CN104920475B - 一种防治核桃基腐病的生防菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治核桃基腐病的生防菌剂及其制备方法，涉及生防制剂领域，本发明的生防菌剂的成品中是活菌总浓度为1.6×10⁸‑3.8×10¹⁰CFU/mL的生防菌株GY‑11，其菌种保藏号为CGMCC No.10809。本发明的生防菌剂对植物生长无不良影响，具有抑制核桃基腐病病原菌的效果，其对核桃基腐病病原菌的抑制率可达80％以上，对核桃基腐病具有高效、显著的防治效果，有良好的应用前景和市场价值。

Description

一种防治核桃基腐病的生防菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生防治剂，特别涉及一种以拮抗核桃基腐病病原菌的枯草芽孢杆菌为主要成分的生防治剂及其制备方法。

背景技术

核桃(Juglans regia L.)属落叶乔木，是我国重要的经济树种，具有丰富的营养价值和保健功能，可制取食用油和制作各种食品。核桃作为新疆的第二大果树，栽培面积占全疆林果总面积的四分之一，核桃产业已成为新疆农民致富增收的重要支柱产业之一。核桃适生范围广，常被栽植于山区和田园，是重要的用材树种和生态树种。近几年，随着新疆核桃种植面积逐渐扩大，大面积种植单一品种、管理粗放以及栽培模式等原因，病虫害问题日益增多，核桃基腐病(Pythium oligandrum Drechsler)的大面积严重发生制约了新疆核桃产业的健康发展，核桃基腐病与腐烂病有本质的区别，核桃腐烂病主要危害支杆的皮层，皮层上面产生小黑点。

目前，防治核桃基腐病的方法主要以化学方法为主，通过大田试验筛选出了咪酰胺等防效较好的药剂。常规的化学药剂在防治核桃基腐病方面，有经济、高效和方便等优势，但其易环境污染，不利于打造生态健康果园。最近几年通过生防菌株防治果树病害已成为一种重要的防治手段，目前应用较多的拮抗细菌主要有芽孢杆菌Bacillus subtilis、假单胞杆菌Pseudomonas spp.、土壤放射杆菌Agrobacterium radiobacter等。然而通过拮抗菌株防治核桃基腐病的研究尚未见报道。因此，筛选出抗菌谱广、生防活性高及对环境安全的新型拮抗细菌，制备成高效的生防菌剂，对该病害的防治具有重要意义。本申请从分离核桃基腐病病原菌过程中得到的细菌与病原菌通过平板对峙培养法筛选出抑制效果较好的生防细菌，并对其进行种类鉴定，将分离得到的生防细菌制备成生防菌株，实现菌株的应用。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种防治核桃基腐病的菌株。

本发明进一步提供利用上述菌株制备的生防菌剂。

本发明进一步提供上述生防菌剂的制备方法。

本发明进一步提供利用上述生防菌剂的防治方法。

本发明人等从新疆和田地区墨玉县采集得的核桃基腐病病害标本中分离出一种属于枯草芽孢杆的菌株，发现该菌株对植物生长无不良影响，具有抑制核桃基腐病病原菌的效果，并由此完成了本发明。

本发明涉及以下的菌株和核桃基腐病生防菌剂、生防菌剂的制备方法以及利用生防菌剂防治核桃基腐病的方法。

(1)枯草芽孢杆菌菌株GY-11。

(2)含有芽孢杆菌菌株GY-11作为有效菌的核桃基腐病生防菌剂。

(3)使用上述(2)中记载的核桃基腐病生防剂进行防治核桃基腐病的防治方法，。

[枯草芽孢杆菌菌株GY-11的分离与保藏]

本发明的枯草芽孢杆菌菌株GY-11是从新疆和田地区墨玉县采集的核桃基腐病病害标本中分离出的菌株。

具体的，本发明是通过以下步骤得到核桃基腐病拮抗菌菌株GY-11的：

(1)拮抗菌株的分离：将核桃基腐病病害标本材料的病健交界部位切成5mm的组织块，先用75％乙醇消毒该组织块30s，立即取出，再置于1％次氯酸钠消毒90s，最后用无菌水冲洗3次后利用灭菌滤纸将组织块表面的水吸干，得到消毒后的组织块。将消毒后的组织块在PDA培养基上进行培养，培养温度为28℃恒温培养，每24h观察一次，当观察到组织块周围出现抑菌圈时，使用划线法将抑菌圈的的细菌菌落纯化在NA平板上，得到单菌落，最后将得到的单菌落于4℃保存。

(2)拮抗菌株的筛选：将分离得到的单菌落进行活化培养，在距离病原菌2.0cm处等距离地将所述单菌落划线至已接种核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌的PDA平板培养基为对照，每个处理3个重复。28℃恒温培养，待对照的平板培养基的菌丝即将长满时，测量细菌菌株与病原菌之间的抑菌带宽度，得到对核桃基腐病病菌抑菌带最宽的拮抗菌株GY-11。

其中，所述PDA培养基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然。

其中，所述NA培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

该菌株根据其后所述的培养特征和生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》的描述，结合分子生物学结果，确定拮抗菌株GY-11为枯草芽孢杆菌的新菌株，于2015年5月14日作为“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GY-11”保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

(a)形态学性质

形态：杆状

大小：0.7～0.8×2～3μm

运动性：+

鞭毛着生状态：周生

芽孢形态：椭圆

芽孢大小：0.6～0.9×1.0～1.5μm

(b)培养性质

菌落形状：圆形

菌落颜色：乳白色

液体培养基培养：乳白色，白色边缘不圆滑似圆形，表层不规则突起，褶皱明显。

(c)生理学性质

革兰氏染色：+

接触酶试验：+

VP实验：+

甲基红试验：+

淀粉水解：+

柠檬酸的利用：+

卵磷脂试验：-

菌膜形成试验：+

吲哚物质的生成：-

好氧兼性厌氧测定：-

硫化氢的产生：-

硝酸盐的还原：-

2％NaCl：++

5％NaCl：++++

7％NaCl：++++

10％NaCl：++

需要说明的是，“+”代表阳性，“-”代表阴性，“++”代表生长一般，“++++”代表生长最适。

(d)分类学性质

菌株GY-11与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性为99％，在GenBank注册的序列号为KP876486。从基于邻接法构建的16S rDNA系统发育树(如图2所示)可以发现；菌株GY-11与模式菌株枯草芽孢杆菌(KF496886)聚类在同一大分支内(支持率99％)，并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株GY-11为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

[GY-11菌株的培养]

有关本发明的GY-11菌株的培养方法可以选择任何适宜的培养基和培养条件。此外，除液体培养基之外可以使用加入了琼脂的斜面培养基和平板培养基等固体培养基。通过培养使GY-11菌株增殖以获得所需的菌体量。

培养基中的碳源可以利用所述GY-11菌株可以同化的所有物质。具体地说，除葡萄糖、半乳糖、D-土塘、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物、淀粉水解物等糖之外，还有GY-11可以利用的各种合成或天然碳源，但是不包括乙酸。

培养基中的氮源，同样的，除含有有机氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、谷氨酸、酵母膏、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化铵、硝酸钙、天冬氨酸、亚硝酸钠之外，还可以是GY-11菌株可以利用的各种合成或天然氮源，但是不包括尿素。

根据常规的微生物培养方法，必要时可以相应地添加NaCl、磷酸盐等无机盐类、钙、镁、铁等金属盐，维生素、氨基酸等微量营养源。

培养可以在摇床培养、震荡培养、通气培养等好氧条件下进行。培养温度为20～40℃，优选25～30℃，进一步优选为25℃；pH5～9，优选6～7，进一步优选为7；培养时间24-48h，优选24h为宜，其中，摇床培养的转速为120-220r/min，优选160-200r/min，进一步优选为180r/min。

为实现本发明的另一目的，本发明提供的一种防治核桃基腐病的生防菌剂是由保藏号为CGMCC No.10809的生防菌株GY-11制备而成，其中，生防菌剂中的活菌总浓度为1.6×10⁸-3.8×10¹⁰CFU/mL。

为实现本发明再一目的，本发明提供的生防菌剂的制备方法，是将菌种保藏号为CGMCC No.10809的生防菌株GY-11在培养基中震荡培养，经离心处理后，将沉淀用灭菌水稀释成GY-11活菌总浓度为1.6×10⁸-3.8×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

其中，所述培养基选择NA培养基、NB培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种。

优选地，所述培养基为NB培养基和LB培养基。

其中，所述震荡培养的培养温度为20℃-40℃。

优选地，所述震荡培养的培养温度为25℃。

其中，所述离心处理的转速为120r/min-220r/min。

优选地，所述离心处理的转速为180r/min。

其中，所述培养基的起始pH值为5-9。

优选地，所述培养基的起始pH值为7。

为实现发明的再一目的，本发明提供的利用生防菌剂防治核桃基腐病的方法是：可以直接施用于核桃基腐病发病部位，也可以用水等稀释后施用于核桃基腐病发病部位。

本发明利用新疆和田地区墨玉县采集得的核桃基腐病病害标本中分离出一种枯草芽孢杆菌株GY-11对核桃基腐病病原菌具有高效的抑制作用，并且利用该菌株制备的生防菌剂对核桃基腐病的防治有良好的效果能使核桃基腐病病原菌正常的菌丝隔膜发生断裂、解体，从而抑制菌丝的生长，其抑制率均在80％以上；由于该菌株对温度、pH值等自然环境条件的适应范围广，因此该菌株的便于培养，生防菌剂的制备简单易行。

附图说明

图1是本发明的核桃基腐病拮抗菌株Bacillus subtilis GY-11在不同时间段的生长曲线；

图2本发明的核桃基腐病拮抗菌株Bacillus subtilis GY-11的革兰氏染色后的菌体形态图

图3是本发明的核桃基腐病拮抗菌株Bacillus subtilis GY-11的菌落形态图；

图4是基于16S rDNA对菌株GY-11的系统发育树；

图5表示不同装液量对菌株GY-11发酵的影响；

图6表示不同接种量对菌株GY-11发酵的影响；

图7表示不同初始pH值对菌株GY-11发酵的影响；

图8表示不同温度对菌株GY-11发酵的影响；

图9表示不同转速对菌株GY-11发酵的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

需要说明的是，有关本发明的GY-11菌株的培养方法还可以选择任何适宜的培养基和培养条件。牛肉膏蛋白胨培养基、NA培养基、LB培养基之类的一般培养基外。此外，除液体培养基之外可以使用加入了琼脂的斜面培养基和平板培养基等固体培养基。通过培养使GY-11菌株增殖以获得所需的菌体量。

需要说明的是，培养基中的碳源可以利用所述GY-11菌株可以同化的所有物质。具体地说，除葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物、淀粉水解物等糖之外，还有GY-11可以利用的各种合成或天然碳源，但是不包括乙酸。

需要说明的是，培养基中的氮源，同样的，除含有有机氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、谷氨酸、酵母膏、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化铵、硝酸钙、天冬氨酸、亚硝酸钠之外，还可以是GY-11菌株可以利用的各种合成或天然氮源，但是不包括尿素。

需要说明的是，根据常规的微生物培养方法，必要时可以相应地添加NaCl、磷酸盐等无机盐类、钙、镁、铁等金属盐，维生素、氨基酸等微量营养源。

需要说明的是，培养可以在摇床培养、震荡培养、通气培养等好氧条件下进行。培养温度为20～40℃，优选25～30℃，进一步优选为25℃；pH5～9，优选6～7，进一步优选为7；培养时间24-48h，优选24h为宜，其中，摇床培养的转速为120-220r/min，优选160-200r/min，进一步优选为180r/min。

需要说明的是，对于本发明的枯草芽孢杆菌GY-11，使其培养物(含有菌体)或其处理产物(培养物和其他成分混合物等)、或培养分离的菌体(培养物经离心分离所得的菌体或其他成分的混合物等)及其处理产物(培养分离的菌体和其它成分的混合物等)，以及有这些处理产物(这些的经液体或固体稀释的稀释物)存在于根、茎、叶、种子等植物体上，或存在于栽培土壤中，具有抑制核桃基腐病病原菌的性质。

需要说明的是，本发明的核桃基腐病生防剂是含有GY-11菌株为有效菌的生防剂。在本发明的生防剂可以使用GY-11菌，也可以将GY-11菌株和其变异体一起使用。变异体是具有上述GY-11菌株的细菌学性质、具有核桃基腐病防治作用的物质，可以利用自然突变株、用紫外线或化学诱变剂所得的突变株、或细胞融合株以及基因重组株。本发明中，在核桃基腐病生防剂中所含的GY-11菌株包括GY-11菌株的变异体。

需要说明的是，本说明书中所述的防治不仅指对病害的预防、抵制，也用于表示包含有去除、杀死的含义。因此，对于已感病的植物，应用本发明的植物病害生防剂可从植物中去除病原菌，也可以预防由病原菌引起的病害或病害的加重。

此外，本发明的核桃基腐病生防剂中的GY-11菌株除单独以菌体或培养物使用外，还可以作为用非活性的液体或固体载体稀释，必要时添加表面活性剂、其他助剂的药剂使用。具体的制剂例，例如粒剂、粉剂、水和剂、悬浊剂、乳剂等剂型。优选地载体，例如滑石、皂土、粘土、高岭土、硅藻土、白碳、蛭石、消石灰、硅砂、硫酸铵、尿素、多孔固体载体、水、异丙醇、二甲苯、环已酮、甲基萘、烷基二醇等以载体等。作为表面活性剂和分散剂，例如二萘基甲磺酸盐、乙醇硫酸酯盐、烷基芳基磺酸盐、木质素磺酸盐、聚氧乙烯二醇醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单烷基化合物等。作为助剂，例如羧甲基纤维素、聚乙二醇、丙二醇、阿拉伯胶、黄原胶等。作为保护剂，例如脱脂牛奶、pH缓冲剂等。此时，GY-11菌株活菌体的量和/或培养物的量、以及施用时期和适用量可根据上述应用活菌体的情况适宜的确定。

需要说明的是，本发明提供的生防剂可以直接施用，也可以用水等稀释后施用。所述生防剂的施用方法没有特别的限定，例如，直接向植物涂抹的方法等。此外，制剂的施用量优选根据施用方法、发生倾向、受害程度、环境条件、使用剂型等的不同作适当的调整。

需要说明的是，本发明使用的培养基如下：

碳源测定时用碳源基础培养基成分：每1000mL含有(NH₄)₂SO₄2.0g，NaH₂PO₄·H₂O0.5g，K₂HPO 40.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，pH7.0-7.2，分别加入0.5％～1％的葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、D-木糖、淀粉、乙醇丙三醇、甘露醇、山梨酸、乙酸和柠檬酸，或0.1％～0.2％的葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、D-木糖、淀粉、乙醇丙三醇、甘露醇、山梨酸、乙酸和柠檬酸，作为碳源。

氮源测定时用氮源基础培养基成分：每1000mL含有Na₂HPO₄2.16g，KH₂PO₄1.36g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄0.5g，CaCl₂5.00g，葡萄糖10g，pH7.0-7.2，分别加入0.05％～0.1％的蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸钙、磷酸二氢铵、亚硝酸钠、尿素、谷氨酸、天冬氨酸、硝酸钾、氯化铵作为氮源。

PDA培养基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然；NA培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2；LB培养基成分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2；NB培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2；高氏1号培养基成分：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO4·7H₂O 0.01g，蒸馏水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2；玉米粉培养基成分：玉米粉5g，蛋白胨0.1g，葡萄糖1g，蒸馏水调节总体积为1000mL，pH7.0-7.2；参考培养基1成分：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，葡萄糖10g，蒸馏水调节总体积为1000mL，pH7.0-7.2。

以下为本发明的具体实施例：

供试菌株：核桃基腐病病原菌由新疆农业大学林学与园艺学院病理实验室提供，采于新疆和田地区墨玉县的核桃树带病组织。

实施例1菌株的获得

1.拮抗菌株的分离

1.1病害标本的处理

将核桃基腐病病害标本材料的病健交界部位切成5mm的组织块，用75％乙醇消毒该组织块30s，立即取出并置于1％次氯酸钠消毒90s，最后用无菌水冲洗3次后利用灭菌滤纸吸取组织块表面的水分，得到消毒后的组织块。

1.2分离菌株

将得到的消毒后的组织块在PDA培养基进行培养，28℃恒温条件下，24h观察一次，当组织块周围长出抑菌圈时，使用划线法将所述抑菌圈的细菌菌落划线至NA平板培养基上进行纯化，得到单菌落，最后将得到的单菌落于4℃保存。

1.3拮抗菌株的筛选

将核桃基腐病病菌接种于PDA平板上，在28℃下培养3天，用直径5mm的打孔器打取菌落生长一致的菌块接种于PDA平板中央，将分离得到的细菌划线接于PDA平板中央的病原菌两侧的2.0cm处进行培养；以只接病原菌的PDA平板对照平板，28℃恒温培养，当观察到对照的PDA平板培养基中的菌丝即将长满时，测量接种拮抗菌菌株与病原菌之间的抑菌带宽度，计算抑制率，选择抑菌带最宽的菌株于4℃保存。

其中：

结果表明：核桃基腐病拮抗菌株Bacillus subtilis GY-11对核桃基腐病病原菌的抑制效果很好，抑菌带宽度较宽，抑制率可达80％。

2拮抗菌株的生长曲线的绘制

挑取抑菌带最宽的菌株的单菌落接种于容量为250mL、含有50mL NB培养基的三角瓶中，震荡培养24h，其中培养温度为28℃，震荡速率为180r/min，制得种子液。

取盛有50mL NB培养液的250mL三角瓶25个，分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48h，其中每个编号表示不同的培养时间。向所述编号的25个NB培养基中分别接种2mL的种子液，在温度条件为28℃下进行振荡培养，以灭菌的NB培养基为对照。

分别从对应时间编号的三角瓶取出培养液，测定不同培养时间的菌株OD₆₀₀值。根据测得的数值绘制生长曲线。(生长曲线如图1)所示。

结果表明：菌株GY-11在0～4h生长较慢，4～10h生长最快，菌株呈典型的对数生长；10～30h的时间段，菌体的生长量变化不大，达到稳定期；在30～48h菌株的生长量有明显的下降趋势，此后进入衰亡期。

3.拮抗菌株的鉴定

3.1菌株的形态学和生理生化特性的测定：

将活化后的菌株GY-11划线接种于NA平板上，28℃培养24h，观察菌落特征，同时挑取适量菌体进行革兰氏染色和形态观察。并参照《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》中介绍的方法，观察菌株及菌落形态，观察结果如图2和图3所示，测定拮抗细菌的需氧特征、NaCl耐受度、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、接触酶、V-P试验、甲基红试验、明胶液化等生理生化指标测得结果如表1所示。

用接种针分别挑取24h培养的菌株，分别接种于PDA、PSA的液体培养基和NB、LB培养基，封口，180r/min，28℃下振荡培养24h，测定OD₆₀₀值，观察菌株的最适培养基。

如表1所示，GY-11菌株的生理生化特性表明：菌株为革兰氏阳性菌，厌氧

表1菌株GY-11的生理生化特性

注释：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“++”代表生长缓慢，“+++”代表生长一般，“++++”代表生长最适。

菌，有氧条件下生长微弱；在含有5％或7％NaCl的液体培养基生长良好，盐度越高，生长缓慢，说明菌株耐盐性一般；菌株过氧化氢试验为阳性反应；可使明胶液化；有菌膜形成；甲基红试验呈阳性反应；V-P试验为红色，为阳性反应(如表1所示)。形态学与生理生化特性的鉴定结果表明，菌株GY-11与芽孢杆菌属的描述一致。

结果表明：菌株在不同培养基上生长存在一定差异，在NA培养基上生长最好，其次是PDA培养基。菌株GY-11在NA培养基上培养2d后观察，其单菌落为圆形(如图3所示)，乳白色，白色边缘不圆滑似圆形，表层不规则突起，褶皱明显；显微观察，菌体为杆状(如图2所示)，革兰氏染色呈现紫色，鞭毛特征不明，为革兰氏阳性菌。

3.2菌株的分子生物学鉴定

利用Promega公司的A1120DNA提取试剂盒提取菌株GY-11的DNA，提取方法按说明书中的步骤进行，设计引物Ⅰ63f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和引物Ⅱ1387r(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')，对提取得的DNA进行PCR扩增，其中反应体系如表2所示，反应条件如表3所示：

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

对获得的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶进行成像检测，由北京天根生物有限公司对产物进行测序，序列经ClustalX 1.83比对、校正和编辑后，用MEGA5.0软件中的NJ(Neighbor-Joining，邻接法)法构建系统发育树，应用自展法(bootstrap)检验系统树，自展数据集为1000次。以Amphibacillus xylanus作为外群。

将测序结果在GenBank数据库中进行同源性比对，BLAST结果表明，菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性为99％，在GenBank注册的序列号为KP876486。从基于邻接法构建的16SrDNA系统发育树(如图4所示)可以发现；菌株GY-11与模式菌株枯草芽孢杆菌(KF496886)聚类在同一大分支内(支持率99％)，并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株GY-11为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GY-11菌株已与2015年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No.10809。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GY-11菌株的保藏培养基为常规的NA培养基，培养温度为28℃。

实施例2菌株的发酵培养

1、病原菌的纯化

挑取保存于试管中的病原菌菌丝置于PDA平板中央，黑暗条件28℃恒温培养2-3d后备用。

2、菌株GY-11种子液的制备和发酵的制备

将菌株GY-11通过划线法活化置于NA培养基上，28℃恒温培养24h后，挑取单菌落接种装置有50mLNB培养基的250mL的三角瓶中，28℃、180r/min摇床培养24h制成种子液。

3、培养基的筛选

取1mL菌株GY-11的种子液分别接种至装有50mL已灭菌的PDA培养液、高氏一号培养液、玉米粉培养液、参考培养基的250mL的三角瓶中，28℃、180r/min摇床培养24h后，测定菌株在不同培养液中的OD₆₀₀值，测得结果如表4所示。

其中，OD₆₀₀值采用现有技术常用的测定方法，优选为紫外可见分光光度计进行测定。

表4不同培养基对菌株GY-11的影响

注：+表示适宜生长，-表示不适宜生长。

由表4可知，菌株GY-11在供试的6种培养基中均能生长，但在不同的培养基中的生长量存在显著差异，其中，LB培养基为菌株GY-11最适的培养基，NB次之，玉米粉培养基中菌体生长量最少。

4、菌株对不同碳源和氮源的利用

4.1碳源基础培养基的制备

参考《常见细菌系统鉴定手册》中的方法，再利用碳源基础培养基中分别加入不同的碳源：普糖糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、D-木糖、淀粉、乙醇丙三醇、甘露醇、山梨酸、乙酸和柠檬酸，碳源的最终浓度除糖醇类为0.5～1％之外，一般为0.1％～0.2％，制得含有不要同碳源的基础培养基。

4.2氮源基础培养基的制备

参考《常见细菌系统鉴定手册》中的方法，再利用氮源培养基中分别加入不同的氮源：蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸钙、磷酸二氢铵、亚硝酸钠、尿素、谷氨酸、天冬氨酸、硝酸钾、氯化铵，氮源浓度为0.05％～0.1％，制的不同氮源的基础培养基。

4.3接种

挑取菌环活化后的GY-11置于1mL无菌水中，震荡混匀制备成菌悬液，吸取10μl菌悬液，分别接种于含不同碳源和不同氮源的基础培养基的5mL试管中，设置不接菌的培养基为对照，28℃、转速180r/min摇床培养24h，记录菌株在不同碳源和氮源培养基中的OD600值，比较菌株GY-11对不同碳源和氮源的利用情况。测得结果如表5和表6所示。

表5不同碳源对拮抗细菌生长量的影响

注：+表示适宜生长，-表示不适宜生长。

由结果可知，菌株GY-11在以乙酸最为碳源时，菌体生长量为负，表明乙酸不适做碳源；当葡萄糖最为碳源时，菌体的生长量最大，淀粉、蔗糖和D-木糖次之，山梨醇和乙醇最低，因此葡萄糖为最佳碳源。

表6不同碳源对拮抗细菌生长量的影响

注：+表示适宜生长，-表示不适宜生长。

由表6可知，菌株在以尿素最为氮源时，菌体生长量为负，表面尿素不适合最为氮源，蛋白胨作为氮源时，生长量最大，硫酸铵、谷氨酸和酵母膏次之，天冬氨酸和亚硝酸钠最为氮源时生长量最低，可见，蛋白胨为GY-11的最佳氮源。

5装液量的确定

分别取30mL、50mL、70mL、90mL、110mL、130mL最适培养基加入250mL的三角瓶中,接种量为4％、pH为7、温度为28℃、转速为180r/min摇培24h后，测定菌体的生长量和菌株GY-11对病原菌的抑制率，每个处理3次重复。

测定方法如下：

菌体生长量的测定方法为：取菌株GY-11不同处理的发酵液，在分光光度计上测600nm菌液的OD值，以OD ₆₀₀值来表示菌体生长量的多少。

菌株GY-11对病原菌的抑制率的测定方法：在位于PDA平板直径三分之一处用直径为5mm的打孔器打孔，去除培养基。将不同处理得到的菌株GY-11的发酵液用0.22μm微孔滤膜过滤即得无菌滤液，取40uL体积的无菌滤液注入打孔处，以无菌培养基为对照；在已纯化有病原菌的PDA平板上，打取直径为5mm、菌龄一致的菌饼点接于已注入菌株GY-11菌悬液的PDA平板同一直径三分之二处，每个处理3次重复，28℃恒温培养，待对照长满时参考公式计算生长抑制率。计算结果如图5所示；

其中：

根据图6所示的计算结果，当250mL的三角瓶装液量为50mL时菌体的生物量到达最大，OD ₆₀₀值达1.863，产生的抑菌物质对病原菌的抑制率达到最高，为52.9％。当装液量达到70mL时，生物量开始下降，且抑菌活性也降低，说明菌株GY-11生长对通气量有一定的要求，装液量过少或过大，都不利于菌株的发酵。因此，250mL的三角瓶装液50mL为最佳装液量。

6、pH值对菌株GY-11生长量和抑菌效果的影响

将最适液体培养基的pH分别调至5、6、7、8、9并加入250mL的三角瓶中,在最优接种量和装液量条件下、28℃、180r/min摇培24h后，测定菌体的生长量和菌株GY-11对病原菌的抑制率。

测定方法如下：

菌体生长量的测定方法为：取菌株GY-11不同处理的发酵液，在分光光度计上测600nm菌液的OD值，以OD 600值来表示菌体生长量的多少。

菌株GY-11对病原菌的抑制率的测定方法：在位于PDA平板直径三分之一处用直径为5mm的打孔器打孔，去除培养基。将不同处理得到的菌株GY-11的发酵液用0.22μm微孔滤膜过滤即得无菌滤液，取40uL体积的无菌滤液注入打孔处，以无菌培养基为对照；在已纯化有病原菌的PDA平板上，打取直径为5mm的菌龄一致的菌饼点接于已注入菌株GY-11菌悬液的PDA平板同一直径三分之二处，每个处理3次重复，28℃恒温培养，待对照长满时参考公式计算生长抑制率。计算结果如图6所示；

其中：

根据图6所示的计算结果，菌株GY-11对pH的适应范围较宽，在pH为5-9的范围内，菌株均能生长。其中在pH为7时其生物量最大，OD ₆₀₀达到1.858。产生的抑菌物质对病原菌的抑制率达到最高，为50.6％。pH为8时，生物量与抑菌活性均明显下降，说明中性条件下有利于菌株的生长。因此，最适初始pH为7。

7、接种量对菌株GY-11生长量和抑菌效果的影响

在确定最优装液量后，分别按照装液量体积的2％、4％、6％、8％、10％接入种子液，pH为7、28℃、转速为180r/min摇培24h后，测定菌体的生长量和菌株GY-11对病原菌的抑制率，每个处理3次重复，测定方法如下：

菌体生长量的测定方法为：取菌株GY-11不同处理的发酵液，在分光光度计上测600nm菌液的OD值，以OD 600值来表示菌体生长量的多少。

菌株GY-11对病原菌的抑制率的测定方法：在位于PDA平板直径三分之一处用直径为5mm的打孔器打孔，去除培养基。将不同处理得到的菌株GY-11的发酵液用0.22μm微孔滤膜过滤即得无菌滤液，取40uL体积的无菌滤液注入打孔处，以无菌培养基为对照；在已纯化有病原菌的PDA平板上，打取直径为5mm的菌龄一致的菌饼点接于已注入菌株GY-11菌悬液的PDA平板同一直径三分之二处，每个处理3次重复，28℃恒温培养，待对照长满时参考公式计算生长抑制率。计算结果如图7所示；

其中：

如图7所示的不同接种量对菌株GY-11发酵的影响，GY-11在接种量为2％-10％的范围内均具有抑菌活性，当接种量为6％时，其生物量达到最大，OD₆₀₀达1.903。产生的抑菌物质对病原菌的抑制率达到最高，为51.7％。当接种量为80％时，其生物量与抑菌活性均呈下降趋势，可能由于接种量过大，导致培养基营养成分过度消耗，因此最适接种量为6％。

8、温度对菌株GY-11生长量和抑菌效果的影响

将最适液体培养基分别放置在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的温度下，在最优接种量、装液量为、pH的条件下，180r/min摇培24h后，测定菌体的生长量和菌株GY-11对病原菌的抑制率。

测定方法如下：

菌体生长量的测定方法为：取菌株GY-11不同处理的发酵液，在分光光度计上测600nm菌液的OD值，以OD 600值来表示菌体生长量的多少。

菌株GY-11对病原菌的抑制率的测定方法：在位于PDA平板直径三分之一处用直径为5mm的打孔器打孔，去除培养基。将不同处理得到的菌株GY-11的发酵液用0.22μm微孔滤膜过滤即得无菌滤液，取40uL体积的无菌滤液注入打孔处，以无菌培养基为对照；在已纯化有病原菌的PDA平板上，打取直径为5mm、菌龄一致的菌饼，点接于已注入菌株GY-11菌悬液的PDA平板的同一直径的三分之二处，每个处理3次重复，28℃恒温培养，待对照长满时参考公式计算生长抑制率。计算结果如图8所示；

其中：

根据图8所示的计算结果，菌株GY-11在20-40℃范围内均可生长，产生的抑菌物质对病菌的抑制率均在40％以上。其中在25℃时菌株GY-11的生物量达到最大值，OD₆₀₀为1.895，菌株产生的抑菌物质对病菌的抑制率也达到最高值，为51.8％(图4)，30℃时生物量和抑制率开始下降。25℃为最适发酵温度。

9、转速对菌株GY-11生长量和抑菌效果的影响

将最适液体培养基分别放置于不同转速下：140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min，在最优接种量、装液量、pH、温度的条件下培养24h后，测定菌体的生长量和菌株GY-11对病原菌的抑制率。

测定方法如下：

菌体生长量的测定方法为：取菌株GY-11不同处理的发酵液，在分光光度计上测波长为600nm处菌液的OD值，以OD ₆₀₀值来表示菌体生长量的多少。

菌株GY-11对病原菌的抑制率的测定方法：在位于PDA平板直径三分之一处用直径为5mm的打孔器打孔，去除培养基。将不同处理得到的菌株GY-11的发酵液用0.22μm微孔滤膜过滤即得无菌滤液，取40uL体积的无菌滤液注入打孔处，以无菌培养基为对照；在已纯化有病原菌的PDA平板上，打取直径为5mm的菌龄一致的菌饼点接于已注入菌株GY-11菌悬液的PDA平板同一直径三分之二处，每个处理3次重复，28℃恒温培养，待对照长满时参考公式计算生长抑制率。计算结果如图9所示；

其中：

根据图9的计算结果，摇培的转速对菌体的生物量有很大的影响，摇培能更好使得菌体与氧气充分接触。菌株GY-11在120r/min-220r/min范围内产生的抑菌物质均能对病原菌起到抑制作用。当转速为180r/min时，生物量达到最大，OD 600值为1.721，抑菌物质对病原菌的抑制率达到最高。因此，最适转速为180r/min。

实施例3生防菌剂的制备

将菌种保藏号为CGMCC No.10809的生防菌株GY-11在pH为7的NB培养基中震荡培养，培养温度是25℃，经180r/min的转速离心处理24h后，将沉淀用灭菌水稀释成GY-11活菌总浓度为1.6×10⁸-3.8×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

需要说明的是培养基还可以使用NA培养基、NB培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种；所述震荡培养的培养温度在20℃-40℃的范围内都适用于本发明；所述离心处理的转速在120r/min-220r/min的范围都适用于本发明；所述培养基的起始pH值在5-9的范围内都适用于本发明。

实施例4生防菌剂对核桃基腐病的防治效果

试验地概况：新疆和田地区墨玉县的核桃地，栽植时间为2004年，主要品种为温185。

在施用生防菌剂前刮除病斑，将实施例3制备的生防菌剂涂抹于病斑上作为处理组，以未涂抹任何药剂的核桃树为对照组CK。一个月后调查试验处理病斑的复发率，并记录试验数据(结果如表7所示)，计算病斑复发率、防治效果，其中：

病斑复发率(％)＝病斑复合块数/调查病斑块数×100％；

防治效果＝(CK病斑复发率-病斑复发率)/CK病斑复发率×100％。

表7试验结果

指标	处理组	对照组CK1
			病斑复发率(％)	10.7	100
防治效果(％)	89.3	0

根据一个月后的调查结果显示，使用本发明提供的生防菌剂的涂抹于核桃基腐病发病部位，其病斑复发率为10.7％，防治效果达到了89.3％，说明本发明的生防菌剂对核桃基腐病具有较好的防效。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种防治核桃基腐病的生防菌剂，其特征在于，菌剂成品中菌种保藏号为CGMCCNo.10809的生防菌株GY-11的活菌总浓度为1.6×10⁸-3.8×10¹⁰CFU/mL。

2.如权利要求1所述的生防菌剂，其特征在于，所述菌种保藏号为CGMCC No.10809的生防菌株GY-11的分类命名是：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；保藏时间是2015年5月14日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

3.一种如权利要求1所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的菌种保藏号为CGMCC No.10809的生防菌株GY-11在培养基中震荡培养，经离心处理后，将沉淀用灭菌水稀释成GY-11活菌总浓度为1.6×10⁸-3.8×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基选择NA培养基、NB培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述震荡培养的培养温度为20℃-40℃。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述离心处理的转速为120r/min-220r/min。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基的起始pH值为5-9。

8.如权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种GY-11通过以下步骤获得：

从核桃基腐病病害标本材料的病健交界部位采集带病组织块，并进行消毒处理，得到消毒后的带病组织块；

将所述带病组织块在培养基上进行培养，当所述组织块周围出现抑菌圈时，使用划线法将所述抑菌圈的菌落划线至NA平板培养基上进行纯化，得到单菌落。

9.如权利要求1所述的生防菌剂在拮抗核桃基腐病病原菌中的应用。