CN104312945A

CN104312945A - 一株油菜内生菌解淀粉芽孢杆菌4-3及其应用方法

Info

Publication number: CN104312945A
Application number: CN201410503991.5A
Authority: CN
Inventors: 刘冬华; 伍善东; 郭照辉; 单世平
Original assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Current assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: CN104312945B

Abstract

本发明一株油菜内生菌解淀粉芽孢杆菌4-3及其应用方法。根据该菌株的菌体形态特征、菌落特征和生理生化性状，结合16S rDNA的序列结果分析，初步确定该内生菌株4-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株具有很强的拮抗菌核病核盘病菌的能力。试验结果表明：油菜内生菌株4-3对油菜核盘菌的生物防效达100％。同时，该油菜内生细菌4-3还具有优良的溶磷解钾的功能，制成生物菌肥，能减少化肥的使用量，对我国的绿色农业具有巨大的应用前景。

Description

一株油菜内生菌解淀粉芽孢杆菌4-3及其应用方法

技术领域：

本发明涉及一株油菜内生细菌解淀粉芽孢杆菌4-3及其应用。

背景技术：

油菜是我国主要的油料作物，油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)是油菜生产中的三大病害之一，在我国南方油菜产区发病尤其严重，发病率一般在10％～30％,严重的高达80％以上,造成巨大经济损失(邱业先，汪金莲，王卫芳等.油菜菌核病抗性诱导菌的筛选[J].江西农业大学学报,1996,12(18):395-398.)。在长江中下游及东南沿海主要油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地发生尤为突出，严重影响了我国的油菜生产。目前，在生产上以选择抗病品种和化学药剂进行防治，但存在抗病品种资源缺乏和化学药剂污染农产品和环境等问题，而生物防治具有对环境污染小，成本低，作用持久等优点越来越受到人们的重视。

内生菌(endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部对植物组织不引起明显病害症状的微生物。已发现的内生细菌对宿主植物的有益作用有固氮作用、促进植物生长、抗逆境、抗动物摄食、抗病原真菌和细菌等(邹文欣，谭仁祥.植物内生细菌研究新进展[J].植物学报，2001，43(9)：881—892.)。据报道，现已从棉花、水稻、马铃薯和辣椒等多种植物中分离筛选到对植物病害具有生防作用的内生细菌(江木兰，赵瑞，胡小加，等.油菜内生生防菌BY-2在油菜体内的定殖与对油菜菌核病的防治作用[J].植物病理学报，2007，37(2):192-196.)。张献芳等从油菜和水稻植株上分离到内生细菌后，分别用利福平和硫酸链霉素标记目标菌株，再以浸种，灌根和接种无菌苗3种方法接种油菜后，均可以在油菜体内分离到被标记的菌株(张献芳，文凯，逯晋忠，等.2株内生细菌在油菜体内的定殖、促生长及抗虫性检测[J].华中农业大学学报，2011，4(30):143-147.)。

陈英化等报道了从棉花健株茎内分离筛选到一株棉花黄萎病内生拮抗细菌L-4-2为解淀粉芽孢杆菌，用100mg·L^-1利福平诱导菌株后，能在棉花的根、茎中分离到该菌株。(陈英化，李爱霞，冯丽娜等.棉花黄萎病内生拮抗细菌L-4-2的鉴定及定殖[J].西北农业学报，2012，21(2)：68-71)。张荣胜等报道了菌株L x11为解淀粉芽孢杆菌，盆栽试验结果表明L x11对水稻细菌性条斑病菌的防效达62.5％，大面积示范试验结果表明菌株Lx11对水稻细菌性条斑病菌的田间防效达60.2％，显著高于化学药剂20％叶枯唑的防效(51.2％和45.8％)，(张荣胜，刘永锋，陈志谊.水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究[J].中国生物防治学报，2011，27(4)：510-514)。

发明内容：

本发明的目的在于提供一株油菜内生细菌及其在拮抗核盘病菌和促进无机磷、有机磷和不溶性钾的吸收上的应用，以提高油菜拮抗菌核病的能力和促进油菜对无机磷、有机磷和不溶性钾的吸收。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)4-3，保藏编号为CCTCC M NO:2014320。

培养所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的培养基，其特征在于，

培养基配方：甘露醇1.8g、胰蛋白胨1.6g、NaCl 0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、KH₂PO₄0.4g、1％MnSO₄0.2ml、1％FeC₆H₅O₇0.5ml、1％Na₂MoO₄·2H₂O 0.4ml、去离子水100ml、pH7.2。

所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，用于拮抗核盘病菌。尤其是用于拮抗引起油菜菌核病的核盘病菌。

所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，用于降解无机磷、有机磷和解钾。

所述的无机磷包括磷酸三钙。

所述的有机磷包括卵磷脂。

所述的钾包括钾长石粉。

所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，用于发酵制作油菜增产的菌肥。

用于所述的解淀粉芽孢杆菌4-3发酵的培养基，淀粉2.0g、黄豆粉1.0g、甘露醇0.1g、蛋白胨0.2g、NaCl 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、水100ml、pH7.2。

本发明所述油菜内生细菌4-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

该菌株的筛选步骤如下：

1、分别从长沙县、望城、湖南省农科院等地采集健壮油菜植株，进行内生菌的分离，共分离到30株内生菌。

2、用分离的内生菌与核盘病菌进行平板对峙拮抗实验和内生菌发酵菌液对核盘病菌的抑菌圈实验，得到效果较好的拮抗菌一株，该内生菌的编号为：4-3。

3、通过盆栽试验，进一步验证了内生细菌4-3对油菜菌核病的拮抗效果。根据该菌株的形态特征和生理生化特征，结合16S rDNA的序列结果分析，初步确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

本发明还提供了所述的油菜内生细菌4-3在防治油菜菌核病中的应用，本发明针对目前油菜菌核病缺少有效的化学药剂，加之菌核病病原(核盘菌)对化学农药易产生抗药性的问题，通过对油菜内生菌的分离及其防效试验，分离出具有拮抗作用的内生菌4-3，试验证明，油菜内生拮抗菌4-3对油菜菌核病的有效性达100％，可以应用于生物有机肥，对减少化肥、农药残留，减轻化肥、农药的污染发展绿色农业具有重要的意义，预期带来巨大的生态效益，社会效益和经济效益。同时，该油菜内生细菌4-3还具有优良的溶磷解钾的功能，制成生物菌肥，能减少化肥的使用量，对我国的绿色农业具有巨大的应用前景。

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)4-3已于2014年7月3日保藏于中国湖北武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M NO:2014320。

附图说明

图1为以本发明4-3菌株16S rDNA序列为基础构建的系统发育树。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：植物内生菌的分离

分别从长沙县、望城、湖南省农科院等地采集健壮油菜植株，取根部洗净泥沙，削取白色健壮无斑的根须和韧皮部。用滤纸吸干表面水份后，用75％的酒精浸泡，进行表面灭菌处理12分钟，无菌水浸泡洗涤6次，再用0.2％的HgCl₂浸泡，进行表面灭菌18分钟，无菌水浸泡洗涤9次，第9次的浸泡洗涤水留下做为对照。然后将油菜根须韧皮部放入无菌碾钵中加入适量无菌水碾磨成浆，然后取浆液进行梯度稀释至5阶。从每个稀释梯度中吸取0.5ml油菜植株浆液到加有土豆加富琼脂培养基(土豆200.0克葡萄糖20.0克酵母膏2.0克蛋白栋2.0克牛肉膏2.0克硫酸镁0.5克磷酸二氢钾1.0克水1000.0ml琼脂18.0克PH自然)的平板上，每个稀释度做三至五个重复。28℃恒温培养箱中培养2-7天。挑取不同形态的单个菌落进行纯化、保藏备用。

实施例2：内生拮抗菌的筛选

平板对峙法初筛

取核盘病菌斜面菌种(带琼脂块)：挑取核盘菌菌块置于装有土豆加富培养基的(直径为9厘米)培养皿中央，以核盘菌菌块为圆心，在距此圆心3cm的圆环上间隔3cm分6处(使每处与圆心等边)点接内生菌，做三个重复。置于23℃恒温培养箱中培养3-7天。观察发现内生菌4-3对核盘菌具有明显的拮抗性。

杯碟法复筛

挑取核盘菌菌块置于装有土豆加富培养基的(直径为12厘米)生化实验培养皿中央，在23℃恒温箱中培养2天，核盘菌落已扩展至直径约2-3cm时，在距核盘菌菌丝扩展的外缘呈等边三角形摆上三个牛津杯，再将培养5天的拮抗菌菌液加入至牛津杯中，每处理做三个重复。置于23℃恒温箱中培养3-5天，测得抑菌圈直径平均为19.3mm(牛津杯外径为5.0mm)。

实施例3：用油菜内生拮抗菌4-3处理油菜后，油菜对核盘病菌的拮抗性试验

1、拮抗菌液的培养

将拮抗内生菌4-3接种于装有100ml优化培养基(甘露醇1.8g、胰蛋白胨1.6g、NaCl 0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、KH₂PO₄0.4g、1％MnSO₄0.2ml、1％FeC₆H₅O₇0.5ml、1％Na₂MoO₄·2H₂O 0.4ml、去离子水100ml、pH7.2，培养温度32℃。)的三角瓶中，摇床培养3天。培养条件：摇床转速为180rpm。

2、对油菜植株进行处理

取拮抗菌液2瓶加水稀释至1500ml左右，对油菜植株进行浇根处理，共浇灌3次，每次间隔10天左右，浇灌菌液以晴天傍晚时为佳。以浇清水的油菜植株做为对照。(每个试验样本油菜12株)常规管理。

3、用“牙签穿刺法”在油菜植株上接种核盘菌

将牙签放入液体土豆加富培养基中一起灭菌，然后放入已接种有核盘菌并已培养了二天的培养皿中，23℃恒温箱中培养5-7天，待牙签上长有核盘菌后，将带菌牙签穿刺到供试验油菜植株的茎上。20天左右后检查油菜植株被核盘菌侵染的情况。见表1。

表1：4-3号菌在油菜植株上对核盘菌的试验结果

实施例4：油菜内生细菌4-3降解无机磷的实验

以点接法将内生细菌4-3接种于装有培养基(磷酸三钙5.0克，蔗糖10.0克，硫酸铵0.5克，氯化钠0.2克，硫酸镁0.1克，氯化钾0.2克，酵母粉0.5克，1％硫酸锰3ml，1％硫酸亚铁3ml，pH6.8-7.2，琼脂20克，水1000ml)的平板上，置于28℃恒温箱中培养10天左右,观察到培养皿中有明显的透明圈，透明圈直径D为1.95mm,菌圈直径d为1.35mm，D/d＝1.44。

实施例5：油菜内生拮抗菌4-3降解有机磷(卵磷脂)的实验

以点接法将内生拮抗菌4-3接种于装有培养基(葡萄糖10.0克，硫酸铵0.5克，氯化钠0.3克，氯化钾0.3克，1％硫酸亚铁3ml，1％硫酸锰3ml，卵磷脂0.2克，酵母粉0.4克，碳酸钙5.0克，琼脂20克，pH6.8-7.2，水1000ml)的平板上，置于28℃恒温箱中培养10天左右,观察到培养皿中有明显的透明圈，但透明圈比较小。

实施例6：油菜内生细菌4-3的解钾实验

1、处理钾长石：磨碎，过100目的筛，用10％的盐酸浸泡24小时，再用去离子水浸泡洗涤6次，烘干备用。

2、将内生细菌4-3接种于装有80ml培养基(蔗糖15.0克，七水硫酸镁0.2克，二水硫酸钙0.1克，氯化钠0.2克，钾长石粉5.0克，pH7.0-7.5，水1000ml)的三角瓶中，置于摇床培养。培养条件：温度为28℃；转速为180r·min^-1。培养15天，将培养液离心，3000r·min^-1离心10分钟，收集上清液，用火焰光度计测上清液中速效钾的含量，以不接种的培养液做为对照。经测量、计算，上清液中速效钾的含量为10.7mg·L^-1，对照中速效钾的含量为1.4mg·L^-1，上清液中速效钾的含量增加664％。

实施例7：内生细菌4-3的鉴定

油菜内生细菌4-3的菌落形态特征：单菌落圆形或不规则形，边缘不整齐。白色或灰白色。表面粗糙不透明，菌落凸起有皱褶，质地柔软，易挑取。产生特殊气味。

油菜内生拮抗菌4-3的生理生化特征：有芽孢，革兰氏染色阳性，甲基红试验阴性，V.P.反应阳性，吲哚试验阴性，发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇发酵试验产酸不产气，形成菌膜，液化明胶，水解淀粉阳性，接触酶阳性硫化氢试验阴性，柠檬酸盐利用阳性，2％NaCl生长试验阳性，5％NaCl生长试验阳性，7％NaCl生长试验阳性，10％NaCl生长试验阴性。

油菜内生细菌4-3的16S rDNA序列分析：

提取DNA后，对16S rDNA目的片断PCR进行扩增。

引物序列：(F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

(R)5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系(50μL)：去离子水39μL，PCR buffer 5μL，2.5mMdNTP 2μL，上、下游引物20uM各lμL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1μL。

PCR反应条件：1、94℃预变性2min；2、94℃变性50s；58℃退火30s；72℃延伸1.5min、30个循环；3、72℃延伸10min。PCR产物回收插入pMD18-T载体后由上海生工进行序列测定。将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，选择同源性高的序列使用MEGA5.1软件构建系统发育树。如图1所示。

实施例8：内生菌4-3耐受链霉菌素菌株的诱导及其在油菜幼苗中的定植试验

耐受链霉菌素4-3菌株的诱导：

先将4-3菌株划线接种于含有最终浓度为1ug/ml链霉素的培养基平板中，待4-3菌株长出后，再划线接种于含有最终浓度为2ug/ml链霉素的培养基平板中。随后逐渐加大培养基中链霉素的浓度，直到4-3菌株能耐受385ug/ml链霉素并且性状稳定为止。

4-3菌株在油菜幼苗中的定植：

取油菜种子清洗干净后用无菌水浸洗2次后沥干，用培养18小时的耐受385ug/ml链霉素的4-3菌株培养液稀释5倍后浸泡，随后将种子连同菌液倒入垫有滤纸的直径为12cm的平皿中，使菌液在1-2mm左右，期中始终保持湿润直至种子萌发长苗。待培养7天，种苗长出茎叶后选取健壮、根须多且白的种苗10～30株，清洗干净后用75％的乙醇浸泡5分钟；用无菌水浸洗6次后再用0.2％HgCl₂浸泡5分钟；然后用无菌水浸洗9次(最后一次浸洗液留作对照)，加入9ml无菌水，在无菌条件下研磨成浆后吸取浆液0.5ml至4.5ml无菌水中作梯度系列稀释至5阶；倒序吸取0.2ml稀释液于倒好含有385ug/ml链霉菌素的培养基并冷却的平皿中(每稀释度做3个重复)涂布均匀后倒置于32℃恒温箱中培养。

培养3～4天后根据4-3的菌落形态特征检查并计数单个菌落。用耐受链霉菌素的4-3菌株培养液处理油菜籽后7天，在油菜种苗中该菌的菌数浓度可达1.04×10³cfu/株。

实施例9：油菜内生菌4-3的增产试验

1#菌肥：实施例3培养得到的4-3菌液经发酵罐用发酵配方：淀粉2.0g、黄豆(饼)粉1.0g、甘露醇0.1g、蛋白胨0.2g、NaCl 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、水100ml、pH7.2.，静置发酵72小时的菌液(菌数为：8.56×10⁸cfu/ml)与麦麸按质量比1:1.2配制而成。发酵条件：培养温度32℃、空气压力：0.040MPa；空气流量：11.0L/Min；转速：250rpm,；接种量：1％；50L发酵罐装液量为25L。

2#菌肥：解磷细菌ACCC 01467(中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌种，能很好地降解有机磷和无机磷)经发酵罐发酵72小时的菌液(发酵条件同上，)菌数为：9.81×10⁸cfu/ml，与麦麸按1:1.2配制成菌剂。将该菌剂与4-3菌剂(1#菌肥)等比混合而成。

将菌肥均匀平铺在整好的土地上(用量：1～2kg/m²)，随后播种油菜籽，稍扒匀，洒水并保持土壤湿润。对照则作不施菌肥的处理。约1个月后带土移栽油菜苗到试验地。试验地面积均等，对照组栽9行(70哇136单株)；试验组1#菌肥组栽9行(67哇135单株)；2#菌肥组栽9行(65哇132单株)。在油菜苗成活回青，移栽后约1个月施第一次肥(脲50g；硼酸2g。溶水喷洒)；再一个月后照同样施第二次肥。收割时各组随机抽样10个单株(测量株高、数分支、测单株产量)，见表2；分别测各处理的总产量，见表3。试验结果显示4-3用作菌肥增产效果明显，若与解磷细菌混合(2#菌肥)使用效果更佳。

表2：各处理的分枝数(单位：个)、株高(单位：cm)、单株产量(单位：g)

表3：各处理的总产量(单位：g)

组号	总产量g	平均单株产量g	总增产率％
				CK	871.62	6.41
1#菌肥	957.82	7.10	+9.89
				2#菌肥	1000.83	7.58	+14.82

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)4-3，保藏编号为CCTCC M NO:2014320。

2.培养权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的培养基，其特征在于，

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，其特征在于，用于拮抗核盘病菌。

4.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，其特征在于，用于拮抗引起油菜菌核病的核盘病菌。

5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，其特征在于，用于降解无机磷、有机磷和解钾。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述的无机磷包括磷酸三钙。

7.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述的有机磷包括卵磷脂。

8.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述的钾包括钾长石粉。

9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌4-3的应用方法，其特征在于，用于发酵制作油菜增产的菌肥。

10.用于权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌4-3发酵的培养基，其特征在于，淀粉2.0g、黄豆粉1.0g、甘露醇0.1g、蛋白胨0.2g、NaCl 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、水100ml、pH7.2。