CN113667620A - 枯草芽孢杆菌Bs1218m及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌Bs1218m，所述枯草芽孢杆菌Bs1218m保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21805，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)；本发明还提供该菌株的应用，将其制成功能型叶面肥水剂后应用于柑橘黄龙病和溃疡病的防治。本发明提供一种抗阿维菌素的枯草芽孢杆菌Bs1218m，由其制成功能性叶面肥水剂不仅对柑橘黄龙病和柑橘溃疡病具有很好的防治效果，同时还可促进柑橘的生长。

Description

枯草芽孢杆菌Bs1218m及其应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌Bs1218m及其应用。
背景技术
柑橘黄龙病（Huanglongbing，HLB）是一种毁灭性柑橘病害，其由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberibacter spp.）所引起，病菌属革兰氏阴性细菌。它分布在柑、橘、柠檬、柚子、佛手、香橼等柑橘类果树及枳壳等野生寄主各个组织的韧皮部，并由木虱传播侵染寄主。自1919年首次发现以来，已在世界40多个国家和地区发生。我国南方柑橘产区除重庆和湖北以外，其他产区均有发生，且呈扩大蔓延之势。其典型症状是叶片斑驳黄化、脱叶、红肩果（“红鼻果”）、落果、产量锐减、病果畸形变小，果皮变软，无光泽，味酸，果实品质降低等，重病树果实失去商品价值，严重影响柑橘的产量和质量。由于目前还缺乏抗病品种和防治菌剂，罹病树难以逆转，素有柑橘的“癌症”之称。
在现阶段，针对柑橘黄龙病的防控主要依靠“三板斧”式地技术措施，来减缓黄龙病流行速度，即：（1）严格控制传病媒介昆虫木虱；（2）培育和栽种无病苗木；（3）砍伐严重病植株。但以上措施均不会与黄龙病菌直接发生互作，即不能直接阻止或者杀死黄龙病菌，并不能从根本上解决柑橘黄龙病的问题。因此，柑橘黄龙病将在很长一段时间内，仍然是世界性难以控制的最为严重的柑橘病害。
柑橘溃疡病（ Xanthomonas citri pv. citri）是柑橘的另一种严重病害。其传播途径有两种，一种是近距离传播，病原细菌会凭借着风、雨、昆虫以及枝叶交接处从柑橘树的伤口、气孔和皮孔等处浸入而短距离传播；二是远距离传播，远距离传播主要是病原细菌借助苗木、树枝及柑橘果实实施传播。就外界因素而言，高温多雨、刮大风等天气有利于病害的流行，就柑橘自身因素而言，柑橘植株在抽梢期易于发病，如春梢、夏梢和秋梢期发病较重，晚秋梢一般较轻。该种病害影响柑橘树势，从而导致果实失去商品性，甚至引起落叶、落果，引起重大损失。
然而，柑橘黄龙病和溃疡病防治技术还比较薄弱，进展比较缓慢。柑橘黄龙病还没有有效药剂可以直接杀死病菌而取得有效防治效果；而柑橘溃疡病除在冬春季清园时，剪除重病枝条和清除落叶对柑橘溃疡病有一定的防治效果外，生产上仍然主要依赖化学农药，且能用的药剂品种少，用药防治效果不理想，生物防控制剂则更少，且多数由于效果不稳定或见效慢，不被用户所接受。特别是目前采用的生防制剂活性菌株都是环境微生物，不能在柑橘环境下很好生存与定殖，防病周期短。生产上柑橘有防控溃疡病潜力的内生菌株还没有得到广泛应用。实际上，在柑橘生产中投入化学杀虫剂、杀菌剂的用量大，使用者只是关注目标有害生物防控，不注重柑橘内生菌在病虫害防控中的作用，从而杀死了大量柑橘内生菌，而内生菌在柑橘体内是有多方面的益处，如增加营养吸收，提高抗逆性、抗病虫能力，固定空气中氮素等。
目前已报道柑橘内生菌用于防治溃疡病的菌株少，且不是抗药性菌株，当施用化学杀菌剂或者部分杀虫剂时，这些不抗药的菌株就会被化学农药杀死，从而降低了其对柑橘的保护作用。
阿维菌素是灰色链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的十六元大环内酯抗生素，是一种高效、广谱的抗生素类杀虫、杀螨剂，因其毒性小，作用快，而被广泛用来防治农作物的害虫及螨类防控，特别是用于柑橘红蜘蛛的防控，使用量大，次数多。然而，阿维菌素0.085g/L便能完全抑制柑橘内生枯草芽孢杆菌。因此为了保护有益内生菌，采用抗性菌株，避免阿维菌素对其伤害，更好地发挥内生菌株的作用，选用抗阿维菌素菌株具有非常重要意义。
发明内容
鉴于上述内容，有必要提供抗阿维菌素的枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillussubtilis Bs1218m)，由其制成功能性叶面肥水剂不仅对柑橘黄龙病和柑橘溃疡病具有很好的防效果，同时还可促进柑橘的生长。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m，其保藏于2021年02月02日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21805，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)，它是一株柑橘内生菌。
本发明公开的枯草芽孢杆菌Bs1218m是从云南省华宁县盘溪温州蜜柑新津健康苗中分离获得，于不同时间段分离得到的菌株生理特性相同，该菌株的生物学特性如下：单个细胞0.6-0.8×2-3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏染色阳性，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆形，位于菌体中央。菌落表面粗糙不透明，污白色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭；好氧；可利用蛋白质、多种糖和淀粉，能分解色氨酸形成吲哚。结果发现本发明提供的菌株Bs1218m的16S rDNA基因序列与枯草芽孢杆菌菌株168的同源性最高，相似性达99%，结合生理生化测定从而确定分离出的菌株为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)。
通过试验研究枯草芽孢杆菌Bs1218m对柑橘黄龙病和溃疡病的防治效果，发现该菌株制成的菌剂对患有黄龙病及溃疡病的柑橘植株进行喷施处理，患病的柑橘植株症状得到缓解，表现出优良的柑橘黄龙病及溃疡病防治效果，同时还具有促进植株生长的作用。
一种上述枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，方法为，将所述枯草芽孢杆菌Bs1218m制成功能型叶面肥水剂后应用于柑橘黄龙病和溃疡病的防治，所述功能型叶面肥水剂的制备方法包括以下步骤：
（1）先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，接着挑取1μL枯草芽孢杆菌Bs1218m菌接种到三角瓶内的培养基中，得到接种培养瓶；
（2）将步骤（1）得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的条件下培养24h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液；
（3）将步骤（2）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液按发酵罐中培养基体积的2%的量转接到发酵罐中，并在转速为100r/min、温度为35℃的条件下进行培养30h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液；
（4）按质量百分比，分别取步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液2%的氮酮和10%的吐温20，将氮酮和吐温20加入所述枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液中，搅拌均匀即得到功能型叶面肥水剂。
在本发明中，进一步的说明，所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，每1L步骤（1）至步骤（3）中所述培养基主要由以下质量的组分制成：黄豆粉16g、玉米粉5g、蔗糖5g、鱼粉3g、蛋白胨2g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g和阿维菌素0.3g。
在本发明中，进一步的说明,所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
在本发明中，进一步的说明，所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，步骤（1）所述三角瓶的容积为200mL，其内加入所述培养基的量为100mL。
在本发明中，进一步的说明，所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液的菌株浓度为2×1010-3×1010CFU/ml。
在本发明中，进一步的说明，由本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂稀释不同倍数后对柑橘黄龙病和溃疡病具有不同程度的防控作用，并促进植株生长的作用，其中，稀释800倍后用于防治柑橘黄龙病或稀释150倍后用于防治柑橘溃疡病，防治效果最佳。
所述功能型叶面肥水剂的使用方法为：
对于柑橘黄龙病，将功能型叶面肥水剂用清水稀释800倍后，在非雨天傍晚或上午8时之前喷施于柑橘叶片正反两面，每7-10天喷施一次，连续喷施3-6个月。
对于柑橘溃疡病，将功能型叶面肥水剂用清水稀释150倍后，在非雨天傍晚或上午8时之前喷施于柑橘叶片正反两面，每7-10天喷施一次，连续喷施2-4次。
由于采用上述方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m是一种柑橘内生菌，其具有抗逆性强、营养简单、繁殖速度快、有效活菌数量高、性能稳定以及储存期长等诸多优势，具备良好的开发利用基础，同时，该菌株能在含有阿维菌素的培养基中存活并生长繁殖，表现出良好的抗阿维菌素能力，因此，由枯草芽孢杆菌Bs1218m制备而成的功能型叶面肥水剂喷施于柑橘植株之后，渗入植株体内，再喷施阿维菌素以进行螨类、柑橘红蜘蛛等农作物害虫防治时，不会对柑橘植株内的有益内源菌枯草芽孢杆菌Bs1218m产生不利影响，柑橘植株体内的枯草芽孢杆菌Bs1218m继续行使内生菌的活性功能。
值得注意的是，本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m可产生脂肽类和聚酮类等抗菌物质，由该菌株制成的功能型叶面肥水剂渗入柑橘植株体内后，其产生的脂肽类能嵌入黄龙病菌和溃疡病菌的胞膜，从而导致膜结构损伤，扰乱这两种病菌细胞膜对氨基酸的转运，进而阻碍细胞壁肽聚糖的生物合成；而其产生的聚酮类能抑制这两类病菌的蛋白质合成从而抑制病菌的正常生长，起到防病的效果，本发明的功能型叶面肥水剂可通过不同的途径分别对柑橘黄龙病和溃疡病起到防治的作用，防治效果很好。经试验，本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂稀释800倍后喷施于沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆，6个月防治效果菌大于99%，稀释至150倍后，分别于沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆的春梢、夏梢和秋梢上应用，春梢期的防治效果高达85.37%，夏稍期的防治效果高达87.28%，秋稍期的防治效果高达83.55%，表现出良好的柑橘黄龙病和溃疡病防治效果，此外，本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m还可产生吲哚乙酸，因此，由其制成的功能型叶面肥水剂渗入柑橘植株体内后，对柑橘植株具有促进生长的作用。
另外值得注意的是，柑橘植株由于自身内生菌彼此之间的共同进化，形成了特殊的保护机制而不被枯草芽孢杆菌Bs1218m所影响，在喷施本发明制成的功能型叶面肥水剂后，枯草芽孢杆菌Bs1218m在柑橘植株体内和其他内生菌共同发挥着保护柑橘植株的作用。
【生物保藏信息】
枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)，于2021年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.21805。
【附图说明】
图1为枯草芽孢杆菌Bs1218m的平板培养特征。
【具体实施方式】
下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例而已，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
本发明公开的枯草芽孢杆菌Bs1218m是从云南省华宁县盘溪温州蜜柑新津健康苗中分离获得，于不同时间段分离得到的菌株生理特性相同，该菌株的生物学特性如下：单个细胞0.6-0.8×2-3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏染色阳性，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆形，位于菌体中央。菌落表面粗糙不透明，污白色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭；好氧；可利用蛋白质、多种糖和淀粉，能分解色氨酸形成吲哚。结果发现本发明提供的菌株Bs1218m的16S rDNA基因序列与枯草芽孢杆菌菌株168的同源性最高，相似性达99%，结合生理生化测定从而确定分离出的菌株为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)。
通过试验研究枯草芽孢杆菌Bs1218m对柑橘黄龙病和溃疡病的防治效果，发现该菌株制成的菌剂对患有黄龙病及溃疡病的柑橘植株进行喷施处理，患病的柑橘植株症状得到缓解，表现出优良的柑橘黄龙病及溃疡病防治效果，同时还具有促进植株生长的作用。
以下实施例制成的功能型叶面肥水剂的使用方法为：
对于柑橘黄龙病，将功能型叶面肥水剂用清水稀释800倍后，在非雨天傍晚或上午8时之前喷施于柑橘叶片正反两面，每7-10天喷施一次，连续喷施3-6个月。
对于柑橘溃疡病，将功能型叶面肥水剂用清水稀释150倍后，在非雨天傍晚或上午8时之前喷施于柑橘叶片正反两面，每7-10天喷施一次，连续喷施2-4次。
实施例
本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21805，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)。
一种如上所述枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，将所述枯草芽孢杆菌Bs1218m制成功能型叶面肥水剂后应用于柑橘黄龙病和溃疡病的防治，所述功能型叶面肥水剂的制备方法包括以下步骤：
（1）先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，接着挑取1μL枯草芽孢杆菌Bs1218m菌接种到三角瓶内的培养基中，得到接种培养瓶。
（2）将步骤（1）得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的条件下培养24h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液。
（3）将步骤（2）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液按发酵罐中培养基体积的2%的量转接到发酵罐中，并在转速为100r/min、温度为35℃的条件下进行培养30h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液。
（4）按质量百分比，分别取步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液2%的氮酮和10%的吐温20，将氮酮和吐温20加入所述枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液中，搅拌均匀即得到功能型叶面肥水剂。
其中，上述功能型叶面肥水剂的制备方法中，每1L步骤（1）至步骤（3）中所述培养基主要由以下质量的组分制成：黄豆粉16g、玉米粉5g、蔗糖5g、鱼粉3g、蛋白胨2g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g和阿维菌素0.3g。
所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
本发明中，按上述方法制备上述功能型叶面肥水剂，步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液的菌株浓度范围在2×1010-3×1010CFU/ml之间。
效果验证
为了进一步说明本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂的推广应用价值，按上述方法制成功能型叶面肥水剂后对其防治柑橘黄龙病、柑橘溃疡病以及促进生长作用3项指标进行评定。
（一）柑橘黄龙病防治及促生长效果验证
（1）验证方法
以上述制成的功能型叶面肥水剂产品为试验产品，分别以患有黄龙病的沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆3种果树为产品的试验对象，每一种果树选取8株4年生的患有黄龙病的柑橘植株，分为2组，每一组4株，一组作为实验组，另一组作为对照组；将上述制成的功能型叶面肥水剂稀释800倍后喷施于3种果树的实验组，其中每一棵果树喷施稀释后功能型叶面肥水剂的量为500mL，每种果树的对照组中每一棵喷施500mL清水，每一组中其中2棵喷施的时间为无雨天的清晨6-8点，另外2棵喷施时间为无雨天傍晚6-7点。每7天喷施一次，连续喷施6个月。
（2）评价方法
黄龙病防治效果评价：在喷施前和最后一次喷施7天以后，分别采集各实验组植株的上、中、下、东、南、西、北、中8个不同部位成熟叶和嫩叶各2片，按照国标方法《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》（GB/T28062-2011）做定量PCR检测各棵植株叶片内黄龙病菌含量，统计每个试验组平均每棵柑橘植株喷施试验产品前后的黄龙病菌含量以及病菌下降率和防治效果，并记录于如下表1中。其中，防计算按式（1）、式（2）计算：
病菌下降率（%）=[施肥前拷贝数-施肥后拷贝数]×100/施肥前拷贝数 (1)
防治效果（%）=[PT-CK]×100/[100-CK] (2)
式中：
PT——施肥处理区病菌下降率；
CK——空白对照区病菌下降率。
该浓度下促生长效果评价：分别测量每种果树各个试验组中在喷施前及喷施最后一次7天后每一棵植株上5个一季生枝条的长度，不考虑各枝条侧枝长度，以该5个枝条的平均长度为该植株的枝条长度，统计3种果树的每个试验组试验植株喷施前后的平均枝条长度，并统计相应的枝条增长率和增长效果，记录于表2中。其中，枝条增长率和增长效果的计算方法如下：
枝条增长率（%）=（处理后的长度-处理前的长度）×100/处理前的长度 （1）
增长效果（%）=（处理枝条增长率-空白对照枝条增长率）×100/空白对照枝条增长率 （2）
（3）试验结果
表1 柑橘黄龙病防治效果
Figure 36282DEST_PATH_IMAGE001
本发明功能型叶面肥水剂稀释800倍后对植株的生长影响效果如下：
表2 产品稀释800倍后促生长效果
Figure 15739DEST_PATH_IMAGE002
以上表1、表2数据看出，由本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂产品对沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆等柑橘类果树的黄龙病具有很好的防治效果，于无雨的早晨8点前或傍晚太阳落山后，将该产品稀释800倍后喷施于上述3种试验果树上植株叶片上，每10天1次，连续6个月后，罹患黄龙病的沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆3种植株叶片中脉中的黄龙病菌含量远远低于空白对照组，枝条增长率及增长效果也远优于对照组，表现出高效的黄龙病防治效果，在防治黄龙病的同时促进植株的生长。
（二）柑橘溃疡病效果及促生长效果验证
（1）验证方法：
以上述方法制成的功能型叶面肥水剂产品为试验产品，分别以患有溃疡病的沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆3种果树为产品的试验对象，每一种果树选取24株4年生的患有溃疡病的柑橘植株，分为3组，每一组8株，一组作为实验组实验对象，另外两组分别作为阳性对照组和空白对照组的实验对象；具体为：
将上述方法制成的功能型叶面肥水剂稀释150倍后喷施于实验组的柑橘植株，其中，每一棵植株喷施稀释后的功能型叶面肥水剂的量为500mL，阳性对照组喷施稀释2000倍的77%氢氧化铜水分散粒剂，其中每一棵植株喷施的量为稀释后的量为500mL，空白对照组每一棵喷施500mL清水，每一组中的4棵喷施的时间为无雨天的清晨6-8点，另外4棵喷施时间为无雨天傍晚6-7点。每7天喷施一次，将植株叶片正反两面至湿润，连续喷施3次。
（2）评价方法：
溃疡病防治效果评价：在喷施前和最后一次喷施10天以后，分别采集各试验组植株的东南西北中5点取样，每点调查2个枝梢上的全部叶片，分别计算3种果树每个试验组植株叶片的发病级数，病分别计算各果树种类春梢、夏稍和秋稍的平均病情指数和平均防效，并分别记录于表3-5中。
分级标准：
0级：无病斑
1级：每叶有病斑1-5个
3级：每叶有病斑6-10个
5级：每叶有病斑11-15个
7级：每叶有病斑16-20个
9级：每叶有病斑21个以上
病情指数计算公式：
病情指数=100×∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×９）
防治效果（%）=
Figure 857793DEST_PATH_IMAGE003
式中：
CK0—空白对照区施药前病情指数；
CK1—空白对照区施药后病情指数；
PT0—药剂处理区施药前病情指数；
PT1—药剂处理区施药后病情指数。
该浓度下促生长效果评价：在施用前，于各植株上留5个枝条，分别测量实验组和空白对照组每种果树各试验组在喷施前及喷施最后一次7天后每个枝条的长度，以该5个枝条的平均长度为该植株的枝条长度，分别统计3种果树各个试验组的植株在春梢期、夏稍期及秋稍期喷施前后的平均枝条长度，并分别统计相应的枝条增长率和增长效果，记录于表6-表8中。其中，枝条增长率和增长效果的计算方法如下：
枝条增长率（%）=（处理后的长度-处理前的长度）×100/处理前的长度 （1）
增长效果（%）=（处理枝条增长率-空白对照枝条增长率）×100/空白对照枝条增长率 （2）
（3）试验结果
溃疡病防治效果试验结果如下：
表3 沃柑的溃疡病防治效果
Figure 253002DEST_PATH_IMAGE004
表4 砂糖橘的溃疡病防治效果
Figure 192008DEST_PATH_IMAGE005
表5 脐橙纽荷姆的溃疡病防治效果
Figure 76788DEST_PATH_IMAGE006
以上表3-表5数据可看出，由本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂产品对沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆等柑橘类果树的溃疡病具有很好的防治效果，于溃疡病发生初期，在上述3种果树的春梢、夏梢和秋梢上应用，防治效果显然优于两个对照组，表现出高效的柑橘类果树溃疡病防治效果。
该浓度下对植株春梢、夏稍及秋稍期的促进生长试验结果如下：
表6 产品稀释150倍后对柑橘类果树春梢期的促生长效果
Figure 343821DEST_PATH_IMAGE007
表7 产品稀释150倍后对柑橘类果树夏梢期的促生长效果
Figure 670285DEST_PATH_IMAGE008
表8 产品稀释150倍后对柑橘类果树秋梢期的促生长效果
Figure 401480DEST_PATH_IMAGE009
以上数据说明，由本发明提供的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂产品在柑橘春梢期、夏稍期及秋稍期喷施于植株用于防治柑橘溃疡病的同时，对柑橘植株具有良好的生长促进作用。
综上所述，由本发明公开的枯草芽孢杆菌Bs1218m制成的功能型叶面肥水剂产品经稀释800倍后对沃柑、砂糖橘和脐橙纽荷姆等柑橘类果树的黄龙病具有优良的防治效果，稀释150倍后对柑橘类果树溃疡病的防治效果显著，且在防治柑橘黄龙病或溃疡病的同时对植株还具有明显的促进生长作用，具有较高的推广价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.枯草芽孢杆菌Bs1218m，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Bs1218m保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21805，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bs1218m(Bacillus subtilis Bs1218m)。
2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：将所述枯草芽孢杆菌Bs1218m制成功能型叶面肥水剂后应用于柑橘黄龙病和溃疡病的防治，所述功能型叶面肥水剂的制备方法包括以下步骤：
先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，接着挑取1μL枯草芽孢杆菌Bs1218m菌接种到三角瓶内的培养基中，得到接种培养瓶；
将步骤（1）得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的条件下培养24h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液；
将步骤（2）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m种子发酵液按发酵罐中培养基体积的2%的量转接到发酵罐中，并在转速为100r/min、温度为35℃的条件下进行培养30h，得到枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液；
按质量百分比，分别取步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液2%的氮酮和10%的吐温20，将氮酮和吐温20加入所述枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液中，搅拌均匀即得到功能型叶面肥水剂。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，每1L步骤（1）至步骤（3）中所述培养基主要由以下质量的组分制成：黄豆粉16g、玉米粉5g、蔗糖5g、鱼粉3g、蛋白胨2g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g和阿维菌素0.3g。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
5.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，步骤（1）所述三角瓶的容积为200mL，其内加入所述培养基的量为100mL。
6.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：所述功能型叶面肥水剂的制备方法中，步骤（3）得到的枯草芽孢杆菌Bs1218m发酵液的菌株浓度为2×1010-3×1010CFU/ml。
7.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Bs1218m的应用，其特征在于：所述功能型叶面肥水剂稀释800倍后用于防治柑橘黄龙病或稀释150倍后用于防治柑橘溃疡病，并促进植株的生长。
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