CN117645959A - 一种生物有机水溶肥及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物有机水溶肥及其制备方法与应用。本发明首先从卡那霉素发酵废渣中分离到一株堆肥芽孢杆菌(Bacillus stercoris)PAPM‑Y1‑2，保藏编号为：CGMCCNo.27681，该菌株具有产IAA、解蛋白、降解卡那霉素和拮抗番茄软腐病致病菌等有益特性。以该菌株发酵与酶解卡那霉素发酵废渣，并复配低值鱼酶解物，制备生物有机水溶肥料，具有促进作物生长、改良土壤和防治番茄软腐病等作用。本发明采用卡那霉素发酵废渣和低值鱼酶解物为主要原料制备生物有机水溶肥，不仅有利于降低生产成本，拓宽了原料来源，还有利于卡那霉素发酵废渣的无害化和资源化利用。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种生物有机水溶肥及其制备方法与应用。
背景技术
随着生物技术及水肥一体化技术的快速发展，生物肥料的应用越来越广泛，对可随水滴灌或冲施、集微生物和可溶性有机质于一体，具有改良土壤、促生抗病等多种功能的新型生物肥料的需求越来越大，开发适用于“水肥一体化”的生物有机水溶肥也成为一个研究热点。
目前，生物有机水溶肥主要采用水溶性有机原料进行生产，黄腐酸、氨基酸、腐殖酸、糖蜜、木醋液等可溶性有机物是最常用的生产原料，但受原料来源和价格限制，难以大规模推广应用。采用发酵法和酶解法，将不溶性有机原料转化为水溶性物质，再用于生产生物有机水溶肥，是具发展潜力的生产方法，但目前研究较少，仅有制革下脚料、低值鱼下脚料等原料用于制备水溶性有机肥的报道。
卡那霉素发酵废渣是抗生素发酵工业产生的发酵废渣，富含蛋白质、氨基酸、碳水化合物、中微量元素以及残余的菌丝体等物质，资源丰富，价格便宜，是采用发酵法和酶法生产水溶性生物有机肥的良好原料。但卡那霉素发酵废渣含有残留的卡那霉素，这为其综合利用带来了很多困难。采用酶法进行水解时，因卡那霉素无法被降解，会残留在酶解物中，存在风险因素。采用发酵法进行水解时，因卡那霉素对发酵微生物具有抑制作用，会导致发酵困难，且卡那霉素如果不能被微生物降解，也会残留到产品中去，因此必须选用能降解卡那霉素的微生物进行发酵。
申请人之前获得了一株淤泥大洋芽孢杆菌PAPM-A1(CN202211697422X)，其保藏编号为：CGMCC No.25969，该菌株具有降解卡那霉素、产胞外多糖、解蛋白、产IAA、促进作物生长和促进有机物料腐熟等作用，取得了较好的应用效果；但该菌株对番茄软腐病致病菌等病原菌无明显拮抗能力，在农业生产中防病抗病的应用效果不明显。针对上述现状，本发明提供一种能降解卡那霉素和分解蛋白质的堆肥芽孢杆菌，可用于卡那霉素发酵废渣的发酵水解，其相比淤泥大洋芽孢杆菌PAPM-A1具有更强病原菌拮抗能力，特别是对番茄软腐病致病菌的拮抗能力较强，用于生物有机水溶肥的生产，不仅具有改良土壤、促进作物生长的作用，而且对番茄软腐病等作物病害具有防治效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物有机水溶肥及其制备方法与应用，该生物有机水溶肥是以堆肥芽孢杆菌(Bacillus stercoris)PAPM-Y1-2为有效菌株发酵和酶解卡那霉素发酵废渣获得发酵液，并复配低值鱼酶解物干粉制备而成，具有改良土壤、促进作物生长、防治番茄软腐病等作用。
本发明首先自卡那霉素发酵废渣堆肥中分离到一株堆肥芽孢杆菌(Bacillusstercoris)PAPM-Y1-2，该菌株已经于2023年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27681。该菌株具有降解卡那霉素、解蛋白、产IAA、拮抗番茄软腐病致病菌等作用。
本发明还提供了上述堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌株的发酵方法，包括菌种活化、三角瓶种子制备、液体种子罐菌种制备和液态发酵罐发酵等步骤。其中，菌种活化采用LB培养基试管斜面，培养温度为35-37℃，培养时间为20-24h；三角瓶种子制备和液体种子罐菌种制备均采用LB液体培养基，培养温度为32-37℃，震荡或搅拌转速180-220rpm，培养时间为18-30h；液态发酵罐发酵的接种量为2％-4％(体积比)，于32-37℃培养36-48h，即获得堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液。
上述液态发酵罐发酵采用复合培养基，其配方为：卡那霉素发酵废渣干粉100-150g/L、磷酸二氢钾0.3-0.8g/L、硫酸镁0.3-0.8g/L、中性蛋白酶0.8-1.2g/L，于50-55℃酶解60-90min后灭菌，初始pH6.5-7.5。优选为：卡那霉素发酵废渣干粉120g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、中性蛋白酶1.0g/L，初始pH6.5-7.5。
本发明还提供了一种以上述堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液为主要成分的生物有机水溶肥，其组成为：以质量份数计，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液60-80份、低值鱼酶解物干粉19.85-39.95份、卡松0.05-0.15份。优选的，以质量份数计，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液70份、低值鱼酶解物干粉29.9份、卡松0.1份。
上述生物有机水溶肥，其制备方法为：将低值鱼酶解物干粉与卡松慢慢加入发酵液，边添加边搅拌，至均匀无块状颗粒为止，即为本发明所述生物有机水溶肥，其有效成分含量为：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2活菌数≥2×109cfu/mL、有机质含量≥300g/L。
所述低值鱼酶解物干粉的制备方法为：将低值鱼粉配制成底物浓度为8-12％的料液，加热使蛋白质适度变性；溶液冷却后，加入复合蛋白酶，加酶量为2.5-3.5％(占底物百分比)，于50-60℃酶解5-8h，然后升温灭酶，再迅速冷却至50℃以下；采用板框过滤机进行固液分离，得到澄清滤液；滤液真空浓缩后喷雾干燥。所述复合蛋白酶中碱性蛋白酶酶活≥5万u/g，中性蛋白酶酶活≥3万u/g。
本发明还公开了上述生物有机水溶肥的使用方法，其特征是，用于作物栽培时，以重量份数计，用水稀释100-1000倍后冲施，每亩每次用量5-10Kg，作物全生育期施用1-3次。
本发明的优势是：
1、本发明的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2具有降解卡那霉素、解蛋白、产IAA、拮抗番茄软腐病致病菌等作用，以该菌株作为功能菌生产的生物有机水溶肥具有改良土壤、促进作物生长、防治番茄软腐病等作用。
2、本发明采用卡那霉素发酵废渣和低值鱼酶解物为主要原料制备生物有机水溶肥，不仅有利于降低生产成本，拓宽了原料来源，还有利于卡那霉素发酵废渣的无害化和资源化利用。
附图说明
图1为堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的菌落形态；
图2为堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的菌体形态；
图3为基于16SrDNA部分序列构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的筛选
堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2分离于卡那霉素发酵废渣堆肥中。卡那霉素发酵废渣堆肥样品取自山东佐田氏生物科技有限公司堆肥车间。
称取10g堆肥样品，加入100mL无菌水，放入摇床中于180r/min、35℃震荡浸提30min，静置，取悬浊液，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中进行富集培养。富集培养的方法：首先在含300mg/L卡那霉素的LB培养液中，于35℃、180r/min恒温振荡培养3-5天；培养液变混浊后，转接到卡那霉素浓度为600mg/L的LB培养液中，35℃、180r/min恒温振荡继续培养3-5天；培养液再度混浊后，再转到含900mg/L卡那霉素的LB培养液中，35℃、180r/min恒温振荡继续培养3-5天；最后再转入含1200mg/L卡那霉素的LB培养液中，35℃、180r/min恒温振荡继续培养3-5天，得到富集培养物。所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL、pH7.0，121℃灭菌20min。
富集培养物用无菌水进行系列梯度稀释，并分别涂布于1/10浓度LB培养基平板上，于35℃培养，待长出菌落后，分离单菌落，获得不同菌落形态的菌株。根据菌落及菌体形态的差异，将不同菌株分别转接至LB培养基试管斜面上，35℃培养2-3d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。所述1/10浓度LB培养基即各营养物浓度为常规LB培养基1/10的培养基，其中含有1000mg/L卡那霉素。将获得的不同菌落形态的菌株分别接种到以卡那霉素为唯一碳源的培养基中，于35℃、180r/min恒温振荡培养24h～72h，将能够使培养基变混浊的菌株挑出，即为可降解卡那霉素的菌株，保藏备用。所述以卡那霉素为唯一碳源的培养基配方为：2g(NH4)2SO4，0.2g MgSO4，0.5g NaH2PO4，0.1g CaCl2，0.5g K2HPO4，卡那霉素1000mg，加蒸馏水至1L。
抑菌圈法筛选番茄软腐病致病菌的拮抗菌株。将200ml LB培养基融化，冷却到45℃左右时，加入5ml的番茄软腐病致病菌(胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐变种Erwiniacarotovora subsp.Carotovora(Jones)Bergey et al.)的菌悬液，摇匀，倒入培养皿中，冷却凝固。采用预灭菌的牙签，分别取所分离的卡那霉素降解菌株的菌苔，点接在平板培养基上，然后于32℃恒温培养48h后，观察各菌株的生长情况，筛选抑菌圈与菌落直径比值较大的菌株。
综合考虑所筛菌株在卡那霉素为唯一碳源的培养基中的生长能力和拮抗番茄软腐病病原菌的能力，获得一株卡那霉素降解能力和病原菌拮抗能力较强的细菌，即PAPM-Y1-2菌株。
实施例2：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的鉴定
(1)形态与生理生化特征
所述PAPM-Y1-2菌株的形态及生理生化特征为：在LB培养基上于35℃培养24h，菌落直径约3-6mm，菌落圆形，表面湿润，污白色，边缘不规则，质地均匀(图1)。不同培养时间的菌落特征略有变化。菌体杆状，革兰氏阳性菌，有芽孢(图2)。葡萄糖、甘露醇、山梨醇发酵试验均为阳性，淀粉水解试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，产氨试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，VP试验阴性，吲哚试验阴性。
(2)16SrDNA序列分析
将PAPM-Y1-2菌株接种到LB液体培养基中，于35℃、200r/min摇床培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16SrRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGATCA TGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16SrDNA基因的PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，测序，所得序列如序列表SEQ No.1所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图3所示。PAPM-Y1-2菌株的16sRNA序列(SEQ No.1)：
GGGGGGGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGATCCT。
通过上述步骤，鉴定菌株PAPM-Y1-2为堆肥芽孢杆菌(Bacillus stercoris)。该菌株已经于2023年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.27681。
实施例3：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的有益特性测定
(1)堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2对卡那霉素的降解能力
将堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌株接种到卡那霉素发酵废渣培养基中，于35℃、200r/min恒温震荡培养72h。以不接种堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌株的培养基为空白对照。采用液相色谱法测定发酵前后培养基中卡那霉素的残留量并计算降解率。
所述卡那霉素发酵废渣培养基的制备方法为：卡那霉素发酵废渣经烘干后，粉碎至200目，称取10g，加水100mL，调整pH6.5-7.0，121℃灭菌20min。卡那霉素发酵废渣为卡那霉素发酵生产过程中产生的固废，其有机质含量为78.54％，氮磷钾含量分别为3.23％、1.36％和0.65％，卡那霉素残留量为2.017mg/g。
实验结果表明，空白对照处理卡那霉素的残留量为0.1815mg/mL，而接种堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌株的实验组处理卡那霉素的残留量为0.0071mg/mL，这说明堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2对卡那霉素具有较强的降解能力。
(2)堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的解蛋白能力
将堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2用灭菌的牙签接种到脱脂奶粉培养基平板上，35℃培养48h后，测定透明圈及菌落直径，计算透明圈与菌落直径比(HC)。试验结果表明，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2在脱脂奶粉培养基上产生的透明圈直径为13.2mm，菌落直径为4.1mm，HC值为3.219，这说明该菌株具有较强的蛋白质分解能力，这有利于其对卡那霉素发酵废渣的水解及在土壤中的生长繁殖，有利于其对土壤有机养分的分解转化。所述脱脂奶粉培养基配方为：脱脂奶粉3.0g、葡萄糖1g、琼脂1.6％、去离子水200mL，pH＝7.0-7.2，108℃灭菌15min。
(3)堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2产IAA能力的测定
向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基中接入堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2，于35℃、200r/min震荡培养48h。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液。将加入50μL 50mg/L IAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。实验结果表明，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌悬液的处理呈红色，说明该菌株具有分泌IAA的能力。所述的Salkowski比色液配方为：35％ HClO450mL、0.5mol/L FeCl3 1mL。
实施例4：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液的制备
1)菌种活化：将低温保藏的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌种转接至LB固体培养基试管斜面，于35℃培养24h进行活化。所述LB固体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉20g、水1000mL，pH7.5。
2)三角瓶种子液制备：用接种环刮取活化后的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2菌苔，接种于三角瓶LB液体培养基中，35℃、180rpm震荡培养24h，得到三角瓶种子液。所述LB液体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.5。
3)液体种子罐菌种制备：将三角瓶种子以3％的接种量转接入装有LB液体培养基种子罐中，于35℃培养24h，即为种子罐菌种。培养过程中搅拌转速200rpm，0-10h通风量为8L/min，11-24h通风比为16L/min。所述种子罐容积为20L，内装培养基16L。
4)将种子罐菌种以3％的接种量转接入1000L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基700L，35℃培养36h。发酵过程中搅拌转速为200rpm，0-10h通风量为300-350L/min，此后通风量为600-700L/min。发酵结束后，即得堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液，其活菌含量为1.0×1010cfu/mL，用于生物有机水溶肥的配制。
所述发酵培养基的配方为：卡那霉素发酵废渣干粉120g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、中性蛋白酶1.0g/L，初始pH6.5-7.5。所述中性蛋白酶的产品规格均为10万U/g，其活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》。所述液态发酵培养基的制备方法为：按组方量配制培养基，于50-55℃酶解60-90min，然后升温至121℃灭菌15-30min。所述卡那霉素发酵废渣为卡那霉素发酵生产过程中产生的固废，其有机质含量为78.54％，氮磷钾含量分别为3.23％、1.36％和0.65％，卡那霉素残留量为2.017mg/g。
实施例5：生物有机水溶肥的配制
采用实施例4所制备的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液制备生物有机水溶肥，其配方为：以质量份数计，发酵液70份、低值鱼酶解物干粉29.9份、卡松0.1份。按组方量将低值鱼酶解物干粉与卡松慢慢加入发酵液，边添加边搅拌，至均匀无块状颗粒为止，即为本发明所述生物有机水溶肥，其有效成分含量为堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2活菌数≥2×109cfu/mL、有机质含量≥300g/L。
所述低值鱼酶解物干粉的制备方法为：将低值鱼粉配制成底物浓度为10％的料液，搅拌均匀，90℃加热10min，使蛋白质适度变性；溶液冷却后，加入复合蛋白酶，加酶量为3％(占底物百分比)，于55℃酶解6h，然后升温至90℃维持10min进行灭酶，然后迅速冷却至50℃以下；采用板框过滤机进行固液分离，得到澄清的滤液；滤液采用三效真空浓缩器浓缩至固形物含量20％以上，再进行喷雾干燥，工艺条件为：料液温度为50-55℃，进口温度为180-200℃，出口温度为70-80℃。所述复合蛋白酶中碱性蛋白酶酶活10万u/g、中性蛋白酶酶活5万u/g。
应用例1：在番茄生产中的应用
番茄盆栽试验花盆规格为上内径20cm、下内径14cm、高16cm，每盆装土3kg。试验地点于山东省平阴县安城镇董庄村。所采用的土壤pH6.68，有机质含量16.354g/kg，速效氮含量60.5mg/kg，速效磷含量72.06mg/g，速效钾含量168.61mg/g。盆栽试验共设2个处理组(T1和T2)和1个对照组(CK)，每个处理15盆，每盆1株番茄。处理组T1每盆施用本发明实施例4所制备堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液15g；处理组T2每盆施用本发明实施例5所制备生物有机水溶肥15g；对照组CK每盆施用制备堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液所用的培养基15g。施肥方式均为随浇水冲施，每次冲施5g，第一次冲施在番茄移栽后第7天，此后每10天冲施1次，共3次。在盆栽试验第60天时，进行相关指标测定。株高和茎粗分别采取卷尺和游标卡尺测量；鲜重采用称重法测定。根际土壤酶活性的测定：脲酶测定采用苯酚钠比色法，过氧化氢酶测定采用高锰酸钾滴定法，蔗糖酶测定采用DNS比色法。
试验结果如表1与表2所示。与对照组CK相比，处理组T1和T2的株高、茎粗和鲜重均有不同程度的提高，这说明施加本发明所述堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的发酵液及以其为主要成分制备的生物有机水溶肥均对番茄的生长具有促进作用。与对照组CK相比，处理组T1和T2中的脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性均有不同程度的提高，这说明本发明所述堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2的发酵液及以其为主要成分制备的生物有机水溶肥均可提高番茄根际土壤酶活。
表1对番茄生长的影响
*表中同列数据标识不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
表2对番茄根际土壤酶活的影响
*表中同列数据标识不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
应用例2：对番茄软腐病的防治作用
番茄盆栽试验花盆规格为上内径20cm、下内径14cm、高16cm，每盆装土3kg。试验地点于山东省平阴县安城镇董庄村。所采用的土壤pH6.68，有机质含量16.354g/kg，速效氮含量60.5mg/kg，速效磷含量72.06mg/g，速效钾含量168.61mg/g。盆栽试验共设1个对照组(CK)和1个处理组(T)，每组50株番茄幼苗。对照组CK：于番茄移栽后第1天每株冲施胡萝卜软腐欧氏杆菌菌液(1×106cfu/mL)50mL；于第1天、第16天和第31天冲施预灭菌的本发明所述生物有机水溶肥100倍稀释液，每次50mL，共3次。处理组T：于番茄移栽后第1天每株冲施胡萝卜软腐欧氏杆菌菌液(1×106cfu/mL)50mL；于第1天、第16天和第31天冲施本发明所述生物有机水溶肥100倍稀释液，每次50mL，共3次。分别于第20天、40天和60天观察症状并统计病害严重度和防效。
病害分级标准以整株为指标，具体分级为：0级：无症状；1级：近地面茎部始见水渍状绿色斑块；3级：茎端扩大为圆形或不规则形褐斑；5级：成熟期果实病斑为圆形褪绿小白点；7级：果实病斑变为污褐色斑点；9级：整株果实腐烂。
病情指数(％)＝∑(级值×株数)/(9×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
试验结果如表3所示。处理组T番茄发病指数显著低于对照组CK，第20、40和60天时防治效果分别可达73.91％、69.33％和55.26％。
表3生物有机水溶肥对番茄软腐病的防治作用
Claims (10)
1.一株堆肥芽孢杆菌(Bacillus stercoris)PAPM-Y1-2，所述菌株的保藏编号为：CGMCCNo.27681。
2.权利要求1所述的堆肥芽孢杆菌菌株PAPM-Y1-2在产IAA、解蛋白、降解卡那霉素和拮抗番茄软腐病致病菌方面的应用。
3.权利要求1所述的堆肥芽孢杆菌菌株PAPM-Y1-2的发酵方法，包括菌种活化、三角瓶种子制备、液体种子罐菌种制备和液态发酵罐发酵；其特征是，菌种活化采用LB培养基试管斜面，培养温度为35-37℃，培养时间为20-24h；三角瓶种子制备和液体种子罐菌种制备均采用LB液体培养基，培养温度为32-37℃，震荡或搅拌转速180-220rpm，培养时间为18-30h；液态发酵罐发酵的接种量为2％-4％，于32-37℃培养36-48h，获得堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液；所述液态发酵罐发酵采用复合培养基，具体为：卡那霉素发酵废渣干粉100-150g/L、磷酸二氢钾0.3-0.8g/L、硫酸镁0.3-0.8g/L、中性蛋白酶0.8-1.2g/L，于50-55℃酶解60-90min后灭菌，初始pH6.5-7.5。
4.权利要求3所述发酵方法制备的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液。
5.一种以权利要求4所述的堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液为主要成分的生物有机水溶肥，其特征是，其组成为：以质量份数计，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液60-80份、低值鱼酶解物干粉19.85-39.95份、卡松0.05-0.15份。
6.如权利要求5所述的生物有机水溶肥，其特征是，以质量份数计，堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液70份、低值鱼酶解物干粉29.9份、卡松0.1份。
7.如权利要求5或6所述的生物有机水溶肥，其特征是，其有效成分含量为：堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2活菌数≥2×109cfu/mL，有机质含量≥300g/L。
8.如权利要求5或6所述的生物有机水溶肥的制备方法，其特征是，将低值鱼酶解物干粉与卡松慢慢加入堆肥芽孢杆菌PAPM-Y1-2发酵液中，边添加边搅拌，至均匀无块状颗粒为止，得到生物有机水溶肥。
9.权利要求5或6所述的生物有机水溶肥在改良土壤、促进作物生长和防治番茄软腐病中的应用。
10.权利要求5或6所述的生物有机水溶肥的使用方法，其特征是，用于作物栽培时，以重量份数计，用水稀释100-1000倍后冲施，每亩每次用量5-10Kg，作物全生育期施用1-3次。
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