CN106754398B - 一种拜莱青霉及其在农业生产中的应用 - Google Patents

一种拜莱青霉及其在农业生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种拜莱青霉菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2015690。所述拜莱青霉解磷效果显著，在油菜大田栽培实验中，拜莱青霉处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了354.7%和297.8%，有效磷含量比空白处理组提高了89.8%。所述拜莱青霉还能显著提高水稻的育苗质量，并能与羟磷灰石协同作用，有效促进游离态重金属的固定，降低土壤中游离态重金属的含量，在一定程度上的恢复重金属污染土壤，前景广阔。

Description

一种拜莱青霉及其在农业生产中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种拜莱青霉及其在农业生产中的应用。
背景技术
磷是植物生长所必须的营养元素之一，磷对植物的重要性不言而喻，同时磷元素是植株体内多种化合物的组成成分，参与植物体的新陈代谢，不仅能够提高作物含量，还能增加植物抗逆性。植株主要利用土壤中的有效磷，但是，土壤中的磷95％以上为植物难以利用的无效磷，为了满足作物的生长，人们往往会通过施加大量磷肥来提高作物产量，这导致磷酸盐迅速在土壤中积累，不仅造成磷素资源的浪费，而且对水体环境安全构成一定的威胁。因此，提高土壤中难溶性磷的利用效率对于农业生态系统的健康发展具有重要意义。研究表明，土壤中大量存在一些能够转化难溶磷的溶磷微生物，溶磷微生物在转化土壤难溶磷方面已经引起了国内外专家的广泛关注，被世界公认为经济高效环保的生物措施。
溶磷微生物是土壤中存在的一些能将难溶态的无机磷或有机磷转化为易于被植物吸收利用的水溶性磷，提高了土壤的供磷水平，从而增加作物产量。另外，溶磷微生物还能分泌生长调节物质，促进农作物植物根系对锌、铜等其它营养元素的吸收，增强植物抗病能力，并减少环境污染。
具有溶磷作用的微生物种类繁多，大体上可分为三大类：溶磷细菌、溶磷真菌和溶磷放线菌。溶磷细菌现研究报道的有：芽孢杆菌属(Bacillus)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、肠细菌属(Enterbacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)等的26个菌属；溶磷真菌报道的有青霉菌属(penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉菌属(Aspergillu)、小菌核菌属(Sclerotium)和根霉菌属(Rhizopus)等；溶磷放线菌主要为链霉菌属(Streptomyces)、AM菌根菌等。
Narsian等(2000)通过对不同溶磷菌溶磷能力的比较，得出曲霉在不同的溶磷菌中的溶磷活性最高，并将磷矿粉中45％的磷溶解出来。Agnihotri等(1970)研究的一株拜莱青霉可以将磷矿粉中80％的磷溶解出来。Kucey和Leggett(1989)将拜莱青霉菌(Penicilliumbilaji)接种与盆栽土壤中，同时加入磷矿石，研究发现接种菌的油菜吸磷量与施用磷肥油菜额定的吸磷量没有差异。范丙全(2010)将溶磷青霉菌P8接种于土壤中，发现接种青霉菌P8后能提高作物的吸磷量，青霉菌P8对作物的促生效果较为明显。
研究证明，溶磷微生物不仅能提高土壤有效磷，还可以促进作物的生长，提高作物的抗逆性，应用溶磷微生物，提高当季磷肥使用率，增加土壤难溶磷的转化率，节省磷肥的浪费，对延长我国有限磷矿使用年限和促进农业持续发展意义重大，并且对解决施加磷肥带来的环境污染问题具有深远的实践意义。因此，筛选出溶磷稳定、增产稳定、环境适应力强，高效的溶磷微生物菌株刻不容缓。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高效解磷的拜莱青霉(Penicilliumbilaji)菌株以及该菌株在农业生产中的应用。所述拜莱青霉菌株是从山东省莱州市彭家磷矿区的土壤中筛选得到的，能高效利用土壤中的难溶磷，并有效降低土壤中的重金属含量，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一种拜莱青霉VLD-11(Penicillium bilaji VLD-11)，已于2015年11月23日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015690。
本发明另一方面提供了一种微生物制剂，是通过将上述拜莱青霉VLD-11进行发酵得到的。
本发明还提供了一种解磷菌剂，包含所述微生物制剂。
所述解磷菌剂还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉、黑曲霉中的任意一种或两种或多种的组合。
本发明还提供了所述拜莱青霉在农作物育苗中的应用。
本发明还提供了所述拜莱青霉在土壤修复中的应用。
本发明还提供了一种土壤修复剂，包含所述拜莱青霉和羟磷灰石。
本发明筛选到的拜莱青霉VLD-11能将难溶性无机磷液体培养基中的难溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，使培养基中有效磷含量高达1.976mg/mL，解磷效果显著。在油菜大田栽培实验中，拜莱青霉VLD-11处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了354.7％和297.8％，比培养基处理组分别提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白处理组提高了89.8％，比培养基处理组提高了87.1％。本发明提供的拜莱青霉VLD-11还能显著提高水稻的育苗质量。与空白对照组相比，拜莱青霉VLD-11处理组水稻秧苗的茎粗，根数，叶龄，1-2叶间距分别提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二叶长和叶绿素含量也得到不同程度的提高，效果非常显著。此外，所述拜莱青霉VLD-11能与羟磷灰石协同作用，有效促进游离态重金属的固定，降低土壤中游离态重金属的含量，在一定程度上的恢复重金属污染土壤，前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
实施例1具有解磷功能的微生物筛选与鉴定
1、初筛
土壤样品：取自山东省莱州市彭家磷矿区的土壤；
土壤稀释液的制备：称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：106-107的土壤稀释溶液。
取0.1ml土壤稀释溶液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO4·7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)2 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)上，30℃培养箱中倒置培养2-3天，观察培养基上长出的菌落，其中有11个菌落周围产生了明显的颜色变化，并有透明圈产生，将其分别命名为VLD-1，VLD-2，……，VLD-11。
2、复筛
将实施例1初筛得到的11株菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO4·7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)2 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)上，30℃培养3天后，观察菌落周围透明圈的大小，结果发现透明圈最大的3株菌株分别为VLD-2，VLD-9，VLD-11。
将上述3株菌分别接种到50mL难溶性无机磷液体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO4.7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min)中，30℃，200rpm，培养7天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组；分别检测培养液中的有效磷的含量，具体结果见表1。
2.1磷标准曲线的绘制
依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。
2.2培养液有效磷含量测定
在无菌条件下分别取上述3株菌的培养液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表1。
表1不同菌株的解磷效果
样品 有效磷含量(mg/mL)
空白对照组 0
VLD-2 1.254
VLD-9 1.139
VLD-11 1.976
从表1中的数据可以看出，本发明从磷矿区土壤中筛选到的三株菌株均具有较强的解磷能力，能将培养基中的难溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，其中VLD-11菌株的的解磷效率最高，其培养液中有效磷含量高达1.976mg/mL，取得了意料不到的效果。
3、菌株鉴定
申请人采用分子生物学的方法对筛选到的VLD-11菌株进行鉴定，测得其18s rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行blast比对。结果显示，其18s rDNA序列与拜莱青霉(Penicillium bilaji)的序列相似度最高，达99％。申请人确认VLD-11菌株为拜莱青霉(Penicillium bilaji)，并将其命名为拜莱青霉VLD-11(Penicillium bilaji VLD-11)。
申请人已于2015年11月23日将上述拜莱青霉VLD-11(Penicillium bilaji VLD-11)于保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015690。
实施例2拜莱青霉VLD-11在油菜大田栽培实验中的应用
1、拜莱青霉VLD-11菌液的制备：
先将上述拜莱青霉VLD-11接种到PDA固体培养基上，30℃培养3-4天至孢子成熟，将长好的孢子用适量无菌生理盐水洗下，转接入马铃薯液体培养基中，充分混合均匀，于30℃培养4天，发酵液中孢子含量为109-1010CFU/mL。
2、实验地点：青岛市崂山区枯桃村油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。
3、实验过程：
选取2m×2m的方形区域作为一个实验区，共设置30个实验区，且每个实验区之间保持1米的间隔。
实验共设3个组：①空白对照组：不添加任何物质；②培养基处理组：在每个实验区中按40mL/m2的比例均匀喷洒上述灭菌的马铃薯液体培养基，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀；③拜莱青霉VLD-11处理组：在每个实验区中按40mL/m2的比例均匀喷洒上述拜莱青霉VLD-11发酵菌液，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。
1)种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥。
2)播种与收获：在每个实验区均匀播种30g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种45天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。
3)收获油菜的同时，分别采集每个实验区的土样，采用Olsen法检测土样中有效磷的含量，并进行比较。
试验结果表明：与空白对照组相比，培养基处理组油菜的平均鲜重和干重分别提高了5.56％和6.21％，有效磷含量提高了3.1％；拜莱青霉VLD-11处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了354.7％和297.8％，比培养基处理组分别提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白处理组提高了89.8％，比培养基处理组提高了87.1％。从而说明，使用本发明筛选到的拜莱青霉VLD-11能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，取得了意料不到的效果。
本发明所述拜莱青霉VLD-11可单独使用，也可与黑曲霉、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一种或两种或多种的组合混合制备解磷菌剂，能使土壤中有效磷的含量普遍提高50％-90％，效果显著。
实施例3拜莱青霉VLD-11在水稻育苗中的应用
1、实验地点：黑龙江省鹤岗市宝泉岭农场二队4号育苗大棚。
2、实验处理组设计：
空白对照组：仅采用育苗基质(购自浙江锦海育苗基质厂)；
拜莱青霉VLD-11处理组：1.2kg拜莱青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)与1吨育苗基质掺匀；以上两个处理组的播种、灌溉和施肥等管理相同，整个育苗期约为40天。
3、实验结果及分析
(1)水稻秧苗形态及叶绿素含量评价
从各处理组育苗盘的中央随机抽取100株秧苗，用清水冲洗干净后进行考苗，并检测第二叶的叶绿素含量。结果见表3。
表2拜莱青霉VLD-11对水稻苗株生长的影响
从表2的结果可以看出，本发明提供的拜莱青霉VLD-11能显著提高水稻的育苗质量。与空白对照组相比，拜莱青霉VLD-11处理组水稻秧苗的茎粗，根数，叶龄，1-2叶间距分别提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二叶长和叶绿素含量也得到不同程度的提高，效果非常显著。
(2)水稻秧苗素质评价
百株干重和壮苗指数是秧苗素质高低的重要指标。
壮苗指数＝(茎粗×100株秧苗全株干重)/株高。
本发明所述拜莱青霉VLD-11处理组的水稻秧苗百株干重比空白对照组增加了36.32％，壮苗指数增加了56.15％，取得了意料不到的技术效果。
综上所述，本发明筛选到的拜莱青霉VLD-11不仅能有效提高土壤中有效磷的含量，还能能有效加快水稻秧苗的叶龄进程，有利于争取积温；增加茎粗，有利于茎维管束的发育，为保障水稻穗数和形成大穗提供了必要的秧苗基础；增加叶间距和叶长，提高叶片叶绿素含量，有利于促进光合作用和光合产物的积累；增加水稻根数，有助于加快秧苗移栽后的返青速度。因此，所述拜莱青霉VLD-11能显著提高水稻秧苗的素质，进而直接有利于提高水稻产量。
实施例4拜莱青霉VLD-11在土壤修复中的应用
采集青岛市崂山区仰口景区山地土壤10kg。所釆土壤在干燥通风处自然风干，研磨过2mm孔径筛，混匀，污染Pb的添加浓度为2g/kg，以Pb(NO3)2溶液的形式加入土壤后混匀，置通风处自然风干，老化60天后过2mm孔径筛，并充分混匀，土壤中Pb2+含量为2.04g/kg。
分别称取过8目的风干土壤200g于500mL三角瓶中，处理组1只添加10g羟基磷灰石(100目)；处理组2只添加2g拜莱青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)；处理组3同时添加10g羟基磷灰石(100目)和2g拜莱青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)。将羟基磷灰石、拜莱青霉VLD-11孢子粉与土壤充分混匀，用去离子水调节土壤含水量至20％～25％，于室温培养，同时设置空白对照组，各处理设置三个重复。培养30天后，取样烘干，分别用二乙三胺五乙酸(DTPA)溶液浸提游离态重金属铅，振荡过滤，测定滤液中游离铅的浓度，计算游离铅的去除率，具体结果见表1。
表1羟基磷灰石和/或拜莱青霉对土壤中游离铅的去除效果
从表1的结果可以看出，单独添加5％羟基磷灰石的处理组1土壤中游离铅的去除率仅为19.75％，而单独添加1％本发明提供的拜莱青霉VLD-11孢子粉的处理组2土壤中游离铅的去除率能达到30.78％，效果非常显著；同时添加羟基磷灰石和拜莱青霉VLD-11的处理组3土壤中游离铅的去除率高达90.64％，说明拜莱青霉VLD-11能与羟磷灰石协同作用，有效促进游离铅的固定，降低土壤中游离铅的含量，在一定程度上的恢复铅污染土壤。
除了铅污染土壤之外，对于其他重金属污染土壤，如锌污染、铜污染、镉污染、汞污染等，本发明提供的拜莱青霉VLD-11均具有一定的修复效果，对游离态重金属的去除率能达到30％以上，拜莱青霉VLD-11与羟磷灰石协同作用，对游离态重金属的去除率能达到85％以上，效果显著，应用前景广阔。

Claims (7)

1.一种拜莱青霉(Penicillium bilaji)，其特征在于，所述的拜莱青霉的保藏编号为CCTCC NO：M2015690。
2.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂是通过将权利要求1所述的拜莱青霉进行发酵得到的。
3.一种解磷菌剂，其特征在于，所述的解磷菌剂包含权利要求2所述的微生物制剂。
4.如权利要求3所述的解磷菌剂，其特征在于，所述的解磷菌剂还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉、黑曲霉中的任意一种或两种或多种的组合。
5.权利要求1所述的拜莱青霉在农作物育苗中的应用。
6.权利要求1所述的拜莱青霉在土壤修复中的应用。
7.一种土壤修复剂，其特征在于，所述的土壤修复剂包含权利要求1所述的拜莱青霉和羟磷灰石。
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