga tgcgaacctt aaagacttgt atttgatgtc
421 tgctaaaaat gatgcagcgg ctgctgaaaa aatcaaaaaa caaatagacc ctaaattctt
481 aaatgcaagc ggtaaagtca atgtagcaac aattgacggt aaaaccgctc ctgaatatga
541 tggtgttcca aaaacaccaa ctgacttcga tcaggttcaa atggaaatcc aattcaaaga
601 tgataaaaca aaagatgaaa acgggcttat ggttcaaaat aaatatcaag gcaactccat
661 taagcttcaa ttctcgttcg aagctacaca gtggaacggc ttgacaatca aaaaggacca
721 tactgataaa gacggttatg tgaaagaaaa tgaaaaagcg cacagcgagg taataa。
4.权利要求1所述的抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株的室内培养方法，其特征在于，选择PDA培养基进行培养，该PDA培养基的pH值为7.0-8.5，培养温度25℃～30℃，黑暗条件。
5.权利要求1至3其中之一所述的抗核桃溃疡病的核桃内生菌菌株发酵培养后的发酵液用于制备防治核桃溃疡病的生防制剂应用。
6.如权利5所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养条件为：LB液体培养基，pH值7.0-8.0,转速80-150rpm，25-30℃。
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