CN112940986B - 一种复合溶磷菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于复合菌剂技术领域，特别是涉及一种复合溶磷菌剂及其应用。本发明提供了一种复合溶磷菌剂，所述复合溶磷菌剂包括保藏编号为GDMCC 1.49的荧光假单胞菌和来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20665的巨大芽胞杆菌。使用了本发明提供的复合溶磷菌剂后，植物生长的增幅高达245.14％；叶绿素b含量增幅高达497.81％；植株中磷元素的含量增幅高达79.23％；植株中MDA的含量能够降低60.92％，能够有效起到提高植物在盐碱地中的抗逆性，提高盐碱地的利用率。

Description

一种复合溶磷菌剂及其应用
技术领域
本发明属于复合菌剂技术领域，特别是涉及一种复合溶磷菌剂及其应用。
背景技术
土壤盐碱化是我们现在面临的主要生态环境问题之一，土壤盐碱化会浪费有限的土地资源，严重影响农业发展。盐碱地土壤有机质含量少，渗透性差，可溶性有效磷含量低，可耕性和生产性能差，最终造成土壤磷肥水平低。而磷(P)含量低是许多农业生态系统中作物生长的主要限制因素，磷的有效性控制着所有作物的生长和发育。虽然土壤总磷含量较高，但是在土壤中，超过95％的磷与Fe3+、A13+和Ca2+等结合导致植物难以直接吸收利用。农业生产中施用磷肥是增加土壤磷素供应的主要途径。但是施用磷肥后，超过80％的磷肥通过吸附、沉淀等方式不能很快被植物吸收。若能治理和改良盐碱地，对农业的可持续发展具有重大意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种复合溶磷菌剂及其应用。本发明提供的复合溶磷菌剂能够有效促进盐胁迫条件下的植物的生长，并有效提高植物的各项指标。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种复合溶磷菌剂，所述复合溶磷菌剂包括荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌；所述荧光假单胞菌来自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 1.49；所述巨大芽胞杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20665。
优选的，所述复合溶磷菌剂中总活菌数为(107～109)CFU/mL；所述复合溶磷菌剂中荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌的活菌数比例为(0.8～1.0):(0.8～1.0)。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物抗盐胁迫能力中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在降低植物中丙二醛含量中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在促进植物生长中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在促进植物光合作用中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物叶绿素a和/或叶绿素b含量中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物磷元素和/或氮元素和/或钾元素含量中的应用。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物过氧化物酶活力中的应用。
优选的，所述应用为在盐胁迫条件下发生的。
本发明提供了一种复合溶磷菌剂，所述复合溶磷菌剂包括保藏编号为GDMCC 1.49的荧光假单胞菌和来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20665的巨大芽胞杆菌。由实施例数据可知，使用了本发明提供的复合溶磷菌剂后，植物生长的增幅高达245.14％；叶绿素含量增幅高达497.81％；植株中磷元素的含量增幅高达79.23％；植株中MDA的含量能够降低60.92％，能够有效起到提高植物在盐碱地中的抗逆性，提高盐碱地的利用率。
附图说明
图1为不同处理下番茄的生长情况；
图2为不同处理对番茄叶内SOD活性的影响；
图3为不同处理对番茄根内SOD活性的影响；
图4为不同处理对番茄叶内CAT活性的影响；
图5为不同处理对番茄根内CAT活性的影响；
图6为不同处理对番茄叶内POD活性的影响；
图7为不同处理对番茄根内POD活性的影响；
图8为不同处理对番茄叶内MDA含量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种复合溶磷菌剂，所述复合溶磷菌剂包括荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌；所述荧光假单胞菌来自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 1.49；所述巨大芽胞杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20665。在本发明中，所述复合溶磷菌剂中总活菌数优选为(107～109)CFU/mL，进一步优选为108CFU/mL；所述复合溶磷菌剂中荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌的活菌数比例优选为(0.8～1.0)：(0.8～1.0)，进一步优选为1:1。本发明提供的复合溶磷菌剂能够有效促进盐胁迫条件下的植物的生长，并有效提高植物的各项指标。在本发明中，所述植物优选包括番茄，在本发明的实施例及应用例中所述番茄的种类优选为合作903大红番茄。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物抗盐胁迫能力中的应用。在本发明中，所述复合溶磷菌剂能够有效提高植物在盐胁迫下的生长指标、植株叶绿素含量、氮磷钾含量和过氧化物酶的活力，并降低丙二醛的含量。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在降低植物中丙二醛(MDA)含量中的应用。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后，植株中MDA的含量能够降低60.92％。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在促进植物生长中的应用。在本发明中，所述促进植物生长的指标优选包括植株的根长、株高、地上部分鲜重和/干重、地下部分鲜重和/干重。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后，植株的根长的涨幅为109.36％，株高的涨幅为63.00％，地上部分鲜重的涨幅为245.14％，根鲜重的涨幅为110.00％，地上部分干重的涨幅为230.76％，根系干重的增幅为200.00％。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在促进植物光合作用中的应用。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后的植株中，叶绿素a和/或叶绿素b和/或总叶绿素的含量均有明显的增长。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物叶绿素a和/或叶绿素b含量中的应用。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后的植株中，叶绿素a的含量能够提高425.69％，叶绿素b的含量能够提高497.81％，总叶绿素的含量能够提高415.82％。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物磷元素和/或氮元素和/或钾元素含量中的应用。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后，植株叶片中磷元素的含量能够提高54.98％，植株根系中磷元素的含量能够提高79.23％；植株叶片中氮元素的含量能够提高112.12％；植株叶片中钾元素的含量能够提高415.82％。
本发明还提供了上述复合溶磷菌剂在提高植物过氧化物酶活力中的应用。在本发明中，经由复合溶磷菌剂处理后，植株根系中的POD活性能够提高181.03％，植株叶片中的POD活性能够提高161.93％。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种复合溶磷菌剂及其使用方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)菌种来源：
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula)，菌种编号：GIM 1.49，购买于广东省微生物菌种保藏中心(文中编号菌株1.49)。
巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，菌种编号：CICC 20665，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(文中编号菌株1.11)。
(2)土壤来源：
试验土样采自浙江师范大学校园土壤(29°N，119°E)。多点取样，采样深度为5～20cm，将采集回来的土壤首先去除杂草、草根系、砾石、砖块、肥料团块等杂物，自然风干、碾碎磨细、过筛(10目孔径筛)、混匀，装袋备用。土壤pH为6.4，有机质含量为0.14％，水解性氮为0.8mg/kg，速效磷为17.4mg/kg，速效钾为123.9mg/kg土壤pH有机质含量。
(3)番茄来源：
供试蕃茄品种为合作903大红番茄种子，(Lycopersicon esculentumMill.)，种子由上海长种番茄种业有限公司生产。
(4)盐碱土模拟
根据盐碱地组成，选取2种中性盐(NaCl、Na2SO4)和2种碱性盐(Na2CO3、NaHCO3)配制混合盐溶液，将NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3按摩尔比1:18:18:1混合，并按盐浓度200mmol/L的浓度制成中盐中碱的混合盐溶液。溶解后于1L容量瓶中定容。
每个盆栽加入土壤3kg，0.2776gK2SO4，1.1464g NH4Cl的基肥。装盆前，基肥和土壤进行充分混匀，盆栽底部放入纸张，防止土壤漏出。每次加入100mL/盆，连续加入10d，直至每盆加入1L混合盐溶液，配置成中盐中碱的盐碱土盆栽。
(5)种子处理
将番茄种子用10％的次氯酸钠溶液表面消毒5～10min，蒸馏水洗涤5次，将表面的消毒剂清洗干净。用无菌水喷湿无磷滤纸，铺在育种盆里。取适量番茄种子置于滤纸上，用戳了几排小洞的保鲜膜包好育种盆，贴上标签后，放入28±1℃的恒温培养箱中催芽，期间适当喷水，使种子保持湿润。
(6)液体菌剂的配制
采用液体发酵法培养溶磷菌，挑取两种溶磷菌分别按1％体积接种于100mLLB液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养72h。8000r/min离心10min后，弃上清液，收集菌体。用无菌水洗涤2～3次，8000r/min离心5min。重悬于无菌水中，制得活菌数为(107～109)CFU/mL(600nm，OD值为0.5)的菌悬液，获得液体菌剂，盆栽试验待用。
LB液体培养基:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0～7.2，120℃高压灭菌20min。
(7)试验设计
试验地点位于浙江师范大学8号实验楼，于2019年10月进行盆栽试验。待种子发芽长至3～4cm后，选取长势相似，发芽整齐的幼芽进行移植，移植深度为2～3cm，均匀分布。每个盐碱土盆栽移栽5株的番茄幼芽。
试验共设置4个平行处理，分别为：空白对照组(不做任何处理)；菌株1.11组(单接菌株1.11)；菌株1.49组(单接菌株1.49)；复合菌组(加入菌株1.11和菌株1.49，活菌比为1:1)。每个处理重复3次，共12盆。实验组中每株番茄幼苗的根部土壤中接入液体菌剂(8～12mL)，对照组中加入等量水。于25±2℃的人工气候室以14h/10h的光/暗条件培养，期间不再添加肥料，定期定量浇水。
应用例1
实施例1进行的实验持续50d后收获番茄，植株样品整株采集，根部用清水把土壤清洗干净后，开始测定各项参数，测定方法如下。
根长、株高：采取直接测定法，株高用直尺测定茎基部到生长点的高度(cm)，根长用直尺测定被拉直的根系长度。
地上部分、根鲜重的测定：测完株高和根长后，分为地上部分和根，迅速剪取植物材料，装入已知重量的信封中，带入室内，用分析天平称取鲜重。
地上部分、根干重测定：提前预热烘箱，使温度升至100℃～105℃。把称过鲜重的植物材料装入信封中，放入烘箱内，100℃～105℃杀青10min，然后把烘箱的温度降到70℃～80℃，烘至恒重。取出信封和样品，放入干燥器中冷却至室温后称取干重。
叶绿素：取番茄植株生长点下方第2片功能叶为测定对象，取0.1g剪碎的新鲜植物叶片放入研钵中，加少量石英砂、碳酸钙粉及80％丙酮研成匀浆。用质量百分含量为80％的丙酮溶液转移至10mL离心管中，于暗处浸提反应2h，5000r/min离心5min，在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以80％丙酮为空白对照，根据改良的Arnon公式计算叶绿素的含量。
(1)对番茄生长情况的检测结果见图1和表1，图1为不同处理下番茄的生长情况，从左到右依次为空白对照组，菌株1.11组，菌株1.49组和实施例。
表1不同处理下番茄的生长情况
Figure BDA0003004890100000061
Figure BDA0003004890100000071
注：采用字母标记法表示处理间的差异显著(P<0.05)，下表均同。
从表1可以看出，各个处理组的生长指标均具有明显差异(P<0.05)。对于根长和株高，相较于空白对照组，其余处理组的增长范围分别是63.00％～109.36％和24.89％～63.00％，复合菌组增幅最大。
关于地上部分和根的物质积累量，除根鲜重外，复合菌组各个生长指标的增幅均为最大值，其中复合菌组的地上部分鲜重、根鲜重、地上部分干重、根系干重的增幅分别是245.14％，110.00％，230.76％，200.00％。综上所述，复合菌组促生作用最为显著。
复合菌组的地上部分干重和鲜重的增幅均大于地下部分，说明施加本发明提供的复合溶磷菌剂能够显著提高番茄的地上部生物量。从图1番茄植株的生长情况也可直观看出促生效果的高低，从而可以得出不同处理对番茄的促生效果为复合菌组＞菌株1.49组＞菌株1.11组＞空白对照组。
(2)对番茄中叶绿素含量的检测结果如表2所示。
表2不同处理下番茄叶绿素的影响
Figure BDA0003004890100000072
从表2可以看出，对于叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素，促生效果最强的复合菌组相对于空白对照组分别净增加了21.54mg/g，9.11mg/g和28.65mg/g，增幅达到425.69％，497.81％，415.82％，达显著差异(P<0.05)。相较于前文的生长指标指标，复合菌组对植物的促生作用更大可能体现在促进植物进行光合作用上。
在本实验中，接种复合溶磷菌剂后植物中的叶绿素含量显著增加，其中叶绿素b的增率最高，达到497.81％，加之叶绿素含量是植物盐胁迫耐受性的指标之一，也是衡量植物光合作用能力强弱的一个重要指标。说明溶磷菌能够缓解植物的盐胁迫环境，在一定程度上保护了叶绿体和细胞膜结构的完整。
应用例2
将应用例1收获的植物烘干得到烘干植物样品，烘干植物样品粉碎，称取0.2g粉碎的组织样品(过1mm筛孔)加入到100ml消煮管中，加入5ml浓硫酸摇匀，静置24h。预热消煮炉，在消煮管上放入弯颈漏斗，待液体冒白烟后升高温度，当溶液显棕黑色后取下。冷却一会后加入10滴30％双氧水，混匀。再加热至微沸，消煮约10～20min，稍冷后重复加双氧水5～10滴，再消煮。如此重复消煮至溶液呈清亮。冷却后用蒸馏水将消煮液转移入100mL容量瓶中，定容。吸取清液测定氮、磷、钾。植物样中全氮含量测定用凯式定氮法，全磷含量测定用钼锑抗比色法，全钾含量测定采用火焰光度计法。
(1)对番茄中磷含量的检测结果如表3所示。
表3不同处理下番茄叶片和根系磷含量的影响
Figure BDA0003004890100000081
由表3可知，施加溶磷菌能够提高番茄植株的P含量，并且各处理的P含量叶片部分比根系部分高。各处理组和对照组间均达到差异显著水平(P<0.05)。三个实验处理组的叶片和根系的P含量，较空白对照组分别增加25.46％～54.98％和49.23％～79.23％，其中复合菌组的叶片和根系的P含量增幅最大，达到54.98％和79.23％，表明本发明提供的复合溶磷菌剂能够起到良好的提高番茄植株的P含量的技术效果。
(2)对番茄中氮和钾含量的检测结果如表4所示。
表4不同处理对番茄叶片N和K含量的影响
Figure BDA0003004890100000091
从表4可以得出，施加解磷菌后的番茄叶片的N和K含量均高于空白对照组，对N的增幅为63.63％～112.12％，对K的增幅为155.73～415.82％，且各指标组间达到显著差异水平(P<0.05)，其中复合菌对番茄叶片N和K吸收的促进作用最大，表明本发明提供的复合溶磷菌剂具有提高番茄叶片中N和K含量的技术效果。
应用例3
实施例1进行的实验持续50d后取番茄植株生长点下第3片功能叶作为叶片测定对象，取番茄根部作为根系测定对象。
SOD活性：提取酶液：称取0.1～0.2g的样品放入研钵中，加入1.6mL 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(PBS，pH为7.8)研磨成匀浆，转入2mL离心管中在4℃、12000r/min离心20min。
取甲硫氨酸(Met)溶液162mL，EDTA-Na2溶液6mL，氮蓝四唑(NBT)溶液6mL，核黄素溶液6mL，混匀配置成反应混合液，取3mL反应混合液和40μL酶液于反应管中，同时做两支对照管，其中一支加3mL反应混合液和40μLPBS作为最大光还原管，另一支加3mL反应混合液和40μLPBS遮光处理用于调零。将试管在4000lux光照培养下里25℃反应20min，分别测定各管在560nm下的吸光度，记算酶活性。
POD活性：提取酶液步骤同上。取50mLPBS和28μL愈创木酚于烧杯中，加热搅拌至溶解，冷却后加入19μL 30％的过氧化氢混匀配置反应混合液，取3mL反应液并加入40μL酶液，以PBS为对照调零，测定在470nm处15秒内的变化，记算酶活性。
CAT活性：提取酶液步骤同上。取100mL PBS加入0.1546mL30％的过氧化氢摇匀配置反应混合液，提取1mL的酶液和2.9mL的反应液，以PBS为对照调零，测定在240nm上40s内的变化，记算酶活性。
检测结果如图2～图7，表5～表10所示，图2～图7为不同处理对番茄叶或根中各抗氧化酶的活性的检测，图2～图7中从左到右依次为空白对照组，菌株1.11组，菌株1.49组和复合菌组。
表5不同处理对番茄叶片中SOD活性的影响
Figure BDA0003004890100000101
表6不同处理对番茄根部SOD活性的影响
Figure BDA0003004890100000102
表7不同处理对番茄叶片中CAT活性的影响
Figure BDA0003004890100000103
表8不同处理对番茄根部CAT活性的影响
Figure BDA0003004890100000104
表9不同处理对番茄叶片中POD活性的影响
Figure BDA0003004890100000111
表10不同处理对番茄根部POD活性的影响
Figure BDA0003004890100000112
由图2～图7，表5～表10可知，不同菌处理对番茄叶片和根系内SOD、CAT、POD活性影响差异较大，菌株1.11组，菌株1.49组和复合菌组处理间无显著差异(P>0.05)。除了菌株1.11中根系SOD活性，各处理组间和空白对照组间显著差异明显(P<0.05)。各处理的根系内SOD和POD活性高于叶片，而CAT活性与之恰恰相反。与空白对照组相比，施加菌的各个处理均提高了番茄叶片和根系抗氧化酶SOD、CAT、POD活性。
对于SOD活性，菌株1.11的增幅最大，根系和叶片SOD活性增加了63.34％和162.43％。根系和叶片的CAT活性相对于空白对照组，增幅为40.44％～67.37％和55.29％～67.26％。对于根系CAT活性，菌株1.11最高。而对于叶片CAT活性则相反。复合菌组的根系和叶片POD活性最高，提高幅度分别达到181.03％和161.93％。综上所述，不同菌处理可增加盐胁迫下番茄植株抗氧化酶活力，促进番茄正常生长。但是本发明提供的复合溶磷菌剂能够更加有效提高POD的活性。
应用例4
MDA的含量是反映植物细胞膜脂过氧化作用的重要指标。取实施例1进行的实验持续50d后番茄植株生长点下第4片功能叶作为叶片MDA的测定对象。采用硫代巴比妥酸显色法检测叶片MDA含量。称取0.2～0.3g样品叶片，加10％三氯乙酸2mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000rpm，离心10min。取上清液5mL，加0.6％TBA(硫代巴比妥酸)5mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。检测结果如图8，表11所示，图8为不同处理对番茄叶内MDA含量的影响，其中CK为空白对照组，Strain 1.11为菌株1.11组，Strain为菌株1.49组，compound bacteria为复合菌组。
表11不同处理对番茄叶内MDA含量的影响
Figure BDA0003004890100000121
由图8和表11可知，经过菌株1.11，菌株1.49和复合菌的处理后，番茄叶片的MDA含量显著低于对照，其中复合菌组减低幅度最大，减幅达到60.92％。菌株1.11和菌株1.49处理组的MDA含量分别比对照降低40.55％和36.72％。各处理组间和空白对照组间显著差异明显(P<0.05)。各处理组间的MDA含量均低于空白对照组，综上所述，本发明提供的复合溶磷菌剂能够降低植物体内过氧化物的累积量，减轻膜质氧化损伤，最终提高植物抗逆境胁迫能力。
盐胁迫下，植物体内产生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，破坏植物膜系统的活性氧自由基，打破了清除系统的动态平衡，影响植物正常的新陈代谢，导致MDA含量升高，植物的抗氧化酶系统中的SOD、POD、CAT活性减低。经由本发明提供的复合溶磷菌剂处理后，相较于空白对照组，番茄叶片和根系的SOD、POD、CAT活性显著增强，MDA含量明显降低，表明本发明提供的复合溶磷菌剂能够提高盐胁迫下植物体内抗氧化酶的活性来促进过氧化物的分解，降低植物体内过氧化物的累积量，减轻膜质氧化损伤。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种复合溶磷菌剂在提高植物抗盐胁迫能力中的应用，其特征在于，所述复合溶磷菌剂由荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌组成；所述荧光假单胞菌来自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GIM 1.49；所述巨大芽胞杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20665；
所述复合溶磷菌剂中总活菌数为（107～109）CFU/mL；所述复合溶磷菌剂中荧光假单胞菌和巨大芽胞杆菌的活菌数比例为（0.8~1.0）：（0.8~1.0）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在降低植物中丙二醛含量中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在促进植物生长中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在促进植物光合作用中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在提高植物叶绿素a和/或叶绿素b含量中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在提高植物磷元素和/或氮元素和/或钾元素含量中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为复合溶磷菌剂在提高植物过氧化物酶活力中的应用。
8.根据权利要求3~7任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为在盐胁迫条件下发生的。
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