CN110982711B - 一种开放式生产木霉固体菌种的方法 - Google Patents

一种开放式生产木霉固体菌种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种开放式生产木霉固体菌种的方法。该方法包括向粉状植物源材料中加入全价氨基酸稀释液，充分混匀，调节混合物pH值至1.0～1.8，静置10～12小时，待pH稳定后向其中接种贵州木霉NJAU4742发酵液，充分混匀后将其置于底部布满小孔的浅盘或透气性膜上，布料厚度2～4cm，再将已布料的浅盘或膜置于盘架内，保持发酵空间温度28～30℃，湿度75～90％RH，让其发酵3～5天，即可获得木霉固体菌种。在发酵物料和工厂化的生产空间均无需灭菌条件下开放式生产木霉固体菌种，产品菌种数量高，杂菌率不到10％，远远低于农用微生物菌剂标准中杂菌率，生产成本为传统木霉固体发酵技术的1/5。

Description

一种开放式生产木霉固体菌种的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种开放式生产木霉固体菌种的方法。
背景技术
培肥土壤地力特别是土壤生物地力，是现代农业可持续发展面临的一个重要关键共性技术问题。现代农业生产中，施用有机肥、生物有机肥料和微生物制剂是培肥土壤地力的有效措施之一。
在土壤培肥中，当前微生物肥料或制剂产品一般以芽孢杆菌类作为功能微生物，普遍存在田间试验效果不稳定、菌种构成单一、功能菌株根际竞争力较弱等问题的困扰。
木霉具有生物量大、根表定殖能力强、次生代谢产物种类多和含量高、促生和生防效果显著的特点，在许多方面显示出比芽孢杆菌更好的效果。但木霉菌种在液体扩繁中不能有效产孢，且现有的固体扩繁工艺需要对发酵物料和生产空间进行严格灭菌，生产成本和市场价格较高，推广应用困难，成为制约木霉真菌固体菌种生产和推广的技术瓶颈。
发明人团队前期申请了一项中国专利CN105586279B，公开了一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法及制备的产品。该方法包括包括向作物秸秆中加入氨基酸稀释液后调节起始pH为3.0-4.0，陈化后接种木霉液体菌种进行固体发酵获得木霉固体菌种；其中发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％。按照该方法在200g作物秸秆与40ml氨基酸水解液混配后发酵9天，木霉含量可达到5.9×109个/g。但是CN105586279B的方法为实验室小试的方法，其固体发酵是在塑料饭盒中将秸秆加入木霉发酵液和氨基酸液后置于培养箱培养，整个环境比较小且密闭，当把发酵量放大以后，发现保持专利中的条件杂菌含量骤然升高，终产品无法达到109个/g数量级。而木霉固体菌种要走向产业化必然要进行放大化生产。因此，急需开发一种适用于工业化大生产的无需进行环境灭种的开放式生产木霉固体菌种的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种开放式生产木霉固体菌种的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种开放式生产木霉固体菌种的方法，向粉状植物源材料中加入全价氨基酸稀释液，充分混匀，调节混合物pH值至1.0～1.8，静置10～12小时，待pH稳定后向其中接种保藏号为CGMCC NO.12166的贵州木霉NJAU4742发酵液，充分混匀后将其置于底部布满小孔的浅盘或透气性膜上，布料厚度2～4cm，再将已布料的浅盘或膜置于盘架内，保持发酵空间温度28～30℃，湿度75～90％RH，让其发酵3～5天，即可获得木霉固体菌种；所述的粉状植物源材料选自作物秸秆或菇渣粉中的任意一种或多种。
作为本发明的一种优选，所述的全价氨基酸稀释液的稀释比例为10倍～20倍稀释，全价氨基酸稀释液与粉状植物源材料的体积质量比(升/公斤)为1.8～2.5：1。
作为本发明的一种优选，所述的全价氨基酸按照以下方法制备而成：(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H2SO4)为2.5-5mol·L-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，静置分层，收集中层的氨基酸溶液即得。氨基酸水解液含氨基酸和各种肽类物质约10％(g/100ml)及以上；含17种氨基酸、小肽和少量多肽，溶液呈强酸性，其游离氨基酸含量≥100g·L-1；或者直接购买江阴市鹏鹞联业生物科技有限公司生产的氨基酸水溶肥。
作为本发明的一种优选，对于当全价氨基酸溶液稀释10倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.3～1.8；当全价氨基酸溶液稀释20倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.0～1.6。
作为本发明的一种优选，所述的粉状植物源材料由含水量不超过10％的植物源材料而成，细度为3-4mm。
作为本发明的一种优选，所述的作物秸秆选自玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆或甜叶菊秸秆。
作为本发明的一种优选，调节混合物pH值的物质为浓硫酸(工业纯)或氢氧化钾(工业纯)。
作为本发明的一种优选，所述的NJAU4742发酵液中有效菌数量达到108CFU·mL-1，NJAU4742发酵液的添加量为粉状植物源材料质量的5％～15％(升/100公斤)。
按照本发明上述的方法制备的木霉固体菌种，产品指标符合农用微生物菌剂标准，其主要技术指标如下：木霉孢子浓度≥40亿/克，水分含量≤35％(实际含水量30％)，pH值5.7～5.8，杂菌率≤10％，细度≥92％；其无害化技术指标如下：粪大肠菌群数未检出，无蛔虫卵，有效期≥6个月。砷≤75mg/kg，镉≤10mg/kg，铅≤100mg/kg，铬≤150mg/kg，汞≤5mg/kg。
本发明所述的木霉固体菌种在农用微生物菌剂生产和/或木霉生物有机肥生产和/或木霉全元生物有机肥生产上的应用，在改善土壤微生物结构、增强土壤肥力和/或促进作物生长中的应用。
有益效果：
本发明以作物秸秆和有自主知识产权的具强耐酸能力的木霉菌株(NJAU4742，菌种保藏号：CGMCC NO.12166)以及酸解废弃蛋白获得的全价氨基酸溶液为原料，在发酵物料和工厂化的生产空间均无需灭菌条件下开放式生产木霉固体菌种，产品菌种数量高，杂菌率不到10％，远远低于农用微生物菌剂标准中杂菌率(要求低于20％)，生产成本为传统木霉固体发酵技术(发酵物料和生产空间均严格灭菌)的1/5。
较之CN105586279B实验室级别的规模，本发明方法能适用于工业化生产，目前已在淮安柴米河农业科技股份有限公司实现产业化，现在一个批次(3-5天)生产量为10吨,全年均可生产。CN105586279B的发酵时间需要7～10天，一般要9天，而本发明可将发酵时间缩短到3～5天，极大的提高了生产效率，显著降低了木霉固体菌种的生产成本。
综上，本发明为纯木霉的农用微生物菌剂产业化提供了技术，为纯木霉生物肥料产业化提供了产品。
附图说明
图1浅盘发酵生产木霉固体菌种的照片
图2利用无纺布生产木霉固体菌种的照片
具体实施方式
秸秆：玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、甜叶菊秸秆。
秸秆粉：由含水量不超过10％的秸秆粉粹而成，细度为3-4毫米。
全价氨基酸(AA)：由江苏省江阴市联业生物科技有限公司提供。全价氨基酸由废弃畜禽经酸解而成，含17种氨基酸、小肽和少量多肽，溶液呈强酸性，稀释250倍后pH值为2.5，其游离氨基酸含量≥100g·L-1。
木霉菌种：菌株NJAU4742，菌种保藏号：CGMCC NO.12166。
菌株NJAU4742的平板培养：将制备好的固体PDA培养基加热融化后倒入无菌培养皿中，待其再次凝固后接种木霉NJAU4742，28℃恒温培养箱中连续培养6～7天，待其长满整个平板后，置于4℃冰箱中保存，待用。
菌株NJAU4742发酵液制备：用打孔器在长满木霉的PDA的平板上取大小一致的木霉菌块，接种在PDA液体培养基中，在28℃，175rpm条件下连续振荡培养6天后的产物即为菌株NJAU4742发酵液，经稀释后用血球计数板测定木霉孢子数为2×107个·mL-1。
浓硫酸(工业纯)或氢氧化钾(工业纯)。
实施例1不同pH值混合物(为稀释不同倍数的全价氨基酸溶液与玉米秸秆粉的混合物)对菌株NJAU4742生长的影响
将稀释不同倍数的全价氨基酸溶液与玉米秸秆粉按体积/质量为2.5/1的比值充分混匀，静置11小时，调整混合物初始pH值(设置11个处理，每个处理重复三次，每个处理的玉米秸秆重量为5公斤)，按玉米秸秆粉质量的10％的接种量接种菌株NJAU4742发酵液，置于带孔的浅盘中(厚度3～4厘米)，控制空间温度28～30℃，湿度83％RH，让其发酵5天。用血球计数板记录孢子数，其结果见表1。
结果表明(表1)：不同稀释倍数的全价氨基酸溶液与玉米秸秆粉的混合物，在不同初始pH值下，木霉菌株NJAU4742生长不同，产孢数量也不同。随着全价氨基酸溶液稀释倍数的增加，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值逐步降低。如当全价氨基酸溶液稀释4倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.7～2.0；当全价氨基酸溶液稀释5倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.6～2.0；当全价氨基酸溶液稀释6.7倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.4～1.7；当全价氨基酸溶液稀释10倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.3～1.8；当全价氨基酸溶液稀释20倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.0～1.6。
表1木霉菌株NJAU4742在不同初始pH值的混合物中的产孢数量(×108个/克，含水量60％)
Figure BDA0002354340240000041
Figure BDA0002354340240000051
注：1、混合物由不同稀释倍数的全价氨基酸溶液与秸秆粉混合而成；
2、同一列中不同的字母代表在P<0.05水平有显著性差异(Duncan’s test,P<0.05)。
进一步检测各处理的杂菌数量来计算杂菌率(表2)，结果表明：不同稀释倍数的全价氨基酸溶液与玉米秸秆粉的混合物，在不同初始pH值下，接种木霉菌株NJAU4742后，不仅木霉菌株NJAU4742产孢数量不同，其杂菌生长也不同，杂菌率也不同。总的来说，混合物中全价氨基酸浓度越高，混合物初始pH值越高，环境中的杂菌越容易生长，本条件下，杂菌率未超过10％，远远低于农用微生物菌剂标准中杂菌率(不超过20％)。从有利于木霉菌株NJAU4742生长、降低生产成本及控制杂菌率的角度而言，建议全价氨基酸溶液的稀释20倍，混合物初始pH值控制在1.2～1.4。
表2不同初始pH值的混合物中接种木霉菌株NJAU4742后的杂菌率(％)
Figure BDA0002354340240000052
Figure BDA0002354340240000061
注：1、混合物由不同稀释倍数的全价氨基酸溶液与秸秆粉混合而成。
2、单一处理的玉米秸秆粉质量为5公斤，单一处理重复3次。
实施例2以不同种类秸秆和全价氨基酸为原料制备的混合物对木霉菌株NJAU4742产孢的影响
将稀释20倍数的全价氨基酸溶液与玉米/小麦/水稻秸秆粉按体积/质量为2.5/1的比值分别充分混匀(每种秸秆粉重复3次)，静置18小时，调整混合物初始pH值在1.2～1.4，按秸秆粉质量的5％的接种量接种木霉菌株NJAU4742发酵液，置于带孔的浅盘中(厚度3～4厘米)，控制空间温度28～30℃，湿度88％RH，让其发酵5天。用血球计数板记录孢子数，其结果见表3。
用四种秸秆(玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆)、甜叶菊及全价氨基酸溶液为原料制备的混合物，在上述发酵条件下进行木霉菌株NJAU4742固体发酵，四种混合物的固体发酵产物中，其木霉菌株NJAU4742的孢子浓度均达到了较高水平，其中以玉米秸秆与全价氨基酸溶液为原料制备的混合物固体发酵后的木霉菌株NJAU4742孢子浓度最高，以小麦秸秆与全价氨基酸溶液为原料制备的混合物固体发酵后的木霉菌株NJAU4742孢子浓度次之，以水稻秸秆或甜叶菊与全价氨基酸溶液为原料制备的混合物固体发酵后的木霉菌株NJAU4742孢子浓度居第三。表明这四种作物秸秆粉与全价氨基酸溶液稀释液制备的混合物均适宜于木霉菌株NJAU 4742的固体发酵，其产孢能力都较强，孢子浓度是农用微生物菌剂(含水量≤35％，孢子浓度≥2亿/克)标准要求中的16-37倍，含水量(30％)和杂菌率也低于其标准要求。
表4木霉菌株NJAU4742在以不同种类秸秆和全价氨基酸为原料的混合物中的产孢数量及其他指标
Figure BDA0002354340240000062
注：1、混合物由稀释20倍的全价氨基酸溶液与秸秆粉混合而成；
2、同一列中不同的字母代表在P<0.05水平有显著性差异(Duncan’s test,P<0.05)。
2、单一处理的秸秆粉质量为10公斤，单一处理重复3次。
实施例3含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂的中试生产
将稀释20倍数的全价氨基酸溶液与110公斤的玉米秸秆粉按体积/质量为2.5/1的比值充分混匀，静置12小时，调整混合物初始pH值在1.2～1.4，按秸秆粉质量的7％的接种量接种木霉菌株NJAU4742发酵液，置于带孔的浅盘中(厚度3～4厘米)，控制空间温度28～30℃，湿度83％RH，让其发酵5天。发酵结束后用血球计数板记数来计算菌株NJAU4742的孢子浓度，同时将发酵后物料摊开，待水分散失至35％以下，即为含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂。
该农用微生物菌剂的主要技术指标如下：木霉菌株NJAU4742孢子浓度为73.5亿/克，水分含量30％，pH值6.10，杂菌率6.3％，细度92％；其无害化技术指标如下：粪大肠菌群数未检出，无蛔虫卵，有效期≥6个月(表5)。砷≤75mg/kg，镉≤10mg/kg，铅≤100mg/kg，铬≤150mg/kg，汞≤5mg/kg。
表5含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂(含水量30％)货架期实验结果
Figure BDA0002354340240000071
注：菌株NJAU4742孢子浓度由用血球计数板记数后计算所得。
实施例4含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂的工厂化生产
将稀释20倍数的全价氨基酸溶液与5吨的玉米秸秆粉按体积/质量为2.5/1的比值充分混匀，静置11小时，调整混合物初始pH值在1.2～1.4，按秸秆粉质量的10％的接种量接种木霉菌株NJAU4742发酵液，置于带孔的透气性膜上(厚度3～4厘米)，控制空间温度28～30℃，湿度75％RH，让其发酵5天。发酵结束后用血球计数板记数来计算菌株NJAU4742的孢子浓度，同时将发酵后物料摊开，待水分散失至35％以下，即为工厂化生产含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂。
该农用微生物菌剂的主要技术指标如下：木霉菌株NJAU4742孢子浓度为73.2亿/克，水分含量30％，pH值6.14，杂菌率6.7％，细度92％；其无害化技术指标如下：粪大肠菌群数未检出，无蛔虫卵，有效期≥6个月(表6)。砷≤75mg/kg，镉≤10mg/kg，铅≤100mg/kg，铬≤150mg/kg，汞≤5mg/kg。
表6含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂(含水量30％)货架期实验结果
Figure BDA0002354340240000072
Figure BDA0002354340240000081
注：菌株NJAU4742孢子浓度由用血球计数板记数后计算所得。
实施例5含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂的工厂化生产
将稀释20倍数的全价氨基酸溶液与3吨的菇渣粉按体积/质量为2.5/1的比值充分混匀，静置11小时，调整混合物初始pH值在1.2～1.4，按菇渣粉质量的10％的接种量接种木霉菌株NJAU4742发酵液，置于带孔的透气性膜上(厚度3～4厘米)，控制空间温度28～30℃，湿度75％RH，让其发酵5天。发酵结束后用血球计数板记数来计算菌株NJAU4742的孢子浓度，同时将发酵后物料摊开，待水分散失至35％以下，即为工厂化生产含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂。
该农用微生物菌剂的主要技术指标如下：木霉菌株NJAU4742孢子浓度为71.9亿/克，水分含量30％，pH值6.71，杂菌率8.9％，细度90％；其无害化技术指标如下：粪大肠菌群数未检出，无蛔虫卵，有效期≥6个月(表7)。砷≤75mg/kg，镉≤10mg/kg，铅≤100mg/kg，铬≤150mg/kg，汞≤5mg/kg。
表7含木霉菌株NJAU4742的农用微生物菌剂(含水量30％)货架期实验结果
Figure BDA0002354340240000082
注：菌株NJAU4742孢子浓度由用血球计数板记数后计算所得。

Claims (5)

1.一种开放式生产木霉固体菌种的方法，其特征在于向粉状植物源材料中加入全价氨基酸稀释液，充分混匀，调节混合物pH值至1.0~1.8，静置10~12小时，待pH稳定后向其中接种保藏号为CGMCC NO.12166的贵州木霉NJAU4742发酵液，充分混匀后将其置于底部布满小孔的浅盘或透气性膜上，布料厚度2~4cm，再将已布料的浅盘或膜置于盘架内，无需灭菌条件下，保持发酵空间温度28~30℃，湿度75~90 %RH，让其发酵3~5天，即可获得木霉固体菌种；所述的粉状植物源材料选自作物秸秆或菇渣粉中的任意一种或多种；当全价氨基酸溶液的稀释倍数为10倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.3~1.8；当全价氨基酸溶液的稀释倍数为20倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.0~1.6；调节混合物pH值的物质为浓硫酸或氢氧化钾；所述的全价氨基酸按照以下方法制备而成：(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H2SO4)为2.5-5mol L-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，静置分层，收集中层的氨基酸溶液即得；氨基酸水解液含氨基酸和各种肽类物质共10％及以上；含17种氨基酸、小肽和少量多肽，溶液呈强酸性，其游离氨基酸含量≥100g·L-1。
2.根据权利要求1所述的开放式生产木霉固体菌种的方法，其特征在于当全价氨基酸溶液稀释20倍时，木霉菌株NJAU4742适宜生长产孢的初始pH值为1.2~1.4。
3.根据权利要求1所述的开放式生产木霉固体菌种的方法，其特征在于所述的粉状植物源材料由含水量不超过10%的植物源材料粉粹而成，细度为3-4mm。
4.根据权利要求1所述的开放式生产木霉固体菌种的方法，其特征在于所述的作物秸秆选自玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆、甜叶菊秸秆。
5.根据权利要求1所述的开放式生产木霉固体菌种的方法，其特征在于所述的NJAU4742发酵液中有效菌数量达到108 CFU·mL-1，NJAU4742发酵液的添加量为粉状植物源材料质量的5%~15%。
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