CN115305220B - 一种具有固氮和促进植物生长能力的假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一种具有固氮和促进植物生长能力的假单胞菌及其应用。本发明从植物根际土壤中分离得到一株假单胞菌，将其命名为1502IPR‑02，并对其进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC NO.24754。本发明提供的假单胞菌1502IPR‑02为革兰氏染色阴性菌，具有良好的固氮能力，可将空气中的氮转化为可被植物利用的氮，增加土壤养分，促进植物对氮的吸收，同时其能够成功定殖于植物根际土壤，提高植物光合作用并促进植物生长，在植物促生领域具有很大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一种具有固氮和促进植物生长能力的假单胞菌及其应用。
背景技术
花生是世界上第五大油料作物，玉米是重要的饲料来源，在畜牧业、养殖业、水产养殖业等都占据的重要的地位。
氮素作为作物生长发育必需的三大营养元素之一，是构成蛋白质的主要成分，参与植物生长发育的多种生理过程。作物的生长发育过程对氮的需求量很高，且随着作物的收获会从土壤中带走大量的氮，因此农业生产过程中需要施用充足的氮。然而，现有技术为了追求产量往往过量施用氮肥，产生一系列的负面问题，如土壤板结、水体富营养化、地下水污染、全球变暖、光化学烟雾、饮水和食物中硝酸盐积累等，严重阻碍了农业的可持续发展和人类的身体健康。因此通过实验室手段探究其他绿色无污染的途径以替代大量化学氮肥施用具有十分重要的现实意义。
长久以来，生物固氮对自然界氮素循环和生物地球化学过程至关重要。固氮菌与植物除生物固氮以外的有益的互作，例如提高土壤肥力、拮抗病原菌等来改善植物营养状况和提高生物量。缺氮时，植物会通过根系活动，增加根系与土壤的接触面积；吸引固氮菌并定殖到根系，获得可利用的氮素。固氮菌和植物之间通过共生和非共生的方式，交换彼此所需的营养物质。越来越多的研究表明，自生固氮菌-土壤和植物的有益互作，可以促进植物氮营养的改善和作物产量的提高。因此利用微生物进行固氮在降低氮肥施用量、提高农作物产量、减少环境污染促进农业可持续发展等方面具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种具有固氮和促进植物生长能力的假单胞菌及其应用。
本发明从花生玉米间作体系中间花生根际土壤中分离得到一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)，将其命名为假单胞菌1502IPR-02，并对其进行鉴定，其菌落及菌体特征为：菌落圆形，中心突起，颜色淡黄，边缘光滑，菌体呈半透明状。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阴性，无芽孢。和假单胞菌的理化性质相符。
本发明进一步将该菌株进行了生物保藏，保藏信息如下：
保藏编号：CGMCC No.24754；分类命名：假单胞菌Pseudomonas sp.；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号邮编100101；保藏日期：2022年4月22日。
本发明进一步提供假单胞菌1502IPR-02的发酵产物。
进一步地，所述假单胞菌1502IPR-02的发酵采用的培养基为LB培养基，其组成为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；氧化钠10g；加蒸馏水定容至1000mL；pH＝7.0，121℃灭菌20min；发酵的条件为：温度为30℃，转速为150-200rpm。
第二方面，本发明提供一种菌剂，包括所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02或其发酵产物。
进一步地，所述菌剂为植物生长促进剂、植物光合改善剂或植物氮营养改善剂。
本发明进一步提供包括所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，或所述菌剂的生物肥料。
本发明进一步提供所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在促进空气中的氮转化为能够被植物有效吸收的氮营养中的应用。
本发明进一步提供所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在促进植物对土壤中氮吸收的应用。
本发明进一步提供所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在提高植物光合作用中的应用。
本发明进一步提供所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在促进植物生长发育中的应用；
进一步地，所述促进植物生长发育包括：
提高植物的株高和干重。
本发明具备如下有益效果：
本发明从植物根际土壤中分离得到一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02，该菌株具有高效固氮能力，将空气中的氮转化为可被植物利用的氮，增加土壤养分，本发明提供的假单胞菌1502IPR-02能够促进花生及玉米对土壤氮的吸收，改善植物氮营养，提高植物光合作用，提高花生和玉米的产量。本发明提供的假单胞菌1502IPR-02在应用过程中，无污染，无残留，生物环保，在植物促生领域具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02对花生影响的照片；其中，左为对照组的花生，右为经过菌株1502IPR-02的菌液处理过的花生。
图2为本发明实施例2提供的对照组和经过假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02处理的花生叶片SPAD值统计结果。
图3为本发明实施例2提供的对照组和经过假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02处理的花生的株高统计结果。
图4为本发明实施例2提供的对照组和经过假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02处理的花生的干重统计结果。
图5为本发明实施例2提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02对玉米影响的照片；其中左为对照组，右为经过菌株1502IPR-02的菌液处理过的玉米。
图6为本发明实施例2提供的对照组和经过假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02处理的玉米叶片SPAD值统计结果。
图7为本发明实施例2提供的对照组和经过假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02处理的玉米叶片的氮浓度统计结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至7.0。
实施例1
本实施例针对假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02的促生能力进行验证，具体流程如下：
1、假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02固氮能力的鉴定：
将处于对数生长期的待测菌株接入LB液体培养基，30℃震荡培养过夜。测定菌株的OD600值后，离心收集菌体，利用生理盐水洗3次后悬浮于限氮培养基中，调OD600＝0.2。每个厌氧管接入1mL菌液，使厌氧管成密封状态，排除空气并注入高纯氩气加入2.5mL新制乙炔，30℃振荡培养72h。每个厌氧管中用微量进样器取100μL气体，注入气相色谱仪测定乙烯含量。
酶活计算公式如下：
固氮酶活＝记录仪上乙烯峰面积×(试管气体体积/进样量)/(1nmol标准乙烯峰面积×反应时间)
由菌株固氮酶活测定结果可知，假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02具有较强固氮能力，达到1.28μmol/(h·ml)。
2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02解磷能力的鉴定：
将单菌落接种于蒙金娜无机磷培养基后28℃、转速180rmp摇床培养两天。将菌液在10000rpm转速下离心10min，取5mL菌液上清液，用滤孔0.22μm滤膜过滤后稀释。取5mL稀释液加入到50mL容量瓶中，再加入5mL的钼锑抗比色液，加去离子水至刻度线。静置30min后，测880nm处波长吸光度OD880。绘制磷浓度标准曲线，以根据磷标准曲线及菌液OD880值计算菌液溶出的磷含量。
由菌株解磷能力测定结果可知，假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02具有较强解磷能力，达到4.79μg/mL。
3、假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02产生长素能力的鉴定：
将色氨酸单独灭菌后加入到LB液体培养基，使最终浓度100mg/L。分别接种单菌落后摇床培养1天，条件为28℃，摇速180rpm。将1mL菌液在10000rpm的转速下离心10min，取100μL上清液滴于白色点滴板上，以空白培养基、50mg/L的IAA溶液分别作为阴性、阳性对照，加入等量的Salkowski显色液，室温避光放置30min。取1mL上清液与等体积Salkowski显色液混匀，将显色液置于40℃的水浴中避光反应30min，比色法测530nm波长处吸光度，同时测定菌悬液OD600值。结合IAA浓度标准曲线，计算菌液浓度OD600＝1时，单位体积菌液产生的IAA量。
由菌株产生长素能力测定结果可知，假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02具有较强分泌生长素能力，达到3.33μg/mL。
结果如表1所示：
表1假单胞菌1502IPR-02的促生能力
实施例2
本实施例验证假单胞菌(Pseudomonas sp.)1603IPR-03对植物SPAD值及氮营养的影响，具体步骤如下：
1、本发明将菌株1502IPR-02置于LB液体培养基中30℃培养至109CFU/ml，于高速离心机中5000rpm离心10min，倒掉上清液，加入等量灭菌的灭菌水配置成菌悬液，备用。
2、移栽花生与玉米，花生品种采用鲁花14，玉米品种采用郑单958。于间苗后第一周开始每周按照50ml/株加入菌液，加菌处理中菌液浓度：1×109CFU/ml，对照组中加入等量等浓度的灭菌盐水溶液。两组处理每个处理4盆，每盆花生6个生物学重复，每盆玉米3个生物学重复。于花生及玉米移栽后三个月收样。收样前一周用SPAD仪测定花生SPAD值以表征其光合能力，收样后烘干植株样品采用凯氏定氮法测定植物氮浓度。
结果如图1-图7所示，其中图1-图4说明了施用假单胞菌(Pseu domonas sp.)1502IPR-02后显著改善了花生的缺氮黄化现象，并促进花生生长发育。主要表现为，花生叶片SPAD值提高了7.6％，花生株高上升了20.0％，花生干重增加了28.7％，均达到显著水平。
图5-图7数据表明，假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02施用后缓解了玉米的缺氮失绿症状。主要表现为，玉米叶片SPAD值提高了13.0％，玉米叶片氮浓度上升了17.2％，均达到显著水平。
从以上结果中可得出结论，将假单胞菌(Pseudomonas sp.)1502IPR-02施用于植物根际，能够有效促进植物对氮营养的吸收利用，提高植物光合能力，促进植物生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.24754。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02或其发酵产物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述假单胞菌（Pseudomonassp.）1502IPR-02的有效活菌数不少于1×109 CFU/mL。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为植物生长促进剂、植物光合改善剂或植物氮营养改善剂。
5.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包括如权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂。
6.权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在促进空气中的氮转化为能够被植物有效吸收的氮营养中的应用；所述植物为玉米或花生。
7.权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在促进植物对土壤中氮吸收的应用；所述植物为玉米或花生。
8.权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在提高植物光合作用中的应用；所述植物为玉米或花生。
9.权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1502IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在促进植物生长发育中的应用；所述植物为玉米或花生。
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