CN116970532B - 一株贪噬菌及其在促进植物生长中的应用 - Google Patents

一株贪噬菌及其在促进植物生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了贪噬菌(Variovorax sp.)C7，该菌株已于2022年12月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26201。该菌株具有溶磷、解钾、产铁载体的功能。将其接种在琼脂平板培养基及土壤中，能显著提高植物的生物量、促进植物生长。该贪噬菌C7能够显著增加植物侧根数和总根长，促进根系发育。该贪噬菌C7对油菜、萝卜、小白菜以及模式植物拟南芥都具有较好的促生效果，可将其用于制备微生物肥料菌剂及种子包衣、促根剂等，对作物的生长能起到良好的促进作用。

Description

一株贪噬菌及其在促进植物生长中的应用
技术领域
本发明属于微生物资源开发技术领域，涉及一株贪噬菌及其在促进植物生长中的应用。
背景技术
我国是化肥的生产和消费大国，随着我国农业生产的发展，对化肥的需求也在不断增加，然而过多施用化肥导致土壤酸化、土壤结构破坏、土壤重金属积累，氮磷等养分经过雨水淋洗进入水体，造成水体富营养化。因此，减少化肥投入、提高养分利用率是目前农业上亟待解决的关键性问题。
微生物作为植物根系的相互作用者，对植物的生长有重要的作用。施用有效的微生物制成的微生物肥料，不仅能促进植物生长，还可减少化肥的使用，有利于改善土壤重金属污染，帮助植物获取营养元素，并且在一定程度上增强作物对病原菌的抵抗能力。利用微生物菌肥结合耕作方式改变，可以降低碳足迹，减少温室气体排放，这与国家的双碳目标计划相吻合。可见，开发微生物菌种资源、研制微生物菌肥是减少化肥投入、提高养分利用效率的重要途径之一。
目前挖掘出来的有益微生物大都来自土壤、根际等植物体外的环境，而内生菌占据着植物组织内有利于营养供应和微环境适宜的生态位，较体外的环境更容易形成高效的养分吸收利用体系。因此，本研究分离油菜根系内生菌，建立油菜根系内生菌资源库，从库中筛选出了能够高效促进植物生长和根系发育的菌株，有望将来制成微生物菌肥。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株贪噬菌及其在促进植物生长中的应用，该菌株具有溶磷、解钾、产铁载体的促生特性，促进植物生长，可用于微生物菌剂肥料及种子包衣、促根剂的制备。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一株贪噬菌，其为贪噬菌(Variovorax sp.)C7，已于2022年12月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26201。
2、一种组合物，其包含前述贪噬菌。
3、一种制剂，其有效成分为前述贪噬菌。
4、前述贪噬菌、组合物或制剂在溶磷、解钾、产铁载体以及促进植物生长中的应用。
优选的，所述植物包括但不限于：油菜，萝卜，小白菜，拟南芥。
优选的，所述溶磷为溶解难溶磷、增加有效磷含量中的应用；所述难溶磷包括但不限于：磷酸钙，磷酸铝，磷酸铁。
优选的，促进植物生长包括：
(A)增加植物生长量；
(B)促进根系发育。
进一步优选的，步骤(B)包括：增加植物侧根数以及总根长。
5、前述贪噬菌、组合物或制剂在制备微生物菌肥、种子包衣或促根剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一株新的贪噬菌，即贪噬菌(Variovorax sp.)C7，该菌株已于2022年12月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26201。该菌株具有溶磷、解钾、产铁载体的功能。将其接种在琼脂平板培养基及土壤中，能显著提高植物的生物量、促进植物生长。该贪噬菌C7能够显著增加植物侧根数和总根长，促进根系发育。该贪噬菌C7对油菜、萝卜、小白菜以及模式植物拟南芥都具有较好的促生效果，可将其用于制备微生物肥料菌剂及种子包衣、促根剂等，对作物的生长能起到良好的促进作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
图1为TSB固体培养基上菌株C7的菌落形态图；
图2为基于16S rDNA序列同源性的菌株C7系统发育进化树；
图3为菌株C7在无机磷固体培养基上产生的溶磷圈；
图4为菌株C7在有机磷固体培养基上产生的溶磷圈；
图5为检测菌株C7产铁载体的结果图；
图6为菌株C7促进油菜种子发芽的图片；
图7为在琼脂平板培养基上接种C7后对油菜幼苗生长的影响；
图8为在琼脂平板培养基上接种C7对油菜幼苗鲜重的影响；
图9为在琼脂平板培养基上接种C7对油菜幼苗侧根数影响；
图10为在琼脂平板培养基上接种C7对油菜幼苗总根长的影响；
图11为盆栽条件下接种C7对油菜鲜重的影响；
图12为盆栽条件下接种C7对油菜干重的影响；
图13为盆栽条件下接种C7对小白菜生长的影响；
图14为盆栽条件下接种C7对萝卜生长的影响。
保藏信息
分类命名：贪噬菌
拉丁文学名：Variovorax sp.
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年12月14日
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：菌株C7的鉴定
分离纯化后的菌株C7，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26201，保藏日期为2022年12月14日。
将菌液进行50倍稀释(DNA模板)，用细菌通用的16S rDNA 27F/1492R引物对菌株的16S rDNA进行PCR扩增，扩增引物送去测序。PCR体系(30μL)：PrimeSTAR MAX Premix 15μl，27F 1μl，1492R 1μl，DNA模板3μl，加水补至30μl。扩增条件：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃10s，32个循环；72℃5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，由北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对，利用MEGA11软件构建菌株的系统发育树。图1为该菌株的菌落形态图，图2为该菌株的系统发育树，根据系统发育树，可知菌株C7属于贪噬菌属(Variovorax)。
实施例2：菌株C7的溶磷能力检测
有机磷液体培养基(L)：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙1.0g，pH7.0±0.1。
有机磷固体培养基(L)：在上述有机磷液体培养基的基础上添加15g琼脂。
无机磷液体培养基(L)：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸三钙5.0g，pH7.0±0.1。
无机磷固体培养基(L)：在上述无机磷液体培养基的基础上添加15g琼脂。
将待测菌株活化，挑取单菌落于20ml左右的TSB液体培养基中培养，长至对数期后用无菌水重悬两次，调OD600值为0.50(CFU≈108)。吸取5μL菌悬液滴于有机磷/无机磷固体培养基上，倒置放入28℃恒温箱中培养。吸取200μl菌悬液于20ml有机磷/无机磷液体培养基中，放入恒温摇床中28℃、200r/min培养2天。
钼蓝比色法测定磷含量：将培养2天后的菌液10000r/min、10min进行离心，吸取50μl上清液于5ml去离子水中，加2,4-二硝基酚指示剂1滴，待测液变为黄色，用1mol/L H2SO4调至黄色刚退，准确加入1ml硫酸钼锑抗混合显色剂，定容至10ml，摇匀。放置0.5h使呈色稳定，在分光光度计上用660nm比色。
标准曲线的绘制：分别吸取2.5μg/ml标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ml于25ml量瓶中，加纯水5-10ml，加2,4-二硝基酚指示剂2滴，用2mol/LNaOH或1mol/LH2SO4调至溶液黄色刚好消失，准确加入硫酸钼锑抗混合显色剂2.5ml，定容摇匀，即得0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80μg/ml的磷标准显色液。
结果表明：根据图3和图4，菌株C7在无机磷、有机磷固体培养基上均能产生透明圈，无机磷液体培养基中测得的磷含量为65.18μg/ml，有机磷液体培养基中测得的磷含量为1.76μg/ml，表明菌株C7具有一定的溶解无机磷和有机磷的能力。
实施例3：菌株C7的解钾能力检测
解钾固体培养基：购自北京酷来博科技有限公司。
将待测菌株活化，挑取单菌落于20ml左右的TSB液体培养基中培养，长至对数期后用无菌水重悬两次，调OD600值为0.50(CFU≈108)。吸取5μL菌悬液滴于解钾固体培养基上，倒置放入28℃恒温箱中培养。
结果表明：培养三天后观察到菌落周围有明显的透明圈，表明菌株C7有一定的解钾能力。
实施例4：菌株C7的产铁载体实验
MKB固体培养基(1L)：酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15mL，K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O0.2g，调pH为7.2，琼脂15g。
CAS固体检测培养基：将0.079g CAS溶于50ml去离子水中，再加入10ml
1mmol/LFeCl3溶液(用盐酸配制，准确称取0.0270g FeCl3·6H2O，用10mmol/L的盐酸定容至100ml)，得溶液A；将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40ml的去离子水中，得溶液B；将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅拌混匀即得100ml CAS(10×)蓝色检测液。使用时将10×CAS检测液稀释并添加质量浓度0.9％的琼脂。
将待测菌株活化，挑取单菌落于20ml左右的TSB液体培养基中培养，长至对数期后用无菌水重悬两次，调OD600值为0.50(CFU≈108)。吸取5μl调好的菌悬液滴于MKB固体培养基上，倒置放于28℃恒温培养箱中培养3天。将CAS固体检测培养基高温高压灭菌，待冷却至45℃左右时倒入培养3天后的MKB固体培养基中，静置2小时观察菌落周围颜色的变化。若菌落周围形成黄色圈，则证明菌株能够产生铁载体。
结果表明：根据图5，菌株C7形成的菌落周围有较为明显的黄色圈，表明菌株C7能够产生铁载体。
实施例5：菌株C7促进油菜发芽的实验
菌株培养及处理：将菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后在TSB固体培养基上划线，完成后放入28℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出单菌落，挑取单菌落于20ml TSB液体培养基中培养，培养至菌株生长对数期，6000r/min、8min离心，加入20ml无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，离心，调OD600值为0.50(CFU≈108)待用。
种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，先用体积浓度75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗三遍，再用体积浓度10％的次氯酸钠浸泡5min，无菌水清洗六遍，直至将次氯酸钠完全清洗干净。
播种：配制1/4MS培养基，添加质量浓度1％蔗糖、质量浓度1％琼脂，121℃高温高压灭菌20min，待培养基冷却到45℃左右时，倒20ml至无菌培养皿(90mm)中。将以上消毒好的种子放入调好的菌悬液中浸泡2小时，浸泡完成后将菌悬液吸出，种子放于无菌滤纸上吸干水分，每板30颗播种于1/4MS培养基中，放于光照培养间生长。生长5天后统计相应指标。
表1接种C7对油菜种子萌发后芽长的影响
结果表明：根据表1和图6，菌株C7的菌悬液浸泡后使油菜种子芽长提高了49％，表明菌株C7能够促进油菜种子的发芽。
实施例6：菌株C7促进油菜生长的琼脂平板实验
菌株培养及处理：将菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后在TSB固体培养基上划线，完成后放入28℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出单菌落，挑取单菌落于20ml TSB液体培养基中培养，培养至菌株生长对数期，6000r/min、8min离心，加入20ml无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，离心，调OD600值为0.50(CFU≈108)待用。
种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，先用体积浓度75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗三遍，再用体积浓度10％的次氯酸钠浸泡5min，无菌水清洗六遍，直至将次氯酸钠完全清洗干净。
播种：配制1/4MS培养基，添加质量浓度1％的蔗糖，分装进200ml玻璃瓶中，加质量浓度1％的琼脂，121℃高温高压灭菌20min，待培养基冷却到45℃左右时，添加2ml调好OD600值的菌液，摇晃均匀后倒入25cm×25cm的无菌方皿中，以加入2ml无菌水为对照。将消毒好的油菜种子均匀点于培养基上，平放于黑暗中直至萌发。萌发后将平板倾斜一定角度放于光照培养箱中培养9天。
结果表明：根据图7、图8、图9、图10，与不接菌对照相比，接种菌株C7使地上部、地下部鲜重及整株鲜重显著增加，显著增加了侧根数和总根长。表明菌株C7在一定程度上改变了根系构型，促进了油菜对养分的吸收和利用。
实施例7：菌株C7促进油菜生长的盆栽实验
菌株培养及处理：将菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后在TSB固体培养基上划线，完成后放入28℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出单菌落，挑取单菌落于20ml TSB液体培养基中培养，培养至菌株生长对数期，6000r/min、8min离心，加入20ml磷酸盐缓冲液，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，然后离心，调OD600值为0.50(CFU≈108)待用。
种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，先用体积浓度75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗三遍，再用体积浓度10％的次氯酸钠浸泡5min，无菌水清洗六遍，直至将次氯酸钠完全清洗干净。
播种：将消毒好的种子点于1/4MS平板上，发芽后浸泡于调好OD600值的菌悬液中2小时，以浸泡于无菌磷酸盐溶液中的种子为对照。2小时后将菌悬液倒出，种子播种于无菌土壤中(土：蛭石：珍珠岩的体积比为6：3：1，121℃高温高压灭菌两次)。放于光照培养箱中培养，当油菜长至四叶期，每盆接种2ml菌悬液，对照接种2ml无菌磷酸盐缓冲液。播种24天后进行收获，统计相应指标。
结果表明：根据图11和图12，接种C7使油菜地上部鲜重增加了52.11％，使干重增加了51.34％，表明菌株C7能够显著促进油菜的生长。
实施例8：菌株C7促进小白菜、萝卜生长的盆栽实验
挑选质地、大小、颜色一致的小白菜、萝卜种子进行播种，播种完成后每盆浇10mlOD600约0.5的菌悬液，同时浇20ml水使土壤全部浸湿。生长20天后收获，统计相应指标。
表2菌株C7对小白菜和萝卜鲜重、干重的影响
结果表明：根据表2、图13和图14，接种C7显著促进了小白菜、萝卜株高、鲜重，表明C7不仅能促进油菜的生长，还能促进其它园艺作物的生长，将来有望作为一种促生菌剂用于多种作物。
实施例9：菌株C7促进模式植物拟南芥生长的实验
菌株培养及处理：将菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后在TSB固体培养基上划线，完成后放入28℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出单菌落，挑取单菌落于20ml TSB液体培养基中培养，培养至菌株生长对数期，6000r/min、8min离心，加入20ml无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，然后离心，调OD600值为0.50(CFU≈108)待用。
种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的拟南芥种子进行消毒，先用体积浓度75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗三遍，再用体积浓度10％的次氯酸钠浸泡5min，无菌水清洗六遍，直至将次氯酸钠完全清洗干净。
播种：配制1/4MS培养基，添加质量浓度1％蔗糖，加质量浓度1％琼脂，121℃高温高压灭菌20min，待培养基冷却到45℃左右时，每200ml培养基中添加600微升菌液，摇晃均匀后倒入13cm×13cm的无菌方皿中，以加入600微升无菌水为对照。将消毒好的拟南芥种子均匀点于培养基上，4℃春化两天。萌发后将平板倾斜一定角度放于光照培养箱中培养12天。选取文献中(The Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Variovoraxboronicumulans CGMCC 4969Regulates the Level of Indole-3-Acetic AcidSynthesized from Indole-3-Acetonitrile,Applied and EnvironmentalMicrobiology,2018.)报道过的有一定促生功能的贪噬菌属的菌株Variovoraxboronicumulans CGMCC 4969做对照，整体鲜重数据如表3所示。
表3贪噬菌CGMCC 4969、C7对拟南芥整体鲜重的影响
结果表明：根据表3可以看出，接种菌株C7、CGMCC 4969后拟南芥整体鲜重分别较未接种增加了40％、24％，菌株C7的促生效果要强于已经报道过的有促生功能的菌株Variovorax boronicumulans CGMCC 4969，表明该菌株C7具有较好的促生效果和应用潜力。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一株贪噬菌，其特征在于，其为贪噬菌（Variovorax sp.）C7，已于2022年12月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 26201。
2.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述贪噬菌。
3.一种制剂，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述贪噬菌。
4.权利要求1所述贪噬菌、权利要求2所述组合物或权利要求3所述制剂在溶磷、解钾、产铁载体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述溶磷为溶解难溶磷、增加有效磷含量中的应用；所述难溶磷包括但不限于：磷酸钙，磷酸铝，磷酸铁。
6.权利要求1所述贪噬菌、权利要求2所述组合物或权利要求3所述制剂在促进植物生长中的应用，所述植物为：油菜，萝卜，小白菜，拟南芥。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，促进植物生长包括：
（A）增加植物生长量；
（B）促进根系发育。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（B）包括：增加植物侧根数以及总根长。
9.权利要求1所述贪噬菌、权利要求2所述组合物或权利要求3所述制剂在制备微生物菌肥、种子包衣或促根剂中的应用。
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