CN116102382B - 一种真菌包封肥料、制备方法及应用 - Google Patents

一种真菌包封肥料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物肥料技术领域,具体公开了一种真菌包封肥料、制备方法及应用,所述肥料包括基质颗粒及接种有功能菌株的包封膜,所述功能菌株为裂褶菌和土曲霉的组合;所述真菌包封肥料依次通过菌丝悬液制备、基质颗粒挤压造粒,基质颗粒喷涂真菌悬液与海藻酸钠的混合溶液、氯化钙溶液浸泡成型、培养等过程制得。本发明所述真菌包封肥料选用裂褶菌和土曲霉菌两种真菌作为功能菌株可互补增效:在微好氧条件下降解冷浸田难降解的木质纤维素,提高难降解有机质的利用率,降解物和代谢产物可作为其他微生物生长的营养来源,且能够分泌抑菌物质、减少土传病害,提高速效磷、速效钾的含量,提高土壤肥力,促进水稻生长,应用前景广阔。

Description

一种真菌包封肥料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域,具体涉及一种真菌包封肥料、制备方法及应用。
背景技术
冷浸田是长期处于低温、水饱和状态下的具有冷、烂、瘦、酸和毒等特点的低产农田,国内面积约346万公顷,占全部地低产水稻面积的44.2%。冷浸田本身有机质较丰富,但矿化有机质的土著微生物活性弱,导致半分解的腐朽物质占腐殖质总量的50%以上,多为难降解的木质纤维素等成分,真正具有农业生产意义的有机质占比仅为3~6%,低效有机质进一步影响与土壤肥力相关的微生物活性;另外,冷浸田由于低温、肥力差等导致苗期抗病能力减弱,容易受到病原菌侵害。因此,对其进行改良对于水稻等粮食增收具有重大意义。
目前对冷浸田进行改良的措施主要包括:施加外援有机质如腐殖酸增加有效有机质的含量;添加土壤调理剂如碳酸钙等来杀灭病原菌和调节pH,施用化学农药杀灭土传病原菌;施用缓释肥和控释肥来增加速效磷和速效钾。
上述现有技术至少存在以下不足:
(1)添加外源腐殖酸等,未能有效利用冷浸田已有的有机质;
(2)碳酸钙杀灭病原菌的同时降低了原本就活性较低的冷浸田土壤微生物多样性,杀灭病原菌没有针对性,另外与腐殖酸等不能同时施用。局部施用过高会导致有效磷、钾进一步降低;
(3)长期施用化学农药杀灭土传病原菌,易产生抗性,还会导致农药残留造成环境污染;
(4)冷浸田长期低温、浸水缓释肥和控释肥较难发挥作用,另外包衣剂存在二次污染的问题;
(5)上述技术措施各行其是缺少一个多功能的解决措施。
介于此,发明人从微生物的方法入手,开发一种多功能的真菌包封肥料来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于,提供一种真菌包封肥料、制备方法及应用。
为了实现上述技术效果,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面在于,提供一种真菌包封肥料,包括基质颗粒和接种有功能菌株的包封膜,所述功能菌株包括裂褶菌和土曲霉,所述裂褶菌和土曲霉的活菌数比为1:4~4:1,进一步优选为3:2~2:3。
优选地,所述基质颗粒包括生物碳5~10份、钾长石粉30~70份、磷矿粉30~70份、土豆粉0.5~2份、稻草粉5~10份、豆粕粉0.2~0.5份和羧甲基纤维素5~10份。
所述基质颗粒中生物炭可提高包封膜内的传质效果,添加量过高会影响基质颗粒的pH,影响菌丝的生长;
钾长石和磷矿粉被土曲霉风化后为水稻提供速效钾和速效磷,其添加量可根据土壤的匮乏程度进行调整;
土豆粉是真菌最适宜的培养基成分,为真菌提供必需的生长因子;稻草粉可为真菌生长提供碳源,并且可促进木质素、纤维素相关酶的分泌;豆粕粉可为微生物生长提供廉价的有机氮源等;土豆粉、稻草粉和豆粕粉的添加量决定了菌丝的营养维持时间;
羧甲基纤维素在挤压造粒过程中起到粘合剂的作用,同时又可为微生物生长提供碳源。
优选地,所述包封膜为海藻酸钠与功能菌株混合后加入到氯化钙溶液中反应制得。优选地,为了增加包封膜的硬度,包封膜中还添加有碳酸钙。
本发明的第二方面在于,提供所述真菌包封肥料的制备方法,包括如下步骤:
(1)分别取保藏的裂褶菌和土曲霉菌丝块进行活化、深层发酵培养得裂褶菌发酵液和土曲霉发酵液;
(2)将步骤(1)制得的裂褶菌发酵液和土曲霉发酵液分别进行匀浆处理得到裂褶菌菌丝体悬液和土曲霉菌丝体悬液;
(3)按照比例将裂褶菌和土曲霉的菌丝体悬液混合,并进行稀释;
(4)将步骤(3)稀释后的菌丝体悬液与海藻酸钠、碳酸钙溶液按比例混合,制得混合溶液;
(5)基质颗粒的制备:分别按比例取生物碳、钾长石粉、磷矿粉、土豆粉、稻草粉、豆粕粉和羧甲基纤维素,加水混匀,挤压造粒制得基质颗粒;
(6)将步骤(4)制得的混合溶液均匀喷涂在步骤(5)制备的基质颗粒的表面;(7)将步骤(6)喷涂完的基质颗粒放入氯化钙溶液中,待形成海藻酸钙凝胶后取出,然后放入培养箱中培养,待颗粒变白即得本申请所述的真菌包封肥料,放入4℃冰箱备用。
优选地,步骤(1)中菌株活化具体为:从-80℃保藏的甘油管中取1个菌丝块于PDA平板培养基,25-30℃培养3-7天;
液体深层发酵具体为:用打孔器从平板上取3-15mm的菌块若干,接种于含PDB培养基的三角瓶或发酵罐中,三角瓶装液量为50%以下,三角瓶中放置3-5个5mm的玻璃珠,于25~30℃、150~220r/min摇床培养3~7d。
优选地,步骤(2)中匀浆处理具体是将裂褶菌和土曲霉分别置于匀浆机中10000~15000r/min处理5~30s。
优选地,步骤(3)中稀释后裂褶菌和土曲霉菌丝体悬液的浓度为104~106cfu/mL,浓度过低,会导致菌球上的菌丝生物量不足,不能发挥作用;如果浓度太高则基质营养消耗过快,固定化菌剂的使用寿命缩短。
优选地,步骤(4)中所述混合溶液中海藻酸钠与碳酸钙的终浓度分别为1.8~2.2%和0.6~0.9%,裂褶菌和土曲霉的终浓度为104~106cfu/mL。
优选地,步骤(5)中所述基质颗粒为圆柱形或球形,粒度为直径5~15mm×长5~15mm。
优选地,步骤(6)中混合溶液的用量与基质颗粒表面的吸附量有关,用量过多则无法固定在基质颗粒上,用量约为50~150uL/小球。
优选地,步骤(7)中氯化钙的浓度为5.0~5.5%,氯化钙浓度过高容易导致凝胶过硬,影响传质效果,该浓度下可达到磷和钾离子缓释的效果。
优选地,步骤(7)中培养箱的培养温度为25~30℃,培养1~2天。
本发明的第三方面在于,提供所述真菌包封肥料在改良冷浸田土壤中的应用。与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明所述真菌包封肥料选用裂褶菌和土曲霉菌两种真菌作为功能菌株,在降解木质素、纤维素时可互补增效,可在微好氧条件下降解冷浸田难降解的木质素、纤维素,降解物和代谢产物如小分子酸类和酯类以及残体等可作为其他微生物生长的营养来源,从而提高难降解有机质的利用率;
本发明所述真菌包封肥料中土曲霉不仅可以分泌抑菌物质、减少土传病害微生物,还可分泌有机酸提高速效磷、速效钾的含量,与裂褶菌混合使用后提高了木质纤维素的降解效率,为土曲霉增加中间营养物质,间接的提高了土曲霉在冷浸田环境的适应性,可使土曲霉更好的发挥作用;
本发明所述真菌包封肥料基质颗粒中各成分不仅可为真菌定植提供营养,而且其中的生物炭提高了包封膜内的传质效果,磷矿粉和钾长石被土曲霉风化后可为水稻生长提供速效磷和速效钾,从而提高了土壤肥力;
采用本发明所述方法制备的真菌包封肥料提高了菌株在冷浸田低温、厌氧或微好氧、低温条件下的定植能力,使其能够充分发挥作用,从而更好的起到了改良土壤的目的。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,本发明用以下具体实施例进行说明,但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例,仅仅用于描述本发明,不能理解为对本发明的限制,应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进,均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明所述裂褶菌与土曲霉均为现有菌株,可以购买获得,也可自行分离,对其具体菌株编号不做限制,属于同一种即可。
以下实施例中使用的裂褶菌为购自上海保藏生物技术中心的裂褶菌SHBCCD11505,土曲霉为北纳生物采购的土曲霉BNCC335941;
以下实施例基质颗粒中使用的磷矿粉含P2O5 10-35%,钾长石粉含K2O 10-15%。
实施例1真菌包封肥料的制备
1、液体深层发酵法制备裂褶菌和土曲霉菌丝球:
1)菌株活化:分别从-80℃保藏的甘油管中取裂褶菌和土曲霉的1个菌丝块于PDA平板培养基种,于28℃培养7天;
2)液体深层发酵:用打孔器分别从上述两个活化平板上取3-15mm的菌块若干,分别接种于含PDB培养基的500mL三角瓶中,装液量为50%;三角瓶中放置5个5mm的玻璃珠,30℃、160r/min摇床培养7d。
2、菌丝体悬液的制备:
1)将裂褶菌和土曲霉菌的发酵液分别于匀浆机中,于10000r/min处理20s,制成菌丝体悬液,转速过高、时间过长易导致菌体破碎,影响生物量;
2)取上述菌丝体悬液用平板涂布法测定其活菌数,培养2~3d后计数;
3)根据活菌数,将裂褶菌和土曲霉的菌丝悬液按比例进行混合并稀释。
3、菌丝体悬液与海藻酸钠混合溶液的制备:将稀释好的菌丝体悬液与适当浓度的海藻酸钠、碳酸钙溶液按比例混合,控制海藻酸钠和碳酸钙的终浓度分别为2.0%和0.8%,混合溶液中的活菌浓度为105cfu/mL。
4、基质颗粒的制备:
取生物碳8份、钾长石粉35份、磷矿粉35份、土豆粉1份、稻草粉10份、豆粕粉0.2份和羧甲基纤维素5份,各物料的粒度为60~100目,加水混匀,挤压造粒,制备成高15mm×直径5mm的圆柱状基质颗粒。
5、将步骤3制备好的混合溶液均匀喷涂在基质颗粒表面,所述喷涂量与基质颗粒表面的吸附量有关,喷涂量过大无法固定在基质颗粒上,造成浪费;本实施例中混合溶液的用量约为80uL/小球。
6、形成包埋凝胶:将喷涂好的基质颗粒放入氯化钙溶液中,待形成海藻酸钙凝胶后取出备用。
7、将步骤6制备好的海藻酸钙凝胶放入28℃的培养箱中培养1~2d,使菌丝伸出包封膜外,待颗粒变白,放入4℃冰箱备用。
实施例2制备过程的优化和评价方法
1、功能菌株的筛选和菌种比例的确定试验:
冷浸田土壤样品采集自福建省白沙镇,4℃保藏小于7d,以不同真菌组合、比例为单因素,以相同活菌浓度106cfu/mL接入含10%灭菌土壤溶液的100mL三角瓶中,在摇床22℃、50r/min培养10d后测定木质素和纤维素的降解率;
参考文献《稻草秸秆中木质素、纤维素测定方法的研讨》中公开的方法测定木质素及纤维素含量。
具体结果如表1所示;
表1不同真菌、不同比例对木质素和纤维素的降解率
由表1结果可知,裂褶菌和土曲霉组合在1:4~4:1时,对纤维素的降解率达到18.5%以上,对木质素的降解率达到17.3%以上,均高于各菌株单独使用,说明裂褶菌与土曲霉组合在降解纤维素和木质素方面具有增效作用;当裂褶菌和土曲霉的活菌数比为3:2时,降解效果最好,对纤维素的降解率达28.1%,对木质素的降解率达26.6%,均高于土曲霉与其他菌种混合使用。
2、按照上述方法以不同活菌浓度为单因素,以相同比例(裂褶菌:土曲霉=3:2)接入含10%灭菌土壤溶液的100mL三角瓶中,在摇床22℃、50r/min培养10d后测定木质素和纤维素的降解率,具体结果如表2所示;
表2不同活菌浓度对纤维素及木质素的降解率
3、基质颗粒中土豆粉和生物炭的优化试验
取各成分制备基质颗粒,并按照裂褶菌:土曲霉=3:2进行接种,考察土豆粉和生物炭添加量不同对菌丝生长的影响,其他成分含量按实例1中添加,结果如表3所示。
表3基质颗粒中土豆粉和生物炭用量对菌丝生长的影响
处理 土豆粉/份 生物碳/份 菌丝长满菌球的时间/h
CK0 0 0 48
1 0 5 30
2 0.5 5 26
3 1 5 23
4 1 0 35
5 1 10 20
6 1 15 32
由表3可知,添加土豆粉和生物炭能促进菌丝的生长,添加生物炭10份、土豆粉1份时菌丝生长最快,效果最佳。
4、真菌包封肥料机械强度的优化
通过改变碳酸钙的浓度调节包封膜的硬度,制备包封肥料,将不同的包封肥料放入1000mL锥形瓶中,并加入300mL去离子水,300r/min振荡24h,计算小球的强度系数(小球的强度系数%=完好的小球/原小球总数×100%),如表4所示;
表4不同碳酸钙浓度对小球强度的影响
处理 碳酸钙% 强度系数%
1 0 80
2 0.3 85
3 0.6 90
4 0.9 91
5 1.2 91
由表4可知,碳酸钙浓度为0.6~0.9%时,包封小球的硬度可达90%以上。
实施例3盆栽试验
用冷浸田土壤接种病原菌(立枯丝核菌)后,混合均匀并分别装于直径15cm、高15cm的塑料桶中,每桶1kg,然后添加去离子水,使土壤保持淹水泡田状态;采集长势相同10d苗龄的水稻秧苗,移栽于上述塑料桶中,每桶9株,每个处理重复3次,随机排列;
整个水稻生育期塑料桶土面上保持2~3cm左右水层,气候室温度为22℃,湿度70%,光照强度约为7000lux,光照设置16/8h;每盆加入实例1制备的微生物肥料颗粒5个约6g。
盆栽培养30天后进行检测,分别测定可培养细菌数、可培养真菌数、立枯丝核菌的相对丰度、速效磷/速效钾含量和水稻株高。
其中,用平板稀释法,PCA平板测定根际土可培养细菌,PDA含链霉素30ug/mL测定可培养真菌;
用ITS扩增子测序法测定病原菌的相对丰度,取根际土后干冰保护下送至测序公司检测真菌组成,相对丰度=病原菌ITS序列数/真菌总序列数×100%;
用碳酸氢钠法和火焰光度计法分别测定速效磷和速效钾含量。
测定结果如表5所示;
表5
上表中T1~T3为本申请制备的真菌包封肥料;CK0为空白对照,未做任何处理;CK1处理只加入功能菌株,不做包封处理,活菌数目和包封肥料制备时相同;CK2制备包封肥料时未接种功能菌,只有包封基质颗粒;CK3为只加入裂褶菌的包封肥料;CK4为只加入土曲霉的包封肥料。
由表5中数据可知,处理组T1~T3均可显著提高可培养微生物的活性,提高有机质利用率,且显著提高了速效磷和速效钾的含量,有效抑制了病原菌立枯丝核菌的活性,促进了水稻的生长;且与CK3、CK4对比发现,本申请将裂褶菌与土曲霉组合使用后在提高有机质利用率、溶磷解钾、抑制病原菌生长、促进水稻生长等方面均有显著增效作用。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请技术方案构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种真菌包封肥料,其特征在于,包括基质颗粒及接种有功能菌株的包封膜,所述功能菌株包括裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941,所述裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941的活菌数比为1:4~4:1。
2.根据权利要求1所述的真菌包封肥料,其特征在于,所述基质颗粒包括生物碳5~10份、钾长石粉30~70份、磷矿粉30~70份、土豆粉0.5~2份、稻草粉5~10份、豆粕粉0.2~0.5份和羧甲基纤维素5~10份。
3.根据权利要求1所述的真菌包封肥料,其特征在于,所述包封膜为海藻酸钠与功能菌株混合后加入氯化钙溶液中反应制得。
4.权利要求3所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)分别取保藏的裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941菌丝块进行活化、深层发酵培养得裂褶菌SHBCCD11505发酵液和土曲霉BNCC335941发酵液;
(2)将步骤(1)制得的裂褶菌SHBCCD11505发酵液和土曲霉BNCC335941发酵液进行匀浆处理分别得到裂褶菌SHBCCD11505菌丝体悬液和土曲霉BNCC335941菌丝体悬液;
(3)按照比例将裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941的菌丝体悬液混合,并进行稀释;
(4)将步骤(3)稀释后的菌丝体悬液与海藻酸钠、碳酸钙溶液按比例混合,制得混合溶液;
(5)基质颗粒的制备:分别按比例取生物碳、钾长石粉、磷矿粉、土豆粉、稻草粉、豆粕粉和羧甲基纤维素,加水混匀,挤压造粒制得基质颗粒;
(6)利用步骤(4)制得的混合溶液均匀喷涂在步骤(5)制备的基质颗粒的表面;
(7)将步骤(6)喷涂完的基质颗粒放入氯化钙溶液中,待形成海藻酸钙凝胶后取出放入培养箱中培养,待颗粒变白即得所述真菌包封肥料,放入4℃冰箱备用。
5.根据权利要求4所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,步骤(3)中稀释后裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941菌丝体悬液的浓度为104~106cfu/mL。
6.根据权利要求4所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述混合溶液中海藻酸钠与碳酸钙的终浓度分别为1.8~2.2%和0.6~0.9%,裂褶菌SHBCCD11505和土曲霉BNCC335941的浓度为104~106cfu/mL。
7.根据权利要求4所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,步骤(5)中所述基质颗粒为圆柱形或球形,粒度为长5~15mm×直径5~15mm。
8.根据权利要求4所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,步骤(6)中混合溶液的用量为50~150uL/小球。
9.根据权利要求4所述真菌包封肥料的制备方法,其特征在于,步骤(7)中氯化钙的浓度为5.0-5.5%;培养箱的培养温度为25~30℃,培养1~2天。
10.权利要求1所述真菌包封肥料在改良冷浸田土壤中的应用。
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