CN113621532B - 含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂按照质量份数计，由副地衣芽孢杆菌MIB‑17菌株培养物50份，巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株培养物15份，枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份，腐植酸10份，以及复合微量元素10份组成。本发明以具有较强的耐盐碱能力和促进作物生长能力的副地衣芽孢杆菌MIB‑17菌株为主要功能性菌株，并优选巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株与枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株进行配伍，与腐植酸和微量元素一起组方制备复合微生物菌剂，具有比单一菌剂更好的应用效果。

Description

含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
目前，土壤盐碱化是全球最严重的环境问题之一，全球超过20％的耕地和33％的灌溉土地存在盐碱化问题，且以每年200万公顷的速度增加。中国盐碱地分布广泛，东北、西北及华北的内陆地区及沿海平原都分布着不同类型的盐碱地，总面积约3.6×107hm2，占据全国土地可利用面积的4.9％。盐碱地是重要的耕地后备资源，要扩大农业生产，合理开发利用盐碱地非常重要。微生物肥料是盐碱地开发利用十分重要的绿色投入品之一。但普通微生物肥料在盐碱土壤中的应用效果不理想，主要原因是盐碱环境不利于微生物的定植与生长。因此，从盐碱地生境中选育盐碱耐受能力强、在盐碱土壤中定植率高的抗病促生菌，开发适用于盐碱地的微生物肥料具有重要意义。
采用副地衣芽孢杆菌研制微生物肥料已有报道。阮志勇等公开了一株副地衣芽孢杆菌，可以拮抗植物根腐病，促进苗木生长，具有抗逆性、固氮、降解无机磷、有机磷，产植物生长激素、改善植株的品质、提高土壤肥力的能力。柴阿丽等公开了一株副地衣芽孢杆菌，能够预防和/或治疗植物根肿病。张瑞福等公开了一株副地衣芽孢杆菌，可增强作物耐盐能力，在盐分胁迫下能提高玉米、小麦的生长指标。沙月霞等公开了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂，副地衣芽孢杆菌是其有效菌株之一。刘永刚等人从盐渍土中分离出一株副地衣芽孢杆菌，能够显著抑制甘蓝枯萎病病原菌等多种病原菌的生长。虽然可以检索到上述文献报道，但目前含副地衣芽孢杆菌的产品在市场上罕有销售，其主要原因可能是实际应用效果并不理想，因此，这类产品的开发应用还需要进一步加强。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)由于盐碱环境不利于微生物的定植与生长，普通微生物肥料在盐碱土壤中的应用时，对番茄等作物生长的促进作用及对水稻纹枯病等作物病害的防治效果不理想。
(2)目前含副地衣芽孢杆菌的产品在实际应用时，对番茄等作物生长的促进作用及对水稻纹枯病等作物病害的防治效果并不理想，因此在市场上罕有销售。
解决以上问题及缺陷的难度为：(1)分离筛选出耐盐碱能力强、对作物的促生与抗病效果好的功能性菌株；(2)建立耐盐碱菌株的发酵工艺，实现经济、清洁生产；(3)与其他有益菌及化学成分进行合理配伍，研制出可进行规模化生产、抗病促生效果较好的生物肥料产品。
解决以上问题及缺陷的意义为：为盐碱地的开发利用提供绿色投入品，促进盐碱地作物生长，减少病害发生，增加产量，提高品质，增加农民收入。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂按照质量份数计，由副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株培养物50份，巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株培养物15份，枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份，腐植酸10份，以及复合微量元素10份组成。
进一步，所述副地衣芽孢杆菌MIB-17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22607；所述巨大芽孢杆菌ACCC 04314和枯草芽孢杆菌ACCC 19743的原种均购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
进一步，所述复合微量元素按照质量份数计，由硫酸锌ZnSO4 40份，硫酸镁MgSO440份和硫酸亚铁FeSO4·7H2O 20份组成。
进一步，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的活菌含量优选为：副地衣芽孢杆菌MIB-17活菌数≥1×109CFU/g；巨大芽孢杆菌ACCC 04314活菌数≥2×108CFU/g；枯草芽孢杆菌ACCC 19743活菌数≥2×108CFU/g。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，副地衣芽孢杆菌MIB-17菌种活化与扩大培养；
步骤二，副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株固态发酵；
步骤三，巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌粉的制备；
步骤四，枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌粉的制备；
步骤五，复合微生物菌剂的配制。
进一步，步骤一中，所述副地衣芽孢杆菌MIB-17菌种的活化与扩大培养，包括：
将副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化；刮取菌苔，接种于LB液体培养基中，37℃培养24h；将三角瓶种子以3％-4％的接种量转接入含LB液体培养基的种子罐中，37℃培养20-24h；种子罐体积为10L，装液量为8L，搅拌转速220r/min，通风量为8L/min；所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.0。
进一步，步骤二中，所述副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株固态发酵，包括：
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养；
麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度3-5cm；所述麸皮培养基的配方为：麸皮90％，稻壳8.3％，CaCO3 1.5％，MnSO4 0.2％，初始含水量50-55％；将副地衣芽孢杆菌MIB-17种子液以5-10％的接种量转接入培养基，发酵培养40-50h；发酵过程中控制品温32-39℃，含水量50-55％，每3-4h翻动一次，以调节温度与供氧；发酵结束后，培养物于40-45℃烘干，粉碎至80-100目，即为副地衣芽孢杆菌MIB-17菌粉，活菌含量优选为(0.5～1.0)×1010cfu/g，用于微生物菌剂的配制。
进一步，步骤三中，所述巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌粉的制备，包括：
菌种活化、三角瓶种子制备、发酵罐种子制备与固态发酵等各生产环节的方法同副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株；但固态发酵培养基的配方优选为：麸皮99％，Ca(OH)2 1％，MnSO4 0.1％，初始含水量50-60％；发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于复合微生物肥料的配制。
进一步，步骤四中，所述枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌粉的制备，包括：
菌种活化、三角瓶种子制备、发酵罐种子制备与固态发酵培养方法等与上述副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株的生产方法相同；但固态发酵培养基的配方优选为：麸皮98.5％，Ca(OH)2 1.5％，初始含水量50-60％；发酵结束后，培养物于40-45℃烘干，粉碎至80-100目，即为枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于复合微生物肥料的配制。
进一步，步骤五中，所述复合微生物菌剂的配制，包括：
取副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株培养物50份、巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株培养物15份、枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份、腐植酸10份以及复合微量元素10份，混合均匀，即为微生物肥料产品；其中，所述矿源腐植酸粉的总腐植酸含量≥50％(w/w)。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂，从盐碱土壤中筛选出一株副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17，该菌株具有较强的耐盐碱和促生能力，同时对水稻纹枯病具有较强的拮抗作用。本发明以副地衣芽孢杆菌MIB-17作为主要功能性菌株，同时优选巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC 19743等两种促生菌与其配伍，研制复合微生物菌剂，获得了较好的应用效果。
本发明提供的复合微生物菌剂中包含3种功能菌：副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)MIB-17，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 19743；所述副地衣芽孢杆菌MIB-17保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22607，具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，特别是适用于盐碱土壤的微生物肥料。所述巨大芽孢杆菌ACCC 04314与枯草芽孢杆菌ACCC19743购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
本发明提供的复合微生物菌剂所采用的副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株分离自盐碱地土壤，具有较强的耐盐碱能力和促进作物生长的能力，并对水稻纹枯病具有较强的拮抗作用。同时，本发明以副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株为主要功能性菌株，并优选巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株与枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株进行配伍，与腐植酸和微量元素一起组方制备复合微生物菌剂，具有比单一菌剂更好的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株的菌落形态示意图。
图3是本发明实施例提供的副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株的菌体形态示意图，其中图3(b)为图3(a)的局部放大图。
图4是本发明实施例提供的副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株MIB-17基于16SrDNA部分序列构建的系统发育树示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂按照质量份数计，由副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株培养物50份，巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株培养物15份，枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份，腐植酸10份，以及复合微量元素10份组成。
副地衣芽孢杆菌MIB-17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；本保藏中心于2021年5月25日收到，并检测，检测结果是存活；根据请求从2021年5月25日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料的请求后再延续保存五年；本保藏中心登记入册编号CGMCC No.22607，参考的生物材料：MB-17，建议份分类命名：副地衣芽孢杆菌Bacilus paralicheniformis。
如图1所示，本发明实施例提供的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
S101，副地衣芽孢杆菌MIB-17菌种活化与扩大培养；
S102，副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株固态发酵；
S103，巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌粉的制备；
S104，枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌粉的制备；
S105，复合微生物菌剂的配制。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法，所述复合微生物菌剂中包含3种功能菌：副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 19743。所述副地衣芽孢杆菌MIB-17保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22607，具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，特别是适用于盐碱土壤的微生物肥料。所述巨大芽孢杆菌ACCC 04314与枯草芽孢杆菌ACCC 19743购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
本发明实施例提供的副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株的16S rDNA基因部分序列如SEQID NO：1所示。
本发明实施例提供的副地衣芽孢杆菌MIB-17活菌数≥1×109CFU/g，巨大芽孢杆菌ACCC 04314活菌数≥2×108CFU/g，枯草芽孢杆菌ACCC 19743活菌数≥2×108CFU/g。
本发明实施例提供的复合微生物菌剂中各组分的含量为：副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株培养物50份(以重量计)；巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌株培养物15份(以重量计)；枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份(以重量计)；腐植酸10份(以重量计)；复合微量元素10份(以重量计)。
本发明实施例提供的复合微量元素的组成为：硫酸锌(ZnSO4)40份(以重量计)，硫酸镁(MgSO4)40份(以重量计)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20份(以重量计)。
实施例2：副地衣芽孢杆菌MIB-17的筛选
(1)耐盐碱菌株的分离
称取盐碱土壤10g，放入含90mL无菌水和10-20粒玻璃珠的锥形瓶中，于180r/min震荡30min。采用梯度稀释法依次稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7。移取不同浓度的稀释液各0.1mL均匀涂布于LB平板中，37℃培养48-72h。挑取不同菌落并划线于LB平板平板，37℃培养48-72h，获得单菌落。所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH 7.5。
将分离所得的单菌落依次接种于LB盐碱培养基平板中，37℃培养48-72h，观察并记录菌株生长状况，选取生长相对较好的菌株进行后续试验。所述LB盐碱培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠50g/L，琼脂20g/L，pH 9.0。
(2)耐盐碱促生菌株筛选
采用奶油小白菜种子发芽试验，进一步筛选促生效果较好的耐盐碱菌株。在90mm的培养皿底部铺1层滤纸，倒入5mL含不同待筛选菌株的菌悬液。所述菌悬液的制备方法为：用接种环刮取待筛选菌株的菌苔，在盐碱溶液中搅动，制成菌悬液，优选含菌量为1×107cfu/mL。所述盐碱溶液的组成为：NaCl 25mmol/L，Na2SO4 50mmol/L，NaHCO3 25mmol/L，pH 8.0。空白对照组添加5mL不含菌的盐碱溶液。试验组和对照组均设3个平行，每一平行放30粒种子，28℃光照培养3-7天。根据小白菜幼苗的生长状况筛选出促生效果相对较好的菌株。
(3)拮抗菌株的筛选
以水稻纹枯病致病菌立枯丝核菌为受试病原菌筛选拮抗菌株。在PDA培养基平板上培养立枯丝核菌，获得菌落。用打孔器取直径5mm的菌块，接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.0cm处等距离接种待筛菌株，以不接种待筛菌株的平板为对照，28℃培养10d，选取抑菌圈直径较大的菌株，保存备用。每个处理3次重复。所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
通过上述多重筛选，综合考虑各菌株耐盐碱能力、促生长能力、病原菌拮抗能力，筛选出一株相对较好的菌株，编号为MIB-17。
实施例3：MIB-17菌株的鉴定
(1)形态鉴定与生理生化鉴定
所述MIB-17菌株的形态特征为：在LB培养基上37℃培养48h，菌落直径约0.4-1.0mm，圆形，白色，稍隆起，半透明，表面湿润，有光泽，光滑，粘稠，边缘整齐(见图2)；菌体镜检呈杆状(见图3)。所述LB培养基即营养琼脂培养基：酵母浸粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。
所述MIB-17菌株的生理生化特征为：有芽孢、革兰氏染色阳性、接触酶试验阳性、甲基红反应阴性、V-P试验阴性、丙二酸盐利用试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、淀粉水解试验阳性、运动性阴性、麦芽糖利用试验阳性、甘露醇利用试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、乳糖利用试验阳性。
(2)16S rDNA序列分析
将MIB-17菌株接种到LB液体培养基中，于37℃、180r/min振荡培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因通用引物F27：5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由青岛睿博兴科有限公司测序，所得序列如序列表SEQ ID NO：1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA5.5软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图4所示。
通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为副地衣芽孢杆菌，命名为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17。
实施例4：微生物菌剂的制备
(1)副地衣芽孢杆菌MIB-17菌种活化与扩大培养
将副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。刮取菌苔，接种于LB液体培养基中，37℃培养24h。然后将三角瓶种子以3％-4％的接种量转接入含LB液体培养基的种子罐中，37℃培养20-24h。种子罐体积为10L，装液量为8L搅拌转速220r/min，通风量为8L/min。所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.0。
(2)副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株固态发酵
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养。麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度3-5cm。将副地衣芽孢杆菌MIB-17种子液以5-10％的接种量转接入培养基，发酵培养40-50h。发酵过程中控制品温32-39℃，含水量50-55％，每3-4h翻动一次，以调节温度与供氧。所述麸皮培养基的配方为：麸皮90％，稻壳8.3％，CaCO31.5％，MnSO4 0.2％，初始含水量50-55％。发酵结束后，培养物于40-45℃烘干，粉碎至80-100目，即为副地衣芽孢杆菌MIB-17菌粉，其活菌含量优选为(0.5～1.0)×1010cfu/g，用于微生物菌剂的配制。
(3)巨大芽孢杆菌ACCC 04314菌粉的制备
菌种活化、三角瓶种子制备、发酵罐种子制备与固态发酵等各生产环节的方法同副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株。但固态发酵培养基的配方优选为：麸皮99％，Ca(OH)2 1％，MnSO4 0.1％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于复合微生物肥料的配制。
(4)枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌肥的制备
菌种活化、三角瓶种子制备、发酵罐种子制备与固态发酵培养方法等与上述副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株的生产方法相同。但固态发酵培养基的配方优选为：麸皮98.5％，Ca(OH)2 1.5％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃烘干，粉碎至80-100目，即为枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于复合微生物肥料的配制。
(5)复合微生物菌剂的配制
所述复合微生物菌剂的配方为：副地衣芽孢杆菌MIB-17菌株培养物50份(以重量计)；巨大芽孢杆菌ACCC04314菌株培养物15份(以重量计)；枯草芽孢杆菌ACCC 19743菌株培养物15份(以重量计)；腐植酸10份(以重量计)；复合微量元素10份(以重量计)。所述复合微量元素的组成为：硫酸锌(ZnSO4)40份(以重量计)，硫酸镁(MgSO4)40份(以重量计)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20份(以重量计)。
所述微生物肥料的配制方法：取组方量的各种原料，混合均匀，即为微生物肥料产品，其活菌含量优选为：副地衣芽孢杆菌MIB-17活菌数≥1×109CFU/g；巨大芽孢杆菌ACCC04314活菌数≥2×108CFU/g；枯草芽孢杆菌ACCC 19743活菌数≥2×108CFU/g。所述矿源腐植酸粉购自山东创新腐植酸科技股份有限公司，总腐植酸含量≥50％(w/w)。
下面结合应用例对本发明的技术方案作进一步描述。
应用例1：复合微生物菌剂对番茄的促生作用
为验证复合微生物菌剂的促生效果，以番茄为受试作物进行了盆栽试验。试验在上口内径20cm、下口内径14cm、高16cm的陶盆中进行，每盆装盐碱土3kg。所述盐碱土取自东营市垦利区水稻田。试验设1个对照组(CK)和1个处理组(T)，各设置25盆，每盆种植1棵番茄。处理组T每盆施用复合微生物菌剂3g，对照组CK每盆施用预灭菌的复合微生物肥料3g，均在装盆时与土壤混合均匀。预灭菌方法为121℃高压蒸汽灭菌20-30min。番茄幼苗移栽后第60天，分别采用卷尺和游标卡尺测量株高和茎粗，采用称重法测定鲜重和干重，采用苯酚钠比色法测定脲酶，采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶，采用磷酸苯二钠比色法测定磷酸酶，采用DNS比色法测定蔗糖酶。盆栽试验结果如表1与表2所示，与对照组CK相比，处理组T的株高、茎粗、鲜重和干重、土壤脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性均有显著提高，这说明该复合微生物菌剂对番茄具有较好的促生作用。
表1复合微生物菌剂对番茄生长的影响
表2复合微生物菌剂对番茄根际土壤酶活的影响
应用例2：复合微生物菌剂对水稻纹枯病的防治作用
为验证复合微生物菌剂对水稻纹枯病的防治效果，以水稻为受试作物进行了盆栽试验。试验在上口内径20cm、下口内径14cm、高16cm的陶盆中进行，每盆装盐碱土3kg。所述盐碱土取自东营市垦利区水稻田。试验设1个对照组(CK)和1个处理组(T)，各25盆，每盆种植2棵水稻。处理组T每盆施用复合微生物菌剂3g，对照组CK每盆施用预灭菌的复合微生物肥料3g，均在装盆时与土壤混合均匀。预灭菌的方法为121℃高压蒸汽灭菌20-30min。水稻缓苗5日后，每盆灌根30mL立枯丝核菌孢子悬浮液(1×106孢子/mL)，分别于10天、20天、30天统计病害严重度和防效。
纹枯病分级标准：0级：全株无病；1级：第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。病情指数＝∑[(各级病叶数×各级代表值)/(9×总株数)]×100。防效＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100％。
盆栽试验结果如表3所示，处理组T在第10、20和30天的防效分别为78.38％、65.38％和51.88％，这说明本发明所述复合微生物菌剂对水稻纹枯病具有较好的生防效果。
表3复合微生物菌剂对水稻纹枯病的防治作用
应用例3：对大田水稻的促生作用
大田示范应用区位于山东省东营市垦利开发区，示范面积40亩，为轻度盐碱地。实验设两个处理，每个处理20亩。对照处理CK：习惯施肥，亩施尿素30kg、氯化钾15kg、钙镁磷肥30kg。实验处理T：亩施用本发明复合微生物菌剂10kg、配施尿素30kg、氯化钾15kg、钙镁磷肥30kg。钙镁磷肥一次性作基肥施用，复合微生物菌剂50％作基肥施用，50％作为分蘖肥施用，尿素和氯化钾40％作基肥施用，60％作分蘖肥施用。试验期间病虫防治和水分管理按常规方法进行。试验品种为水稻盐丰47，2020年5月20日统一播种，11月1日收割测产。实验结果：对照处理CK平均亩产810Kg，实验处理T平均亩产898Kg，增产10.86％；对照处理CK土壤有机质含量1.41g/g土壤(干基)，实验处理T土壤有机质含量1.56g/g土壤(干基)，提升10.64％。这说明施用本发明复合微生物菌剂产品具有改良土壤和增加水稻产量的作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东营市垦利区万隆农林经贸有限公司
<120> 含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1255
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca 60
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 120
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 180
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta 240
ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 300
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg 360
cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 420
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 480
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 540
gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 600
gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac gcattaagca 660
ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 720
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 780
tcctctgaca accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 840
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 900
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 960
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1020
aatgggcaga acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca aatctgttct 1080
cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1140
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1200
agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttggag ccagccgccg aaggt 1255

Claims (7)

1.一种含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂，其特征在于，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂按照质量份数计，由副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)MIB-17菌株培养物50份，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314菌株培养物15份，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 19743菌株培养物15份，腐植酸10份，以及复合微量元素10份组成；所述副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)MIB-17保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年5月25日，保藏编号为CGMCCNo.22607。
2.如权利要求1所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微量元素按照质量份数计，由硫酸锌ZnSO4 40份，硫酸镁MgSO4 40份和硫酸亚铁FeSO4·7H2O 20份组成。
3.如权利要求1所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂，其特征在于，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的活菌含量为：副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)MIB-17活菌数≥1×109CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314活菌数≥2×108CFU/g；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 19743活菌数≥2×108CFU/g。
4.一种如权利要求1～3任意一项所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌种活化与扩大培养；
步骤二，副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌株固态发酵；
步骤三，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314菌粉的制备；
步骤四，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 19743菌粉的制备；
步骤五，复合微生物菌剂的配制。
5.如权利要求4所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌种的活化与扩大培养，包括：
将副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化；刮取菌苔，接种于LB液体培养基中，37℃培养24h；将三角瓶种子以3％-4％的接种量转接入含LB液体培养基的种子罐中，37℃培养20-24h；种子罐体积为10L，装液量为8L搅拌转速220r/min，通风量为8L/min；所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.0。
6.如权利要求4所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌株固态发酵，包括：
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养；
麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度3-5cm；所述麸皮培养基的配方为：麸皮90％，稻壳8.3％，CaCO3 1.5％，MnSO4 0.2％，初始含水量50-55％；将副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17种子液以5-10％的接种量转接入培养基，发酵培养40-50h；发酵过程中控制品温32-39℃，含水量50-55％，每3-4h翻动一次，以调节温度与供氧；发酵结束后，培养物于40-45℃烘干，粉碎至80-100目，即为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌粉，活菌含量为(0.5～1.0)×1010cfu/g，用于微生物菌剂的配制。
7.如权利要求4所述的含耐盐碱副地衣芽孢杆菌的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述复合微生物菌剂的配制，包括：
取副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)MIB-17菌株培养物50份、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC 04314菌株培养物15份、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC 19743菌株培养物15份、腐植酸10份以及复合微量元素10份，混合均匀，即为复合微生物菌剂；其中，所述矿源腐植酸粉的总腐植酸含量≥50％(w/w)。
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