CN113480383A - 一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，公开了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法，所述适用于盐碱土壤的微生物肥料按照质量份数计，由贝莱斯芽孢杆菌BOB‑2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，以及七水硫酸亚铁10份组成。本发明以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB‑2菌株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314为有效菌，贝莱斯芽孢杆菌BOB‑2菌株分离自盐碱地土壤，具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，获得更好应用效果。

Description

一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法。
背景技术
目前，我国拥有大量的盐碱地，主要分布于西北、华北、东北和滨海地区，总面积约4-5亿亩。当土壤含盐量高于0.2％-0.5％时，将对植物生长产生明显的不利影响。过高的盐分会造成土壤水盐运动失衡、土壤结构发生变化，导致土壤容重增加，土壤颗粒间隙减小，土壤的通透性减弱，土壤的渗透率增加，从而造成土壤板结、肥力下降，植物根系吸水困难，甚至不能生长，最终造成作物减产甚至弃耕。因此如何改良盐碱地，扩大耕地面积，改善生态环境是目前亟需解决的问题。
目前，农业上主要采取物理和化学法治理盐碱地。然而，这些方法大部分治理成本较高，对土质的破坏性较大，并且难以持久有效地解决盐碱地问题。随着国家对生态环境的日益关注，生物改良盐碱地成为农业生产与研究中的一大热点。
生物改良是指利用土壤中的生物和种植耐盐碱植物等方式来改良盐碱土壤。土壤中存在大量的微生物，对土壤养分、有机质含量、土壤理化性质以及作物生长均有显著的促进作用。微生物生长过程中排放在土壤中的分泌物与盐碱成分发生复杂的化学反应，可以改良土壤结构特性，促进盐碱地持续利用。同时，微生物对作物促生作用、对病原菌的拮抗作用、对作物的诱抗作用等，也可提高作物对盐碱胁迫的耐受能力，从而改善作物生长状况，提高产量与质量。
微生物肥料是盐碱地改良与培肥的一类绿色投入品。但普通微生物肥料在盐碱土壤中的应用效果不理想，主要原因是盐碱环境不利于微生物的定植与生长，从而降低了微生物肥料的应用效果。因此，必须从盐碱地生境中选育盐碱耐受能力强、能在盐碱土壤中定植，且具有较好的抗病、促生作用的功能性菌株，用于生产适用于盐碱地的微生物肥料。
近年来，分离耐盐碱菌株并用于开发盐碱地适用的微生物肥料，已成为研究热点，取得了较好的应用效果。贝莱斯芽孢杆菌是一种报道较多的具有抗病促生作用的芽孢杆菌，但分离自盐碱土壤的耐盐碱菌株较少，不适用于生产盐碱地适用微生物肥料。已报道的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌较少，刘环等从自然界分离出一株促进玉米耐盐碱菌株BacillusvelezensisYM6，该菌株可以显著促进玉米幼苗在盐碱条件下的生长，但该菌株不具备拮抗立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等作物病原菌的能力。一般而言，与单一菌剂相比，优选多菌种组合并与腐植酸等原料联用制备的复合微生物肥料往往具有更好的应用效果。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)采取物理和化学法治理盐碱地的方法大部分治理成本较高，难以持久有效地解决盐碱地问题。
(2)普通微生物肥料中的有效微生物在盐碱土壤中定植能力差，盐碱环境不利于其生长繁殖，从而降低了微生物肥料的应用效果，在盐碱土壤中的应用时，对作物的促生与抗病作用效果不理想。
(3)现有贝莱斯芽孢杆菌分离自盐碱土壤的耐盐碱菌株较少，不适用于生产盐碱地适用微生物肥料。
解决以上问题及缺陷的难度为：(1)分离筛选出耐盐碱能力强、对作物的促生与抗病效果好的功能性菌株；(2)建立耐盐碱菌株的发酵工艺，实现经济、清洁生产；(3)与其他有益菌及化学成分进行合理配伍，研制出可进行规模化生产、抗病促生效果较好的生物肥料产品。
解决以上问题及缺陷的意义为：为盐碱地的开发利用提供绿色投入品，促进盐碱地作物生长，减少病害发生，增加产量，提高品质，增加农民收入。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种适用于盐碱土壤的微生物肥料，所述适用于盐碱土壤的微生物肥料按照质量份数计，由贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，以及七水硫酸亚铁10份组成。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22606；所述巨大芽孢杆菌的原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC04314。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的有效活菌含量为(0.5～1.0)×1010cfu/g，所述巨大芽孢杆菌的有效活菌含量为(1.0～2.0)×109cfu/g。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，所述适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一，贝莱斯芽孢杆菌菌种活化；
步骤二，贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备；
步骤三，贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备；
步骤四，贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养；
步骤五，巨大芽孢杆菌菌粉的制备；
步骤六，微生物肥料的配制。
进一步，步骤一中，所述贝莱斯芽孢杆菌菌种活化，包括：
将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。
进一步，步骤二中，所述贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备，包括：
用接种环刮取活化后的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌苔，接种于所述LB液体培养基中，于180r/min、37℃震荡培养24h；其中，所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.5。
进一步，步骤三中，所述贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备，包括：
将三角瓶种子以2％-5％的接种量转接入含LB液体培养基的液体发酵罐中，37℃培养24h；其中，所述种子罐体积为10L，装液量为7L搅拌转速200r/min，通风量为7L/min。
进一步，步骤四中，所述贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养，包括：
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养；
将麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4-7cm；其中，所述麸皮培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)21％，MnSO40.1％，初始含水量50-60％；将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的种子液以2-5％的接种量转接入培养基，发酵培养36-48h；发酵过程中控制品温33-40℃，含水量45-60％，每2-5h翻动一次，以调节温度与供氧；发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉，活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
进一步，步骤五中，所述巨大芽孢杆菌菌粉的制备，包括：
巨大芽孢杆菌的菌种活化、三角瓶种子液制备、液体发酵罐种子制备方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株；巨大芽孢杆菌的固态发酵培养方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株，但发酵培养基的配方为：麸皮99％，Ca(OH)2 1％，MnSO40.1％，初始含水量50-60％；发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
进一步，步骤六中，所述微生物肥料的配制，包括：
取贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份、巨大芽孢杆菌菌粉20份、矿源腐植酸粉50份、七水硫酸锌10份、七水硫酸镁10份以及七水硫酸亚铁10份，混合均匀，即为微生物肥料产品，所述矿源腐植酸粉的总腐植酸含量≥50％(w/w)。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料，在所筛选的耐盐碱抗病促生菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BOB-2菌株的基础上，优选菌种组合，研制出了适用于盐碱土壤的复合微生物肥料。
本发明以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2菌株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314为有效菌，采用的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株分离自盐碱地土壤，具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，特别是适用于盐碱土壤的微生物肥料，并对水稻纹枯病的致病菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)具有拮抗作用；贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株与巨大芽孢杆菌ACCC04314菌株、矿源腐植酸等一起组方制备复合微生物肥料，可获得更好的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株的菌落形态示意图。
图3是本发明实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株的菌体形态，其中图3(b)为图3(a)的局部放大图。
图4是本发明实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株基于16S rDNA部分序列构建的系统发育树示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料按照质量份数计，由贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，以及七水硫酸亚铁10份组成。
如图1所示，本发明实施例提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
S101，贝莱斯芽孢杆菌菌种活化；
S102，贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备；
S103，贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备；
S104，贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养；
S105，巨大芽孢杆菌菌粉的制备；
S106，微生物肥料的配制。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
本发明公开了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法。所述盐碱土壤适用微生物肥料是采用一株耐盐碱抗病促生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2和一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314及矿源腐植酸等原料制备而成的。所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22606，该菌株具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，特别是适用于盐碱土壤的微生物肥料。所述的巨大芽孢杆菌ACCC04314，其原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为ACCC04314。
所述微生物肥料中包含2种菌株：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2菌株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314。
所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.22606；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年5月25日；参据的生物材料：BOB-2；建议的分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis；本保藏中心于2021年5月25日收到，并登记入册，经检测为存活；根据请求，由2021年5月25日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料样品的请求后再延续保存五年。所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗病原菌、防治水稻纹枯病等优良特性或有益作用。
所述巨大芽孢杆菌ACCC04314，其原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为ACCC04314。
所述微生物肥料中还包括腐植酸和微量元素。所述微生物肥料中各组分的含量为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，七水硫酸亚铁10份。
所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2经扩大培养后，接种于固体发酵培养基，于33-40℃培养36-48h，然后烘干、粉碎、与巨大芽孢杆菌菌粉、腐植酸等原料混合均匀，即为所述微生物肥料；所用固体发酵培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)2 1％，MnSO40.1％，初始含水量50-60％。
所述微生物肥料的活菌含量优选为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2(0.5～1.0)×1010cfu/g，巨大芽孢杆菌(1.0～2.0)×109cfu/g。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的筛选
(1)耐盐碱菌株的分离
采集盐碱地土壤，称取10g土壤样品，置于经灭菌处理的装有90mL去离子水和10-20粒玻璃珠的250mL锥形瓶中，放置在摇床180r/min震荡30min。通过梯度稀释法，将土壤悬浊液稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7。用移液枪吸取不同稀释度的土壤悬浊液各0.1mL于LB培养基平板中，涂布均匀。放入37℃培养箱中，培养48-72h。挑取菌落形态特征存在差异的菌株划线培养于分离平板，通过反复划线分离纯化直至获得单菌落。所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠(NaCl)10g/L；琼脂20g/L，pH 7.5。
将所分离的菌株接种于LB盐碱培养基中，37℃恒温培养48-72h，观察并记录菌株的生长状况，选取生长状况相对较好的菌株进行后续试验。所述LB盐碱培养基配方为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠(NaCl)50g/L；琼脂20g/L，pH 9.0。
(2)耐盐碱促生菌株的筛选
对筛得的耐盐碱菌株在盐碱胁迫条件下进行发芽试验，进一步筛选促生效果较好的菌株。试验于铺有滤纸的培养皿中进行，以奶油小白菜种子为供试材料。试验采用的盐碱培养液的组成为：NaCl 25mmol/L，Na2SO4 50mmol/L，NaHCO3 25mmol/L，pH 8.0。空白对照组添加7mL盐碱培养液，试验组分别添加7mL含有不同待筛菌的盐碱培养液(菌悬液，含菌量1×107cfu/mL)。每一处理设置3个平行，每一平行放30粒种子，28℃光照培养箱培养3-7天。根据小白菜幼苗的生长状况筛选出促生效果相对较好的菌株。
(3)拮抗菌株的筛选
以水稻纹枯病致病菌立枯丝核菌为受试病原菌筛选拮抗菌株。在PDA培养基平板上培养立枯丝核菌，获得菌落。用打孔器取直径5mm的菌块，接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.0cm处等距离接种待筛菌株，以不接种待筛菌株的平板为对照，28℃培养10d，选取抑菌圈直径较大的菌株，保存备用。每个处理3次重复。所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
通过上述多重筛选，综合考虑各菌株耐盐碱能力、促生长能力、病原菌拮抗能力，筛选出一株相对较好的菌株，编号为BOB-2。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株的鉴定
(1)形态与生理生化鉴定
通过观察与镜检，所述BOB-2菌株的形态特征为：在LB培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，白色半透明，圆形，表面光滑，隆起，湿润，粘稠，有光泽，质地均匀，边缘整齐(见图2)；菌体呈短杆状(见图3)。
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)测定BOB-2菌株生理生化特征。所述BOB-2菌株的生理生化特征为：有芽孢、革兰氏染色呈阳性、接触酶试验阳性、甲基红反应阴性、V-P试验阴性、丙二酸盐利用试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、淀粉水解试验阳性、运动性阴性、麦芽糖利用试验阳性、甘露醇利用试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、乳糖利用试验阳性。
(2)16S rDNA序列分析
将BOB-2菌株接种到LB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27：5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由青岛睿博兴科有限公司测序，所得序列如序列表SEQ No.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，用MEGA5.5软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图4所示。
通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2。
实施例4：微生物肥料的制备
(1)贝莱斯芽孢杆菌菌种活化
将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。
(2)贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备
用接种环刮取活化后的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌苔，接种于所述LB液体培养基中，于180r/min、37℃震荡培养24h。所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.5。
(3)贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备
将三角瓶种子以2％-5％的接种量转接入含LB液体培养基的液体发酵罐中，37℃培养24h。种子罐体积为10L，装液量为7L搅拌转速200r/min，通风量为7L/min。
(4)贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养。麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4-7cm。将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的种子液以2-5％的接种量转接入培养基，发酵培养36-48h。发酵过程中控制品温33-40℃，含水量45-60％，每2-5h翻动一次，以调节温度与供氧。所述麸皮培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)2 1％，MnSO4 0.1％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
(5)巨大芽孢杆菌菌粉的制备
巨大芽孢杆菌的菌种活化、三角瓶种子液制备、液体发酵罐种子制备方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株。巨大芽孢杆菌的固态发酵培养方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株，但发酵培养基的配方为：麸皮99％，Ca(OH)2 1％，MnSO40.1％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
(6)微生物肥料的配制
所述微生物肥料的配方为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，七水硫酸亚铁10份。所述微生物肥料的配制方法：取组方量的上述各种原料，混合均匀，即为微生物肥料产品，其活菌含量优选为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株(0.5～1.0)×1010cfu/g，巨大芽孢杆菌(1.0～2.0)×109cfu/g。所述矿源腐植酸粉购自山东创新腐植酸科技股份有限公司，总腐植酸含量≥50％(w/w)。
下面结合应用例对本发明的技术方案作进一步描述。
应用例1：微生物肥料对番茄的促生长作用
盆栽试验共设1个处理组(T)和1个对照组(CK)，每个处理25盆。处理组T每盆施用本发明所述微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)，对照组CK每盆施用预灭菌的微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)。试验用土取自东营市垦利区，为轻度盐碱土壤。微生物肥料作为底肥施用，即装盆时将微生物肥料与土壤混合均匀。取长势基本一致，生长状况良好的番茄幼苗移栽到盆中(花盆规格：上内径20cm、下内径14cm、高16cm，每盆装土3kg)，且仅定植1株。在盆栽试验第60天时，进行相关指标测定。株高和茎粗分别采取卷尺和游标卡尺测量；鲜重和干重均采用称重法测定。根际土壤酶活性的测定：脲酶测定采用苯酚钠比色法，过氧化氢酶测定采用高锰酸钾滴定法，磷酸酶测定采用磷酸苯二钠比色法，蔗糖酶测定采用DNS比色法。
试验结果如表1与表2所示。与对照组CK相比，处理组T的株高、茎粗、鲜重和干重均有不同程度的提高，分别提高了35.41％、26.70％、33.73％和30.18％。这说明，施加本发明所述的微生物肥料对番茄的生长具有显著的促进作用。与对照组CK相比，处理组T中的脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性分别提高了36.14％、25.00％和19.76％，这说明本发明所述微生物肥料可以提高番茄根际土壤酶活。
表1微生物肥料对番茄生长的影响
Figure BDA0003154225140000131
表2微生物肥料对番茄根际土壤酶活的影响
Figure BDA0003154225140000132
Figure BDA0003154225140000141
应用例2：微生物肥料对水稻纹枯病的防治作用
盆栽试验共设1个处理组(T)和1个对照组(CK)，每个处理25盆。处理组T每盆施用本发明所述微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)，对照组CK每盆施用预灭菌的微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)。试验用土取自东营市垦利区，为轻度盐碱土壤。微生物肥料作为底肥施用，即装盆时将微生物肥料与土壤混合均匀。每盆种植两株水稻，缓苗5日后，每盆灌根30mL立枯丝核菌孢子悬浮液(1×106孢子/mL)。病原菌灌根10天、20天、30天后，观察症状并统计病害严重度和防效。
纹枯病分级标准：0级：全株无病；1级：第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。病情指数＝∑[(各级病叶数×各级代表值)/(9×总株数)]×100。防效＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100％。
盆栽试验结果如表3所示，接种病原菌10天后，处理组T的防效为83.33％；20天后，防效为59.78％；30天后，防效为44.78％。这说明本发明所述微生物肥料对水稻纹枯病具有较好的防治作用。
表3微生物肥料对水稻纹枯病的防治作用
Figure BDA0003154225140000142
Figure BDA0003154225140000151
应用例3：对大田水稻的促生作用
大田示范应用区位于山东省东营市垦利开发区，示范面积60亩，为轻度盐碱地。实验设两个处理，每个处理30亩。对照处理CK：习惯施肥，亩施尿素30kg、氯化钾15kg、钙镁磷肥30kg。实验处理T：亩施用本发明生物肥料40kg、配施尿素27kg、氯化钾13.5kg、钙镁磷肥27kg。钙镁磷肥一次性作基肥施用，生物肥料60％作基肥施用，40％作为分蘖肥施用，尿素和氯化钾40％作基肥施用，60％作分蘖肥施用。试验期间病虫防治和水分管理按常规方法进行。试验品种为水稻盐丰47，2020年5月25日统一播种，11月5日收割测产。实验结果：对照处理CK平均亩产820Kg，实验处理T平均亩产918Kg，增产11.95％；对照处理CK土壤有机质含量1.52g/g土壤(干基)，实验处理T土壤有机质含量1.68g/g土壤(干基)，提升10.53％。这说明施用本发明生物肥产品具有改良土壤和增加水稻产量的作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东营市垦利区万隆农林经贸有限公司
<120> 一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggatgcgg cgtgctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg 180
gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420
aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600
ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260
aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1440
cgaaggtgga cagagtgg 1458

Claims (10)

1.一种适用于盐碱土壤的微生物肥料，其特征在于，所述适用于盐碱土壤的微生物肥料按照质量份数计，由贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，以及七水硫酸亚铁10份组成。
2.如权利要求1所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.22606；所述巨大芽孢杆菌的原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC04314。
3.如权利要求1所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的有效活菌含量为(0.5～1.0)×1010cfu/g，所述巨大芽孢杆菌的有效活菌含量为(1.0～2.0)×109cfu/g。
4.一种应用如权利要求1～3任意一项所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一，贝莱斯芽孢杆菌菌种活化；
步骤二，贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备；
步骤三，贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备；
步骤四，贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养；
步骤五，巨大芽孢杆菌菌粉的制备；
步骤六，微生物肥料的配制。
5.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述贝莱斯芽孢杆菌菌种活化，包括：
将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。
6.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备，包括：
用接种环刮取活化后的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌苔，接种于所述LB液体培养基中，于180r/min、37℃震荡培养24h；其中，所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.5。
7.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备，包括：
将三角瓶种子以2％-5％的接种量转接入含LB液体培养基的液体发酵罐中，37℃培养24h；其中，所述种子罐体积为10L，装液量为7L搅拌转速200r/min，通风量为7L/min。
8.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养，包括：
采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养；
将麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4-7cm；其中，所述麸皮培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)21％，MnSO4 0.1％，初始含水量50-60％；
将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的种子液以2-5％的接种量转接入培养基，发酵培养36-48h；发酵过程中控制品温33-40℃，含水量45-60％，每2-5h翻动一次，以调节温度与供氧；发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉，活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
9.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述巨大芽孢杆菌菌粉的制备，包括：
巨大芽孢杆菌的菌种活化、三角瓶种子液制备、液体发酵罐种子制备方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株；巨大芽孢杆菌的固态发酵培养方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株，但发酵培养基的配方为：麸皮99％，Ca(OH)2 1％，MnSO40.1％，初始含水量50-60％；发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，活菌含量优选为(1.0～2.0)×1010cfu/g，用于微生物肥料的配制。
10.如权利要求4所述的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述微生物肥料的配制，包括：
取贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份、巨大芽孢杆菌菌粉20份、矿源腐植酸粉50份、七水硫酸锌10份、七水硫酸镁10份以及七水硫酸亚铁10份，混合均匀，即为微生物肥料产品，所述矿源腐植酸粉的总腐植酸含量≥50％(w/w)。
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