CN109666608B - 一种花生根际荧光假单胞菌及其应用 - Google Patents

一种花生根际荧光假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株花生根际荧光假单胞菌及其应用，所述荧光假单胞菌命名为1502IPR‑01，保藏编号为CGMCC NO.16925。本发明的花生根际荧光假单胞菌1502IPR‑01为革兰氏染色阴性菌，无芽孢，具有很强的产铁载体能力，产生的铁载体具有较好的螯合难溶性铁的能力。荧光假单胞菌1502IPR‑01及其菌剂具有高产铁载体能力，显著提高花生新叶活性铁含量，改善花生的铁营养，产生生长素促进侧根系发育，改善根系构型，促进植株氮磷钾含量的提高，减少植株钠含量提高抗盐胁迫，明显促进花生生长，提高花生生物量及产量等多种促生功能。本发明的荧光假单胞菌1502IPR‑01在植物促生长方面有积极的作用。

Description

一种花生根际荧光假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和植物促生菌领域，具体地说，涉及一种具有高产铁载体、高溶铁能力、产生长素、促进侧根生长、改善植物铁营养及氮磷钾元营养，增强植物耐盐胁迫能力和促进植物生长的荧光假单胞菌及其应用。
背景技术
铁是各种生物必需的元素之一，其参与生物体内重要代谢活动。植物的光合作用、呼吸作用、DNA合成等生理代谢过程都需要元素铁的参与。然而土壤中的铁大多以难溶态的氧化铁形式存在，其生物有效性低，特别是在石灰性土壤上，土壤pH高导致可溶性铁含量极低，因此在石灰性土壤上生长的植物易出现缺铁黄化症状。在我国北方石灰性土壤上，花生缺铁而导致的黄化症是一个限制其产量及品质的重要因素。目前，生产上主要通过选育铁高效利用品种，喷施铁肥来改善花生缺铁黄化，但是育种周期长，喷施硫酸亚铁等铁肥的效果也不佳。近年来，利用根际有益菌促进植物养分高效吸收及利用成为一个热点方向，其中之一就包括利用根际促生菌改善植物铁营养。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)作为土壤中常见的一个细菌，尽管有报道其具有植物促生和增强植物抗逆的作用，主要集中在荧光假单胞菌具有良好的溶磷能力，能够促进植物体磷含量，从而促进植物生长。但目前为止，有关荧光假单胞菌改善花生铁元素及氮、钾元素的报道较少，具有高产产铁载体能力、产生长素，并对花生具有促生及改善铁、氮、磷、钾营养作用的荧光假单胞菌尚未有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高产铁载体、高溶铁能力、改善植物铁营养和促进植物生长、提高植物产量的荧光假单胞菌及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是从花生根际土壤中分离得到，命名为1502IPR-01，以下简称为1502IPR-01。经16S rRNA基因序列分析，该菌株1502IPR-01为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。该菌株已于2018年12月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏号为CGMCC No.16925。
1502IPR-01菌株的菌落及菌体特征为：在LB培养基上30℃培养48h，菌落表面光滑，不透明，微黄色，边缘整齐。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阴性，无芽孢。
该菌株的生理生化特征为：4℃生长，41℃不生长，荧光色素试验为阳性，脓青素为阴性，氧化酶阳性，反硝化为阳性，明胶液化阳性，葡萄糖利用实验阳性，果糖利用实验阳性。
发酵上述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01，得到的发酵产物也属于本发明的保护范围。
在本发明的实施例中，发酵采用的培养基为LB培养基。其组成为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；氧化钠5g；加蒸馏水定容至1000mL；琼脂15-20g；pH＝7.0，121℃灭菌20min；发酵的条件为：温度为30℃，转速为200rpm。
本发明提供了含有所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物的菌剂。
优选地，所述菌剂为植物促生菌、植物侧根促生长剂或植物铁营养改善剂。
优选地，所述菌剂含有荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01的有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
本发明实验发现荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01具有高产铁载体，促进改善花生铁营养、花生增产中的作用。体现在促生菌制剂能够促进提高花生植株铁营养，促进侧根生长，提高养分吸收能力，提高植株生物量及产量。
本发明提供了含有所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物的生物肥料。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在提高植物铁含量、氮含量、磷含量或钾含量或改善铁、氮、磷或钾营养中的应用。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在降低植物钠含量或改善钠营养中的应用。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料产生生长素，在促进植物根系发育，促进侧根生长，增加植物根系吸收面积，促进养分吸收能力中的应用。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在提高植物生物量及产量中的应用。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在高产铁载体中的应用。
本发明提供了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在提高植物抗盐胁迫中的应用。所述盐为含Na离子的盐。
优选地，上述应用中，所述的植物为花生。本领域技术人员可以理解，将本发明的1502IPR-01应用于其他作物的生长，也具有上述类似的促生作用。
本发明的有益效果在于本发明从花生根际土壤中分离得到一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01,该菌株具有高产铁载体，改善铁营养，产生生长素，改善根系构型，提高花生生物量及产量等多种促生功能。首先，菌株1502IPR-01具有很强的产铁载体能力，产生的铁载体具有较好的螯合难溶性铁的能力。在盆栽试验中，能显著提高花生新叶活性铁、氮、磷、钾含量，改善花生的铁、氮、磷、钾营养。进而，菌株1502IPR-01能明显促进花生生长，提高花生生物量及产量。再者，菌株1502IPR-01能降低花生的钠含量，增强植株的抗盐胁迫能力。综上，菌株1502IPR-01不仅可以产生铁载体的能力，可以显著改善花生铁营养，同时对于花生具有良好的促生效果，且在应用过程中，无污染，无残留，生物环保，是一株在植物促生领域应用前景良好的促生菌株。
附图说明
图1：菌株1502IPR-01在蓝色CAS平板上形成橙色晕圈图。
图2A-图2B：菌株1502IPR-01产生的铁载体验证图。图2A为菌株1502IPR-01产生铁载体定性验证图，图2B为菌株1502IPR-01铁载体产量图。
图3A-图3B：菌株1502IPR-01铁载体溶解难溶性铁能力试验图。图3A为含不同浓度1502IPR-01铁载体溶液对难溶性铁溶解能力，编号1-5分别对应铁载体溶液添加量为0、20、200、500、1000μL。图3B为铁载体对难溶性氢氧化铁的溶出量。
图4：IAA浓度标准曲线。
图5：菌株1502IPR-01处理对花生盆栽的促生效果。左图为30天时CK及1502IPR-01处理花生长势。右图为100天时CK及1502IPR-01处理处理花生长势。
图6：菌株1502IPR-01处理对花生株高的影响。
图7：菌株1502IPR-01处理对花生生物量的影响。
图8：菌株1502IPR-01处理对花生产量的影响。
图9：菌株1502IPR-01处理对花生根系构型的影响。左图为30天各处理对花生根系影响，右图为100天时各处理对花生根系影响。
图10：菌株1502IPR-01处理对花生根三价铁还原酶活性的影响。
图11：菌株1502IPR-01处理对花生新叶活性铁含量的影响。
图12A-图12B：菌株1502IPR-01处理对花生植株氮元素的影响。图12A为菌株处理对花生单株平均氮浓度的影响，图12B为各处理对花生单株平均氮含量的影响。
图13A-图13B：菌株1502IPR-01处理对花生植株磷元素的影响。图13A为菌株处理对花生单株平均磷浓度的影响，图13B为各处理对花生单株平均磷含量的影响。
图14A-图14B：菌株1502IPR-01处理对花生植株钾元素的影响。图14A为菌株处理对花生单株平均钾浓度的影响，图14B为各处理对花生单株平均钾含量的影响。
图15A-图15B：菌株1502IPR-01处理对花生植株钠元素的影响。图15A为菌株处理对花生单株平均钠浓度的影响，图15B为各处理对花生单株平均钠含量的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至7.0。
实施例1荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)筛选、分离及鉴定
1.菌株的筛选分离：
CAS筛选培养基
CAS平板染液配制：将CAS 0.0605g溶于40mL去离子水，CTAB 0.1458g溶于50mL，10mM FeCl3 1mL，定容至100mL。
土壤样品为玉米花生间作花生根际土。花生根际土壤小心抖落到无菌袋里，放于低温保鲜盒，带回实验室后立即进行处理。取5g根际土壤样品放入45mL 0.9％的NaCl无菌水中，放于振荡培养箱内10min混匀，取上清即得土壤微生物悬浮液，进行系列梯度稀释，将稀释的微生物悬液吸取100μL于固体CAS平板，用涂布器涂匀，将平板用封口膜封口，置于30℃培养两天。观察长出的单菌落有无黄色晕圈。挑取产黄色晕圈的单菌落进行平板划线培养，见图1，多次纯化后保存于甘油，-80℃冰箱存放，纯化后的菌命名为1502IPR-01。
2.菌株1502IPR-01的形态及生理生化特征测定
(1)菌落特征及菌体形态菌株1502IPR-01的菌落及菌体特征为：在LB培养基上30℃培养48h，菌落表面凸起，光滑，微黄色不透明，边缘整齐。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阴性，无芽孢。
(2)菌株1502IPR-01的生理生化特征该菌株的生理生化特征为：4℃生长，41℃不生长，荧光色素试验为阳性，脓青素试验为阴性，氧化酶实验阳性，反硝化实验为阳性，明胶液化实验阳性，葡萄糖利用实验阳性，果糖利用实验阳性。
3.菌株1502IPR-01 16S rDNA序列测定及分析
对1502IPR-01菌株16S rDNA序列进行PCR扩增，得到1439bp的PCR产物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
将其16S rDNA序列进行BLAST比对，结果显示1502IPR-01与荧光假单胞菌的多个不同株的相似性均在98％以上，结合菌株的形态、培养特征及生理生化分析结果，鉴定菌株1502IPR-01为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
该菌株已于2018年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏号为CGMCCNo.16925。
实施例2菌株铁载体的产生与及溶铁能力验证
1.材料与方法
(1)菌生长曲线测定
根据陈绍兴等的方法，诱导产铁载体培养基采用改进的MSA培养基，具体配方为：蔗糖20g，天冬氨酸2g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，蒸馏水1000mL。培养条件为30℃，200rpm，每隔一定时间取样，测定菌液OD600，绘制生长曲线。
(2)铁载体定性检测
CAS液体检测液的制备：参照Schwyn&Neilands的方法，分别配制2mM CAS储液，1mMFeCl3储液，0.2M 5-磺基水杨酸储备液。
CTAB溶液:0.0219g溶于25mL超纯水。
哌嗪缓冲液:称取无水哌嗪4.3079g溶于30mL超纯水，用12M的浓盐酸调pH＝5.6。
CAS混合液：取7.5mL 2mM CAS溶液与1.5mL 1mM FeCl3混匀，边搅拌边缓慢加入25mL CTAB溶液中，再加入30mL哌嗪缓冲液，搅拌均匀。称取0.0873g 5-磺基水杨酸加入上述溶液中，转移至100mL容量瓶，定容待用，避光保存。
铁载体定性检测：取菌液2mL，于4℃,10000g离心5min，得上清液。取上清液与CAS液体检测液等体积混合，以空白培养基和等体积CAS检测液混合液作为对照，分别显色五分钟，观察颜色变化。
(3)铁载体定量检测
630nm比色法：取菌液2mL，于4℃，10000g离心5min得上清液。取上清液与CAS液体检测液等体积混合，以空白培养基和等体积CAS检测液混合液作为对照，分别显色五分钟，观察颜色变化。以水为参比溶液，分别测定显色五分钟后空白培养基与菌液上清在630nm处的吸光度，其中空白培养基OD630记作Ar，菌液上清OD630记作As，两者差值即为相对铁载体产量。总铁载体产量单位SU(siderophore units)计算公式为：SU＝(Ar-As)/Ar。
(4)铁载体溶铁能力试验
根据Chang等的方法制备氢氧化铁悬浊液，将1M NaOH溶液缓慢加入5mM FeCl3溶液中，调pH至6.5-7.0，出现氢氧化铁悬浊液，备用。
根据Takagi的方法，将MSA培养基培养12h的菌液在10000g条件下离心10min，得菌液上清，过0.22μm混合膜除去细胞，在冷冻干燥仪冻干，干粉用超纯水重新溶解，制得浓度约1g/mL的菌液上清浓缩液。取10mL离心管，各加入3mL pH＝5.6的醋酸钠缓冲溶液，再分别向各管加入菌液上清浓缩液0、20、200、500、1000μL，再加水补足到5mL，调pH为5.6±0.2，在55℃下水浴2h，期间振荡，将混合液离心，去上清液，用ICP-AES法测上清液中的铁含量。
2.试验结果：
在缺铁MSA培养基中，菌株1502IPR-01可以被诱导产生铁载体，使得蓝色CAS染液变为橙红色(图2A)。菌株产铁载体曲线与细菌生长曲线基本一致，培养12-24h铁载体产基本量达到稳定，12h铁载体分泌量基本达到最大(图2B)，最大产铁载体单位(siderophoreunits)达91.80％，产铁载体能力极强。利用氢氧化铁溶解试验，如图3A，随着铁载体浓度的增大，对难溶Fe(OH)3的溶解量增大，铁载体螯合铁溶液颜色逐渐加深。利用ICP-AES测定铁载体螯合铁溶液中铁浓度，计算结果得出其溶铁能力约为1g铁载体粗产品溶解1.16μmolFe(OH)3。表明1502IPR-01产生的铁载体提纯鉴定结构及分子量后，可以作为一种新型的三价铁离子的强螯合剂，潜在的用途为三价铁去除剂、铁离子中毒的解毒剂等。该溶解难溶性铁试验的试验中，铁载体含量与溶铁量呈良好的线性关系(图3B)，表明该方法除了可以用于制备铁载体螯合铁，也有可能用于测定其他细菌真菌总铁载体相对产量。
实施例3菌株1502IPR-01产生长素验证试验
(1)1502IPR-01菌株分泌IAA定性测定
将1502IPR-01接种到含有100mg/L的L-色氨酸LB液体培养基中，置于28℃恒温摇床180r/min震荡培养3天。吸取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入50μL的Salkowski比色液。同时用50mg/L的IAA加入Salkowski比色液作为阳性对照。将白色陶瓷板置于室温避光条件下保存30min，观察颜色变化。若颜色变红，表示该菌株具有产生IAA的功能。Salkowski比色液的配置方法：配置体积分数为35％的HClO4 50mL，配置浓度为0.5mol/L FeCl3 1mL，混合均匀，避光保存。
(2)1502IPR-01菌株分泌IAA定量测定
IAA标准曲线的绘制：精确称取IAA 10mg，先用少量的无水乙醇溶解，然后加入蒸馏水定容至100mL，配置成浓度为100μg/mL的IAA溶液作为贮备液，然后将贮备液稀释配置成浓度分别为0(空白)、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL的系列标准液，作为工作液。分别取上述工作液1mL按顺序加入到试管中，加入两倍体积的Salkowski比色液，置于40℃避光条件下保温30min，然后测在波长530nm处的吸光值。以OD530为横坐标，IAA浓度为纵坐标，绘制IAA标准曲线。
与定性测定相同培养条件下对菌株1502IPR-01产IAA能力进行定量测定。首先测定波长600nm处的菌悬液的OD值，然后取菌悬液以10000r/min的转速离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，在40℃条件下避光放置30min使其显色，测定波长530nm处的OD值。计算OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的浓度。
试验结果：1502IPR-01菌株在含L-色氨酸LB培养基上生长三天后，菌液上清与Salkowski比色液反应显色为浅红色，表明菌株确实可以产生IAA，测定530nm处吸光值，结合IAA浓度标准曲线(见图4)，测定计算其IAA产量为OD600＝1时产量为0.93μg/mL。
实施例4菌株1502IPR-01促生菌剂的制备
1502IPR-01发酵液的制备：将于甘油中保存的菌株1502IPR-01接种于LB培养基中活化后，按照1％的接种量接入到500mL液体LB培养基中，培养条件为30℃,200rpm，培养24h即得菌株1502IPR-01的发酵液，5000rpm离心后菌体重新悬浮同等浓度的无菌NaCl溶液中，使有效活菌的菌体浓度约在1×108CFU/mL。
实施例5菌株1502IPR-01对花生促生及改善铁营养的盆栽试验
1.材料与方法
(1)盆栽试验设计：
处理：花生接种1502IPR-01菌株处理(实施例3制得的1502IPR-01促生菌剂)和花生不接菌株对照两个处理，每个处理8盆，每盆2株花生，于30天和100天分别取样。
花生培养与样品采集：供试花生种子用10％(V:V)H2O2表面消30min后，用去离子水冲洗种子直至洗净表面残留的H2O2，用饱和CaSO4浸泡种子6h，转到去离子水润湿的滤纸中间催芽。待花生种子露白后，种子埋入土培瓷盆中，待长出四片叶后，取20mL菌浓度为1×108CFU/mL的1502IPR-01促生菌剂菌液浇灌到花生根部，其后每周浇灌一次，对照CK处理为浇灌相同量的等浓度的NaCl无菌溶液。
(2)菌株1502IPR-01对花生的促生作用：
播种30天及100天分别取样测定植株株高，干重，进行根系扫描分析，测定根系三价铁还原酶活力，叶片SPAD值，测定新叶活性铁含量，植株元素氮、磷、钾、钠含量及浓度。
新叶活性铁含量：取新鲜的新叶，剪碎混匀，称取2g鲜样，按体积比1:10的比例加入1mol·L-1的盐酸，振荡5h后过滤，用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES/OES)测定其活性铁含量。
花生根系Fe(III)还原力的测定：花生苗从营养液中取出后，用水充分洗干净后置于饱和CaSO4溶液中浸泡0.5h，用去离子水洗干净根系，随后将植物根系置于100mL含有0.1mM Fe(III)-EDTA和0.4mM 2,2-吡啶的缺铁营养液中反应2h。2,2-联吡啶与Fe(III)作用较弱，却是Fe(II)的强螯合剂，2,2-联吡啶与Fe(II)螯合形成的Fe(II)-联吡啶复合物呈现红色，根据此原理便可测定根系细胞原生质膜对Fe(III)的还原力，反应结束后将反应液在520nm处比色(空白为未加植株的混合液)，读取OD值，按下列公式计算还原力：
还原力〔μmol/(g·t)〕＝OD×V/(FW×8650)×106
式中OD为显色液于520nm波长处吸光度读数，V为显色体积(L)，8650为Fe(II)-联吡啶的摩尔吸光系数(L·mol-1·cm-1)；FW为根鲜重(g)；还原力单位t为反应时间(反应时间为2h)。
植株元素氮、磷、钾、钠含量及浓度：称取烘干样品0.3g左右，加入5mL优级纯浓硝酸，放置过夜后再加入2mL H2O2，进行微波消解，定容到25mL，去上清液用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES/OES)测定元素氮、磷、钾、钠含量。
2.试验结果：
(1)1502IPR-01菌株处理可以提高花生株高。如图5，特别是在播种100天时，1502IPR-01处理组花生平均株高为38.14cm，而对照CK仅为30.90cm，1502IPR-01比对照CK提高了23.43％，达到极显著差异水平(P<0.01)(图6)。
(2)菌株1502IPR-01改善花生根系结构，促进侧根生长。在幼苗期(30天)1502IPR-01处理可以促进侧根生长，侧根数量增加，而主根伸长受到抑制(图9)。1502IPR-01处理总根长，根表面积，根体积均高于对照，分别高出对照260.53％，657.78％，150.48％，达到极显著水平(P<0.01)(表1)。
表1菌株1502IPR-01处理对花生根系发育的影响
Figure BDA0001944220550000121
各数据代表三个生物学重复的平均值±标准偏差，同列数据后不同字母表示差异极显著(p<0.01)
对应于根系生物量数据(表2)，可以看出1502IPR-01处理在前期促进根系生物量增加主要体现在促进侧根生长，侧根数量增多从而增大了总根长、根表面积及根体积，无疑这都有助于养分的吸收。
(3)菌株1502IPR-01处理显著提高花生植株生物量及产量。在幼苗期(30天)及结荚期(100天)，1502IPR-01处理平均单株生物量(以干重计)分别为2.48g、5.05g，相比于对照CK处理的1.83g、3.33g，分别提高了35.52％、51.65％，差异极显著(P<0.01)(图7)。
表2菌株1502IPR-01处理对花生生物量及根冠比的影响
Figure BDA0001944220550000122
Figure BDA0001944220550000131
各数据代表三个生物学重复的平均值±标准偏差，同列数据后不同字母表示差异极显著(p<0.01)
从表1可以看出，在30天和100天，1502IPR-01处理组地上部单株平均干重均高于对照组，分别高出55.17％，56.50％，达到极显著差异(P<0.01)。在30天，1502IPR-01处理花生单株平均根干重比对照提高76.92％，达到极显著差异，而在100天，对照处理和1502IPR-01根干重大致相当，没有显著差异。在花生生长幼苗期(30天)，1502IPR-01处理的根冠比(R/S)为0.10高于对照的0.08，到达极显著差异，而到了结荚期(100天)则相反，1502IPR-01处理根冠比(R/S)为0.08则低于对照0.13，达到极显著差异(P<0.01)。表明1502IPR-01处理对于根系发育的促进作用主要发生在幼苗期(30天)。早期建成较大的根系能使花生具有较好的根系养分吸收基础，而CK处理在幼苗期根干重显著低于1502IPR-01处理，后期根干重提高到达和1502IPR-01几乎同等水平。一般而言，当植物受到养分亏缺胁迫时会将光合产物更多的分配向根系，生长前期CK对照组根系小，其养分吸收能力弱不利于后期地上部生物量的建成，甚至面临养分吸收不足因而在后期增大根系投入，这可能是生长后期CK组根系增大的原因，但是其地上部生物量仍显著低于1502IPR-01。1502IPR-01处理也使得花生产量显著增加，在结荚期(100天)取样测定，1502IPR-01处理平均单株果实干重为4.58g，相比于对照CK的3.47g提高了31.99％(图8)。
(4)菌株1502IPR-01处理改善花生铁营养。花生新叶活性铁含量与其铁营养状况存在较好的正相关，因而新叶活性铁含量可以作为反映植物的铁营养的可靠指标。在花生幼苗期(30天)，1502IPR-01处理新叶活性铁含量为较对照含量低，但差异不显著(图11)。同时，1502IPR-01处理的三价铁还原酶活性高于对照，达到显著差异水平(P<0.05)(图10)。而后期(100天)，1502IPR-01处理新叶活性铁浓度达7.87μg/g，对照CK浓度为5.65μg/g，1502IPR-01处理比对照提高了39.29％，达到显著差异水平(P<0.05)，而此时三价铁还原酶活力差异不大。表明菌株1502IPR-01在后期可以起到改善花生铁营养的作用。具体机制可能一方面由于菌株1502IPR-01能够分泌铁载体活化土壤难溶性铁，增加土壤中生物有效性铁浓度；另一方面1502IPR-01处理能够增大根系吸收面积，同时激活植物三价铁还原酶的活性，增加元素铁的还原吸收。
(5)菌株能显著提高花生植株氮含量。由图12A看出，30天时，1502IPR-01处理的单株氮浓度平均比CK处理低，但是100天时比CK要高，但均未达到显著差异。由图12B可以看出，在30天时，CK处理及1502IPR-01处理单株氮含量分别为45.16mg、68.78mg，在100天时，CK处理及1502IPR-01处理单株氮含量分别为41.60mg、83.47mg，分别提高了52.30％、100.65％。可见1502IPR-01处理后可以提高花生植株的氮营养。氮元素是蛋白质、核酸、叶绿素等物质的组成元素，是植物限制植物生长及产量的首要因素，由数据看，1502IPR-01处理提高花生植株氮含量，说明1502IPR-01能提高植物生长及生物量。
(6)菌株能显著提高花生植株磷含量。由图13A可以看出，30天及100天，1502IPR-01处理的单株磷浓度平均比CK处理高，但均未达到显著差异。由图13B可以看出，在30天时，CK处理及1502IPR-01处理单株磷含量分别为3.34mg、3.41mg，差异不大，在100天时，CK处理及1502IPR-01处理单株氮含量分别为4.20mg、6.87mg，提高了63.57％。可见，1502IPR-01处理可以在后期提高花生植株的磷营养。磷元素是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，磷既是植物体内许多重要有机化合物的组分，又以多种方式参与植物体内代谢过程，对植物产量具有重要影响。菌株1502IPR-01处理能够增加植株磷含量，说明此为能促进花生生物量的原因之一。
(7)菌株能显著提高花生植株钾含量。由图14A可以看出，30天时，1502IPR-01处理的单株钾浓度平均比CK处理高，但是100天时比CK要低，但均未达到显著差异。由图14B可以看出，在30天时，CK处理及1502IPR-01处理单株钾含量分别为32.44mg、42.63mg，在100天时，CK处理及1502IPR-01处理单株钾含量分别为40.05mg、57.81mg，分别提高了31.41％、44.34％。总体来讲，1502IPR-01处理可以提高花生植株的钾营养。钾元素是植物必需大量元素之一，对于植物产量及品质具有重要作用，对于光合作用具有促进作用，提高CO2同化率，促进光合产物运输。菌株1502IPR-01处理能够提高植物钾含量，进一步提高植株光合作用，这可能是其促进生物量的原因之一。
(8)菌株能显著降低花生植株钠含量，增强耐盐胁迫。由图15A看出，30天时CK处理及1502IPR-01处理的单株钠浓度平均分别为0.45mg/g、0.11mg/g。100天时，CK处理及1502IPR-01处理的单株钠浓度平均分别为4.67mg/g、1.74mg/g。均达到显著差异。由图15B可以看出，在30天时，CK处理及1502IPR-01处理单株钠含量分别为0.74mg、0.24mg，在100天时，CK处理及1502IPR-01处理单株钠含量分别为14.46mg、8.44mg，分别降低了67.57％、46.63％。花生适宜中性偏酸土壤，对盐胁迫相对敏感。土壤盐害会影响植株生长，降低光合效率及光合产物积累。由数据看出，1502IPR-01处理可以降低花生植株的钠含量，增强花生植株的抗盐胁迫能力，进而促进花生光合产物积累及生物量增加。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种花生根际荧光假单胞菌及其应用
<130> KHP181118199.9
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcatgcgca gctacacatg caagtcgagc ggtagagaga agcttgcttc tcttgagagc 60
ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gttcggaaac 120
gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta 180
tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat 240
ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct 300
acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc 360
gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcaattacc 420
taatacgtga ttgttttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactc tgtgccagca 480
gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta 540
ggtggtttgt taagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac 600
tgactgacta gagtatggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctaatactga cactgaggtg 720
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc 780
aactagccgt tggaagcctt gagcttttag tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc 840
tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 900
ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatccaatg 960
aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaacattgag acaggtgctg catggctgtc 1020
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta 1080
gttaccagca cgtaatggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg 1200
tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc 1260
cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga 1320
atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380
gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc gggaggacgg taccacggtg atcaggtgg 1439

Claims (8)

1.荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01，保藏编号为CGMCCNO.16925。
2.含有权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，含有荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)1502IPR-01的有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
4.含有权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01的生物肥料。
5.权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物肥料在提高植物新叶活性铁含量、氮含量、磷含量或钾含量或改善铁、氮、磷或钾营养中的应用。
6.权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物肥料在促进植物根系发育，促进养分吸收能力中的应用。
7.权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物肥料在提高植物生物量及产量中的应用。
8.权利要求1所述的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1502IPR-01或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物肥料在提高植物抗盐胁迫中的应用。
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