CN103155815B - 一种提高烟草青枯病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高烟草青枯病抗性的方法，包括每种丛枝菌根真菌初始菌种单独扩繁，混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草；所述丛枝菌根真菌扩繁的初始菌种包括蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；扩繁后的蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）的混合比例为0.5～1:1:1，以重量比计。本发明促进烟草生长，有效降低烟草的青枯病的发病率和病情指数，从而提高了烟草对青枯病的抗性。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高烟草青枯病抗性的方法，具体涉及利用丛枝菌根真菌提高烟草青枯病抗性的方法。
背景技术
青枯病是烟草生长中最常见的病患之一，它是由茄科劳尔氏菌引起的一种细菌性土传病害。近年来，该病在我国云南、重庆、湖南、福建等长江以南各烟区普遍发生。在旱地重病烟田，青枯病发病率可达30%-80%，造成大片烟株枯死甚至绝收，严重影响烟草的产量和质量，带来了巨大的经济损失。
目前，烟草生产中防治青枯病主要采用各种拮抗菌制备的微生物制剂，如一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法(CN201110195718.7) 、用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌NJL-14 (CN201010222337.9)或者一些植物成分,如一种防治烟草青枯病的植物源杀菌剂(CN201110317994.6)，或者农药，如溴菌腈·壬菌铜复配制剂及其防治烟草青枯病的应用(CN201110410302.2)，这些方法在使用中都引入了大量的外源物质或者生物，对生态环境、烟草植株造成污染，如何安全且有效的提高烟草青枯病抗性还有待解决。
发明内容
本发明的目的是为了有效降低烟草的青枯病的发病率和病情指数。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种提高烟草青枯病抗性的方法，包括每种丛枝菌根真菌初始菌种单独扩繁，混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草；所述丛枝菌根真菌扩繁的初始菌种包括蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；扩繁后的蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomusintraradices）的混合比例为0.5～1:1:1，以重量比计。初始菌种的接种量是扩繁基质的3%～5%，以重量比计。所述丛枝菌根真菌菌剂形成的群落接近于自然状态，菌种间协同配合更好的发挥提高烟草青枯病抗性的作用。
为了提高菌群质量，并提高丛枝菌根真菌的侵染效率，上述混合丛枝菌根真菌菌剂的密度为：孢子密度>20个/克干土。
为了有利于菌群各种菌种的共同生长发育，并保有良好的健康状态，上述丛枝菌根真菌扩繁基质包括3:1的河沙和土壤。进一步地，所述丛枝菌根真菌扩繁基质还包括尿素和过磷酸钙，按每100kg河沙混入5～10g尿素和20～40g过磷酸钙的配比量配成基质。
为了保证营养的充分有效利用，上述河沙和土壤过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160～170oC干热灭菌，2小时（h）。
上述每种丛枝菌根真菌初始菌种单独扩繁包括以下步骤：以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160～170oC干热灭菌2h，每100kg河沙再加入5～10g尿素和20～40g过磷酸钙配成基质；在基质中分别接种上述丛枝菌根真菌初始菌种进行每种菌种的单独扩繁，接种量为3%～5%，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入18%～22%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，3～4个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌。
上述提高烟草青枯病抗性的方法，包括下列步骤：
（1）扩繁丛枝菌根真菌，制备混合丛枝菌根真菌菌剂：丛枝菌根真菌初始菌种为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160～170oC干热灭菌2h，每100kg河沙再加入5～10g尿素和20～40g过磷酸钙配成基质，在基质中接入3%～5%的所述丛枝菌根真菌初始菌种，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入18%～22%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，3～4个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌；然后混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，混合比例为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）：摩西球囊霉（Glomus mosseae）：根内球囊霉（Glomus intraradices）=0.5～1:1:1，以重量比计，含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段。
（2）菌根化烟苗的培养：在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤(1) 制得的混合丛枝菌根真菌菌剂，其中，以过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160-170oC干热灭菌2h的河沙作为育苗基质，每100 g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂，播种烟草种子，使育苗盘下半部分浸入自来水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把自来水更换成1/5～1/2质量浓度的霍格兰(Hoagland)营养液，每天补足减少的水分，每2～3周更换一次营养液；生长 60～70天取烟苗，当根系菌根侵染率大于30%时即可用于移栽；
为了混合丛枝菌根真菌与烟草能更好的和谐共生，每100g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂。
（3）将步骤(2)得到的菌根化烟苗在田间进行移栽。根据土壤肥力进行施肥管理，同时进行水分、杂草等田间管理，使植物正常生长。
所述的丛枝菌根真菌菌剂的使用方法是采用育苗器育苗的方法施用于植物。
所述扩繁后侵染烟草的丛枝菌根真菌的密度为：孢子密度>20个/克干土。密度过低时，通过延长收获期或在菌剂中再次播种宿主植物以使丛枝菌根真菌的繁殖体扩增；在冬季温度低时，扩繁过程在温室内进行。
本发明的有益效果
1. 本发明的丛枝菌根真菌在自然状态下能够与烟草共生，通过改善烟草的营养状况尤其是磷营养来提高烟草的产量和品质，可有效提高烟草的抗旱性、抗盐碱、抗重金属等。本发明通过试验证实，丛枝菌根真菌和烟草形成丛枝菌根共生体后，所述共生体可以改善烟草的矿质营养状况，促进烟草生长，提高烟草抗病有关酶的活性，烟草的青枯病的发病率减少了50%以上，病情指数减少了34%以上，从而提高了烟草对青枯病的抗性。
2. 本发明采用纯天然的方法，几乎未使用化学药剂，简单实用，绿色环保。
具体实施方式
下面结合实施例与具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1：
（1）扩繁丛枝菌根真菌，制备混合丛枝菌根真菌菌剂：
丛枝菌根真菌初始菌种为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌2h，每100kg河沙再加入10g尿素和40g过磷酸钙配成基质，在基质中接入5%的所述丛枝菌根真菌初始菌种，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入22%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，3个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌；然后混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，混合比例为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）：摩西球囊霉（Glomus mosseae）：根内球囊霉（Glomus intraradices）=0.5:1:1，以重量比计，含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段。
（2）菌根化烟苗的培养：在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤(1)制得的混合丛枝菌根真菌菌剂，其中，以过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌，每100 g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂，播种烟草种子，使育苗盘下半部分浸入自来水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把自来水更换成1/5强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每天补足减少的水分，每2周更换一次营养液；生长 60天取烟苗，当根系菌根侵染率大于30%时即可用于移栽；
（3）试验处理：把1200g风干的农田土壤进行粉碎，过1cm筛，装入1L的陶瓷盆中。每盆移栽一株菌根化烟草幼苗，同时移栽一株不接种丛枝菌根真菌的烟苗，共2个处理。每个处理重复20次。对照处理接种60g不含有菌根结构的灭菌菌剂和菌剂滤液。生长40天后接种青枯病原菌，采用灌根法，将浓度为107cfu/ml的孢子悬液1 mL 稀释100倍浇灌到植株根部。10天后收获植物，进行测定分析。
本发明使用的蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）分别购买于北京市农林科学研究院“丛枝菌根真菌种质在资源库”、中国农业大学科研机构。
本发明的病情指数按照Garabedian的标准方法计算（Garabedian S，Grund S D V．Use of Avermectins for the control ofMeloidogyne incognita on tomatoes．Journal of Nematology，1983，15(4):503－509）。过氧化物酶的测定按照陈建勋的方法进行测定（陈建勋, 王晓峰. 植物生理学实验指导(第二版)[M]. 广州: 华南理工大学出版社. 2006. 72-74.）
结果表明，接种处理的植物菌根侵染率远高于对照处理的植物菌根侵染率，植物生物量显著增加，病情指数和发病率（见表1）显著降低。过氧化物酶酶活性显著高于对照植株（表2）。这意味着接种丛枝菌根真菌可以有效促进烟苗生长，提高抗病有关酶活性，提高烟草对青枯病的抗性。
表 1 植物收获后不同接种处理烟草青枯病的发病情况（单位：%）
表 2 植物收获后不同接种处理过氧化物酶活性（U/g.min FW，括号内数字表示标准误差）
实施例2
（1）扩繁丛枝菌根真菌，制备混合丛枝菌根真菌菌剂：丛枝菌根真菌初始菌种为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，160oC干热灭菌2h，每100kg河沙再加入5g尿素和20g过磷酸钙配成基质，在基质中接入3%的所述丛枝菌根真菌初始菌种，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入18%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，4个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌；然后混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，混合比例为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）：摩西球囊霉（Glomus mosseae）：根内球囊霉（Glomus intraradices）=1:1:1，以重量比计，含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段。
（2）菌根化烟苗的培养：在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤(1) 制得的混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，其中，以过1mm筛， 160oC干热灭菌2h的河沙作为育苗基质，每100 g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂，使育苗盘下半部分浸入自来水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把自来水更换成1/5强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每天补足减少的水分，每3周更换一次营养液；生长 70天取烟苗，当根系菌根侵染率大于30%时即可用于移栽；
（3）试验处理：选择长势良好，无病害，高矮一致、均匀的菌根化烟苗，在重庆市彭水县靛水乡新田村3组进行大田试验，按照烟草大田移栽的技术标准进行，处理设置2个，分别为未接种处理的烟草幼苗、接混合菌种的烟草幼苗，每个处理500株，试验处理共计1000株烟草，试验地面积共计1亩，雨后及时排水，发现杂草及时拔出，有虫害时适当喷药。观察烟草青枯病发病情况并分析比较。
结果表明，接种混合菌剂处理的烟草的青枯病发病率和病情指数显著低于为接种处理的烟草。
表 3 植物收获后不同接种处理烟草青枯病的发病情况（单位：%）
实施例3
（1）扩繁丛枝菌根真菌，制备混合丛枝菌根真菌菌剂：丛枝菌根真菌初始菌种为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，170oC干热灭菌2h，每100kg河沙再加入8g尿素和30g过磷酸钙配成基质，在基质中接入4%的所述丛枝菌根真菌初始菌种，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入20%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，3.5个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌；然后混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，混合比例为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）：摩西球囊霉（Glomus mosseae）：根内球囊霉（Glomus intraradices）=0.8:1:1，以重量比计，含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段。
（2）菌根化烟苗的培养：在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤(1) 制得的混合丛枝菌根真菌菌剂，其中，以过1mm筛，170oC干热灭菌2h的河沙作为育苗基质，每100 g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂，播种烟草种子，使育苗盘下半部分浸入自来水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把自来水更换成1/5强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每天补足减少的水分，每2.5周更换一次营养液；生长65天取烟苗，当根系菌根侵染率大于30%时即可用于移栽；
（3）试验处理：选择长势良好，无病害，高矮一致、均匀的菌根化烟苗，在重庆市彭水县靛水乡新田村3组进行大田试验，按照烟草大田移栽的技术标准进行，处理设置2个，分别为未接种处理的烟草幼苗、接混合菌种的烟草幼苗，每个处理500株，试验处理共计1000株烟草，试验地面积共计1亩，雨后及时排水，发现杂草及时拔出，有虫害时适当喷药。观察烟草青枯病发病情况并分析比较。
结果表明，接种混合菌剂处理的烟草的青枯病发病率和病情指数显著低于为接种处理的烟草。
表 4 植物收获后不同接种处理烟草青枯病的发病情况（单位：%）
Claims (1)
1.一种提高烟草青枯病抗性的方法，包括下列步骤：
（1）扩繁丛枝菌根真菌，制备混合丛枝菌根真菌菌剂：丛枝菌根真菌初始菌种为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）、根内球囊霉（Glomus intraradices）；以三叶草或玉米为宿主植物；3:1的河沙和土壤过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160～170oC干热灭菌2h，每100kg河沙再加入5～10g尿素和20～40g过磷酸钙配成基质，在基质中接入3%～5%的所述丛枝菌根真菌初始菌种，用层施法或混施法拌匀，然后在基质中加入18%～22%的水，播种宿主植物的种子，常规管理，3～4个月后即可收获扩繁后的丛枝菌根真菌，收获的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混匀，含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的风干基质即为扩繁后的丛枝菌根真菌；然后混合扩繁后的丛枝菌根真菌制备混合丛枝菌根真菌菌剂侵染烟草，混合比例为蜜色无梗囊霉（Acaulospora mellea）：摩西球囊霉（Glomus mosseae）：根内球囊霉（Glomus intraradices）=0.5～1:1:1，以重量比计，含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段；所述扩繁后侵染烟草的丛枝菌根真菌的密度为：孢子密度>20个/克干土；
（2）菌根化烟苗的培养：在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤(1) 制得的混合丛枝菌根真菌菌剂，以过1mm筛，121oC高压蒸汽灭菌或160-170oC干热灭菌2h的河沙作为育苗基质，每100 g育苗基质加入10 g混合丛枝菌根真菌菌剂，播种烟草种子，使育苗盘下半部分浸入自来水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把自来水更换成1/5～1/2质量浓度的霍格兰(Hoagland)营养液，每天补足减少的水分，每2～3周更换一次营养液；生长 60～70天取烟苗，当根系菌根侵染率大于30%时即可用于移栽；
（3）将步骤(2)得到的菌根化烟苗在田间进行移栽；根据土壤肥力进行施肥管理，同时进行水分、杂草田间管理，使植物正常生长。
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