CN115960726A - 微紫青霉菌株PQxj3、菌剂制品及其在促进烟草生长方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株能促进烟草生长的微紫青霉菌株PQxj3，其分类命名为Penicillium janthinellum，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC NO：40147。本发明还利用所述菌株PQxj3制成菌剂，并经试验验证发现：该菌株PQxj3和菌剂可以促进烟草生长；用于烟草的种植，烟草根系生长会更加发达，植株会更高更壮，烟叶生长会更大更好。

Description

微紫青霉菌株PQxj3、菌剂制品及其在促进烟草生长方面的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微紫青霉菌株PQxj3、菌剂制品及其在促进烟草生长方面的应用。

背景技术

烟草是一种忌连作的经济作物，长期连作会引起植烟土壤性质恶化，地力下降，增加病虫害发生程度，进而影响烟草的产量和品质（高林,王新伟,申国明,田峰,陈前锋,张明发,张成省.不同连作年限植烟土壤细菌和真菌群落结构差异[J].中国农业科技导报,2019,21(08):147-152.）。烟草产区常年种植烟草，使得烟草产量严重下降，为提高烟草产量，大量使用药剂防治，长期大量施用化学药剂容易使病菌产生抗药性，引起土壤质地的变化，造成环境污染和药剂残留，严重影响人体健康等，同时严重制约着烟草的可持续发展。而促生微生物及其微生物菌剂不仅可以提高作物产量，并且相对于化学药剂也具有更高的经济效益，符合绿色环保的发展理念（高峰,尤垂淮,刘朝科,张涛,汤术开,古力,丁博锐,张重义.施用微生物菌剂对烤烟经济性状及其根际微生态变化的影响[J].福建农业学报,2014,29(12):1230-1235.）。

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物，自由生活在土壤或附生于植物根系的一类的有益微生物。PGPR不仅能促进植物生长，降低化肥的使用量，还可以在一定程度上减少农药的施用，起到“减肥、减药”的作用。目前，有关PGPR的研究与应用主要集中在水稻、小麦、高粱、玉米等重要粮食作物上，烟草根际促生菌研究主要集中在病害生防方面，对促进烟草生长的影响方面研究较少，并且PGPR促进烟草生长方面在实验室和温室取得的成果，实地调查结果却缺乏一致性；这使得真正可以促生烟草生长的根际微生物及其制品少之又少。

针对烟草产量逐年下降的技术问题，为提高烟草产量，符合绿色环保的发展理念，使烟草可持续发展，对烟草促生菌进行资源开发，找出对烟草有促生功能的微生物以解决烟草产量低的实际问题；为提高烟草产量而开发优质促生菌剂制品，优化栽培措施、提高经济效益，则具有广泛而现实的意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种微紫青霉菌株（ Penicillium  janthinellum）PQxj3、菌剂制品及其在促进烟草生长方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株微紫青霉菌株PQxj3，其分类命名为Penicillium janthinellum，该菌株PQxj3在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC NO：40147，保藏日期：2022年3月17日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供了一种利用所述微紫青霉菌株PQxj3制成的菌剂，其将菌株PQxj 3置于添加有麸皮固体培养基的三角瓶中，在28±2℃环境下培养14±2d。

上述的菌剂中，所述麸皮固体培养基经下述步骤制备获得：称取麸皮40g，添加32±5ml蒸馏水，混匀，121℃灭菌20-30min，即获得麸皮固体培养基。

本发明提供了上述微紫青霉菌株PQxj3在促进烟草生长方面的应用。

本发明还提供了上述菌剂在促进烟草生长方面的应用。

上述的应用，进一步的，大田移栽使用时，将烟苗的根系在菌剂中进行蘸根，然后正常移栽种植即可。

和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明挖掘土壤中有益微生物资源，发现一株有益微生物微紫青霉菌PQxj3，该菌株可以显著促进烟草的生长，并且在相关领域从未报道；将其制成菌剂用于烟草的种植，烟草根系生长会更加发达，植株会更高更壮，烟叶生长会更大更好；该微生物菌剂也可以提高烟草的综合抗病能力，减少烟株死亡，使烟草生长更加齐整；提高烟草的产量，并且优于现有市场上的菌剂。

附图说明

图1 为菌株PQxj 3处理20d对烟草生长的影响；

图2 为菌株PQxj 3处理40d对烟草生长的影响；

图3为菌株PQxj3与商用菌剂对烟草生长影响的对比结果；

图4为菌株PQxj3 的形态图，左图为平板培养产孢面，右图为平板培养背面；

图5为ITS序列与NCBI数据库的比对结果；

图6为构建菌株PQxj3的系统发育树；

图7为菌株PQxj3处理大田烟草的生长情况；

图8为不同处理大田烟草成熟期的农艺性状统计，图中，S指代市售哈茨木霉菌剂。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实验过程中，涉及的培养基组成如下。

PDA培养基：将洗净去皮的土豆切成小块，称取200 g加水煮烂，煮沸20~30 min，用八层纱布过滤，加热，加15 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20 g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1L，pH自然，115℃灭菌20 min（分装试管灭菌可制成试管斜面培养基；液体培养基则不加琼脂即可）。

微生物-烟草共培养筛选培养基：MS粉（Murashige ＆ Skoog Basal Medium withVitamins）0.94 g，PDA液体培养基100 ml，蔗糖8 g，琼脂粉10 g，补充水分至1L，pH 5.78～5.82，115℃灭菌30 min。

麸皮固体培养基（250ml三角瓶）：称取麸皮40g，添加32ml的蒸馏水，混合均匀后，121℃灭菌20min。

实验材料与方法：

（一）促生菌微紫青霉菌株（ Penicillium janthinellum）PQxj3的筛选：

1）土壤样品中微生物的分离纯化。

在信阳市烟草公司罗山县楠杆烟站和平桥区邢集镇兰店烟站的烟草种植田中，采集不同条件、不同种植环境以及烟草生长不同时期的根际土壤20 g，将其溶解在200 ml的无菌水中，震荡溶解30 min，之后对样品进行梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个梯度涂布于PDA培养基的培养皿中，28℃培养3 d，挑取单菌落，并再次纯化培养3次，获取纯种微生物；共分离纯化到161株霉菌，用于分离筛选促进烟草生长的微生物。

2）将获得的161株纯种霉菌与烟草无菌苗共培养，筛选促生效果较好的霉菌。

微生物-烟草共培养筛选促生菌：组培获取烟草无菌苗，把烟草无菌苗转移至微生物-烟草共培养筛选培养基上，再将纯种霉菌接种于烟草无菌苗根系，在温度28℃、湿度60%，光照12h和黑暗12h的条件下共培养14 d，考察霉菌对烟草的鲜重、根分支数、根长、茎长等的影响，筛选促进烟草生长的有益霉菌，结果见表1。

表1：不同霉菌对烟草鲜重、须根、根长、茎长的影响

表1的结果显示：共筛选得到3株促进烟草的霉菌，共培养烟草苗生长较好，其中菌株PQxj 3促生效果最好，可以显著增加烟草的鲜重，并且促进烟草根分支生长，使根长和植株茎长都显著增加；PQxj 3菌株是一株非常好的促生菌。

3）盆栽验证筛选实验：

菌剂制备：将菌株PQxj 3置于添加有麸皮固体培养基的三角瓶中，在28℃环境下培养14 d（培养过程中，前期静置使得菌丝体大量生长，然后进行适当摇瓶使菌体均匀分布，然后再次静置培养至产生充足的菌体及孢子），获得PQxj 3微生物菌剂，活菌数约2×10⁸ cfu/g。

基质选用营养土和蛭石。将营养土和蛭石进行灭菌，按照1：1的比例混匀装到10cm*10cm塑料盆中培养烟草；将烟草培养至4-6片叶，挑取长势一致的烟草进行实验；每颗烟草苗按照基质重量5%的添加量，将上述制备所得PQxj 3微生物菌剂添加至烟草幼苗的根部（同时以未添加PQxj 3微生物菌剂作为空白对照CK组），继续培养40d，每20d统计烟草鲜重、根重、茎长、根长指标，检测菌株对烟草生长的影响，筛选烟草促生菌，结果见图1和2。

由图1和图2可以看出：筛选得到的促生菌PQxj 3在盆栽使用，直接施加到烟草幼苗根部，对烟草均没有不好的反应，且均可以促进烟草的生长。与空白对照组相比，菌株PQxj3能显著促进烟草的生长；处理20 d时，鲜重是空白对照组的1.86倍；处理40 d时，烟草的茎长也显著高于空白对照组；并且根重、干重、根长都要优于空白对照组。试验结果说明：PQxj3对烟草有非常好的促生作用，是一株非常好的烟草促生菌。

4）与商用菌剂的盆栽验证实验：

参照上述盆栽实验步骤，将PQxj3菌株与市场上促进烟草生长的普通市售哈茨木霉菌剂进行对比，再次进行盆栽生测，结果见图3。

图3的结果显示：与市场购买的商用菌剂相比，PQxj3菌株表现出突出的促生作用，烟草植株生长更大更壮，不论地上鲜重还是根重，PQxj3菌株处理的烟草都优于市售哈茨木霉菌剂。由此说明：菌株PQxj3是一株非常好的烟草促生菌，并且极具开发潜力，可以制成菌剂产品用于烟草种植，促进烟草的生长。

（二）促生菌微紫青霉菌株（ Penicillium janthinellum）的鉴定：

筛选得到的菌株PQxj3菌落呈毛毡状，表面絮状，产孢面为灰色、灰绿色，背面无色至黄色，有放射型褶裂（见图4）。

通过ITS1和ITS4通用引物对菌株的ITS特异性序列进行PCR扩增，获取菌株ITS基因片段，并与NCBI菌种数据库比对（见图5）、构建菌株的系统发育树（见图6）。

PQxj3菌株的ITS序列：TTTATCATACCTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCATGGCCGCCGGGGGGCACTCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCGGCTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCCCTCAATCTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG

根据上述形态特性、NCBI菌种数据库比对结果以及构建的系统发育树，鉴定该菌株与 Penicillium janthinellum MN727028.1菌株有最高的相似度，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定保藏，确定种属为微紫青霉菌，本申请将其命名为微紫青霉 Penicillium janthinellum PQxj3，保藏编号为CGMCC NO：40147。

（三）促生菌微紫青霉菌株（ Penicillium janthinellum）PQxj3的大田促生长试验：

烟草一般在温室大棚里培育2个月左右，使烟苗具有4-6片真叶，就达到移栽条件。大田移栽使用时，将烟苗的根系在PQxj 3微生物菌剂中进行蘸根，根系蘸取适量菌剂（每棵蘸取2g左右菌剂），然后正常移栽种植（同时以空白、市售哈茨木霉菌剂作为对照），统计烟草的农艺性状（株高、叶宽、叶长、茎围、叶片数、单叶重），分析菌株对烟草生长的影响，确认菌株促生效果真实有效，可以提高烟草产量，结果见图7和图8。

图7和图8的菌株PQxj3大田试验结果显示：烟草促生菌PQxj3菌株处理的烟草生长整齐一致，整体长势比空白对照的烟草要好，统计烟草成熟期的农艺性状，烟草促生菌PQxj3处理的烟草农艺性状（株高90.25 cm、叶长69.67 cm、叶宽34.25 cm、叶片数16.58个、茎围10.75 cm、单叶重94.07 g）均优于空白对照CK组（株高81.08 cm、叶长64.17 cm、叶宽30.92 cm、叶片数16.25个、茎围9.92 cm、单叶重79.29 g）。此外，与市售哈茨木霉菌剂的农艺性状相比，烟草促生菌PQxj3处理的烟草指标整体也均优于哈茨木霉菌剂的农艺性状（株高84.17 cm、叶长68.75 cm、叶宽33.67 cm、叶片数16.25个、茎围10.67 cm、单叶重90.68g）。

综上说明：本发明微紫青霉菌PQxj3是一株对烟草生长有很好促进作用的菌种及菌剂。

Claims (6)

1.一株微紫青霉菌株PQxj3，其分类命名为Penicillium janthinellum，该菌株PQxj3在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC NO：40147。

2.一种利用权利要求1所述微紫青霉菌株PQxj3制成的菌剂，其特征在于，将菌株PQxj3置于添加有麸皮固体培养基的三角瓶中，在28±2℃环境下培养14±2d。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，称取麸皮40g，添加32±5ml蒸馏水，混匀，121℃灭菌20-30min，即获得麸皮固体培养基。

4.权利要求1所述微紫青霉菌株PQxj3在促进烟草生长方面的应用。

5.权利要求2所述菌剂在促进烟草生长方面的应用。

6.如权利要求5所述菌剂在促进烟草生长方面的应用，其特征在于，大田移栽使用时，将烟苗的根系在菌剂中进行蘸根，然后正常移栽种植。

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