CN114456984B - 贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用。本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，上述菌株的保藏编号为：CGMCC No.24160。本发明的贝莱斯芽孢杆菌具有明显的解磷能力，且产植物激素吲哚乙酸IAA，能够定殖于植株的根际土壤，且能促进植株根系和果实的生长。用其制作的肥料在土壤中容易定殖，对土壤中养分转化效果明显，对植物的生长有良好的促进作用。相比单一功能的微生物菌株制成的肥料，本发明能更好地能让土壤养分转化和吸收，从而保证植物生长所需要的充足养分。

Description

贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用。
背景技术
化学肥料的大量使用破坏了土壤结构，影响了农作物的可持续发展。化学肥料的流失，又造成水体和大气污染。在提倡高产、高效、绿色农业的大背景下，高效、复合型促生菌的研究与应用为寻求传统化肥、农药替代产品以及修复受损土壤环境指明了方向。由促生功能制备的肥料可增加土壤肥力、增强植物抗性，具有肥效高、无毒、成本低等特点，是化学肥料的有效替代品。
促生功能的菌株对于植物的促生机制主要包括合成对于植物生长发育有直接促进作用的物质，如吲哚乙酸(IAA)等植物激素、改变元素形态促进植物对于养分的吸收，如解磷等元素。磷是植物的必要元素，不仅是植物细胞的重要组成部分，且对植物生长以及植物的抗病性、抗寒性具有较大的影响，因此植物对磷的吸收极大程度上影响了植物的生长状况。
吲哚乙酸(IAA)是植物生长素的一种，是植物生长过程中分泌的调节植物生长的信号物质，能促进细胞生长，使细胞的体积和质量增加，还具有促进细胞分裂和分化、调节生根等生理功能。
近年来，世界各国都在研究用无毒无害的微生物肥料来取代或部分取代化肥，主要集中在自然菌种的有效利用、化学模拟以及基因工程菌等几个方面，各种微生物制剂被采用以提高有机肥料的功效和利用率。研究表明，许多功能微生物可以溶解土壤中不能被植物直接吸收的磷素，分泌植物生长调节物质，促进植物根系生长，增强植物抗病能力，拮抗土壤中的致病微生物，减少土壤病害的发生。
我国在微生物肥料方面技术尚不完善，大多数菌株在克服养分、病害逆境时功能较为单一，不易在土壤中定殖，导致对土壤中养分的转化不完全，对植物的促进作用不明显，因此获得具有复合能力的促生菌株，对高效改善根际营养与调控土壤微生态环境具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用。本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可高效产IAA的解磷菌，该菌株具有显著促进植株根系和果实的生长，解决现有微生物肥料研制中往往采用单一功能的微生物菌株，其功能单一，不易在土壤中定殖，导致对土壤中养分的转化不完全，对植物的促进作用不明显的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LBSW21-04，上述菌株的保藏编号为：CGMCC No.24160。
本发明还提供了微生物菌剂，包括上述贝莱斯芽孢杆菌以及可接受的助剂。
本发明还提供了肥料，包括上述贝莱斯芽孢杆菌和/或上述微生物菌剂以及可接受的营养物质。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌、上述微生物菌剂和/或上述肥料在提高菌株定殖能力中的应用。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌、上述微生物菌剂和/或上述肥料在提高植物解磷能力和/或产吲哚乙酸能力中的应用。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌、上述微生物菌剂和/或上述肥料在促进植物生长中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中的植物包括：黄瓜、番茄、水稻中的一种或多种。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌和/或上述微生物菌剂的使用方法，取上述贝莱斯芽孢杆菌和/或上述微生物菌剂培养后，浇灌。
本发明还提供了上述肥料的使用方法，取上述肥料施用。
本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，上述菌株的保藏编号为：CGMCC No.24160。本发明的贝莱斯芽孢杆菌具有明显的解磷能力，且产植物激素吲哚乙酸IAA，能够定殖于植株的根际土壤，且能促进植株根系和果实的生长，用其制作的肥料在土壤中容易定殖，对土壤中养分转化效果明显，对植物的生长有良好的促进作用。相比单一功能的微生物菌株制成的肥料，本发明能更好地能让土壤养分转化和吸收，从而保证植物生长所需要的充足养分。
生物保藏说明
生物材料：LBSW21-04；分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)；于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.24160。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示LBSW21-04菌株的菌落形态图(LB固体培养基)；
图2示LBSW21-04菌株的光学显微镜镜检图，放大倍数为1000；
图3示LBSW21-04菌株的溶磷圈效果图；
图4示LBSW21-04菌株在复筛NBRIP培养基的解磷效果；
图5示LBSW21-04菌株产IAA效果；
图6示促生实验效果图。
具体实施方式
本发明公开了贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明菌株的筛选及鉴定、促生试验和检测定殖能力中，所用原料及试剂均可由市场购得；
PVK培养基：葡萄糖10g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，Ca3(PO4)25.0g/L，酵母浸膏0.5g/L，MnSO4·H2O 0.002g/L，FeSO4·7H2O0.002g/L。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 LBSW21-04菌株的筛选及鉴定
(1)采样：从山东滨州蔬菜种植基地采集辣椒、西红柿和芹菜等植株长势较好的根际土样8袋，采样时间为2020年；
(2)菌株分离：产IAA的解磷菌分离采用LB固体培养基的方法进行分离，LB固体培养基分离方法为：从每袋土样中称取25克的样品，分别置于225mL无菌水中，在振荡培养箱上振荡30min，吸取振荡均匀的土壤溶液1mL加入至9mL的无菌水中，即稀释至10-1，逐级稀释直至10-7，然后吸取10-5、10-6、10-7的溶液各100μL，涂布于LB固体培养基的平板上；LB涂布后的平板在35℃培养箱中培养24h，根据平板上菌落形态的不同进行挑取划线，经过2～3次划线纯化，最终挑选出39株细菌，用作下一步的筛选；
(3)菌株初筛：采用平板法，对上述LB分离纯化选出的菌株通过其解磷含量的比较进行初筛；选用改良的PVK固体培养基进行筛选；
具体操作过程为：用灭菌的接种环将菌株分别接在10mL的LB液体培养基内，于35℃震荡培养24h，菌液后期备用。用牛津杯制备PVK固体平板，凝固后，用灭菌镊子将牛津杯取出，取培养后的菌液离心收集菌体，用无菌水悬浮制成菌悬液1×106CFU·mL-1，取100μL菌悬液分别加入上述制备的固体平板孔内，于35℃恒温培养箱中培养3～7d，测量溶磷圈的直径(D)和菌落的直径(d)，计算溶磷圈与菌落直径比(D/d)，菌株溶磷圈大的，溶磷效果好，初筛发现LBSW21-04、TXC-2、TXC-3和TXC-4四株溶磷效果较好(图3)，数据如表1所示；
表1菌株溶磷圈与菌落直径比(D/d)
菌株编号 溶磷圈直径(D)/mm 菌落直径(d)/mm D/d
LBSW21-04 19.52 6 3.25
TXC-2 17.57 6 2.93
TXC-3 17.89 6 2.98
TXC-4 18.92 6 3.15
(4)菌株复筛：采用摇瓶法进行复筛，复筛用NBRIP培养基；
操作步骤为：于三角瓶中装入液体培养基100mL，高压灭菌后备用；将实施例1(3)中选出的4株溶磷效果好的菌株用LB液体培养基培养，培养后将细菌离心收集菌体，用无菌水悬浮制成菌悬液1×106CFU·mL-1，取1mL菌悬液接种于上述灭菌的NBRIP培养基中，以接入等体积无菌水为对照；35℃摇床培养7～10d；测定磷含量，发现其中LBSW21-04和TXC-4两株菌效果最好(图4)；
(5)解磷菌株产吲哚乙酸IAA能力的检测(图5)，采用Salkowski比色法测定分泌的IAA含量。
操作步骤为：于250mL三角瓶中装入LB培养基100mL，高压灭菌备用；将实施例1(3)培养的LBSW21-04和TXC-4菌液离心收集菌体，用无菌水悬浮制成菌悬液1×106CFU·mL-1，取1mL菌悬液接种于上述灭菌的LB液体培养基中，以接入等体积无菌水为对照；35℃摇床培养7～10d，将发酵的菌液8000r/min离心5min，上清液分别用Salkowski比色法测定菌液中的IAA含量，数据如表2所示。将菌悬液离心后所得上清液按体积比1:1与Salkowski比色液混合，混合液在室温下避光静置30min后，于530nm处测定吸光度值，空白对照为未接种的培养基与Salkowski比色液的等体积混合液；
表2菌株产IAA含量
样品 OD530 IAA浓度(μg/mL)
LBSW21-04 0.641 116.5072
TXC-4 0.316 33.264
ck 0.256 0.1
结果表明，产IAA的解磷菌确定：综合比较2个菌株在溶磷和产吲哚乙酸的能力，其中LBSW21-04菌株的效果最明显，即该菌株为产IAA的解磷菌，上述产IAA的解磷菌形态为菌落呈白色，不透明，粘稠，边缘整齐，如图1所示；
(6)菌株鉴定：用提取菌株的基因组DNA，进行16Sr DNA序列分析，在NCBI数据库进行比对，结果LBSW21-04与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis两者相似度高达100％。结合菌落、菌体形态特征将LBSW21-04鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis；
LBSW21-04菌株的序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2黄瓜生长试验
(1)LBSW21-04及TXC-4菌液配制
将实施例1获得的2株菌活化后，分别接种于解磷液体培养基中，恒温培养至对数生长期，在无菌操作台将菌液转入灭过菌的离心管中，8000r·min-1离心5min，倒掉上清液，用无菌水反复洗涤离心管底部菌体后，将其重悬于无菌水中，利用比浊法，通过测定菌悬液DO600来进行调制，调制菌悬液DO600为1，即为LBSW21-04和TXC-4菌液。
(2)以黄瓜为实验材料，分别设置对照组(接种菌株TXC-4)、试验组(接种菌株LBSW21-04)、空白组(不接菌)，各组试验添加磷酸钙，每个处理设置4个重复。即每盆种4颗棵大小、高度和长势差不多的黄瓜苗，定植后，试验组菌液分批次浇灌添加，对照组浇灌等量无菌水。定期管理，每5天浇无菌水以保持土壤含水量的稳定，试验组每15天浇一次菌液，防治病虫害，定期轮换盆的位置，30d后检测结果。
结果表明，表3为各处理组30d时株高茎粗结果，由表3可以看出，接种LBSW21-04可提高黄瓜株高茎粗生长，且实验组黄瓜数较对照组明显多，表明可显著促进黄瓜的生长。
表3黄瓜生长实验结果
30d株高(cm) 30d茎粗(cm) 雌花分化数
LBSW21-04 35.18±0.45a 0.76±0.3a 13
TXC-4 34.89±0.33b 0.63±0.75a 7
空白 25.08±0.30c 0.49±0.24b 5
同列数据之间不同小写字母示具有显著差异(P＜0.05)；同列数据之间不同大写字母示具有极显著差异(P＜0.01)。
实施例3番茄盆栽试验检测菌株在土壤中的定殖能力
将10kg的土壤混匀分别装入3个盆中，并与500mL浓度为1×108CFU/mL的实施例1获得的LBSW21-04及TXC-4菌液分别混合，以相同量不接菌的培养液为对照，栽培番茄，每个菌液处理5个重复。在番茄的整个生长期中，分别在种植后的第2、25、40、65d采集各个处理中的土壤样品，在LB培养基中采用稀释平板涂布法计数其中的菌落含量。
试验结果见表4，可以看出，LBSW21-04菌在土壤中的定殖能力强。
表4菌株在土壤中的定殖能力结果
采集时间 CK(1×107cfu/g) LBSW21-04(1×107cfu/g) TXC-4(1×107cfu/g)
第2d 3.4±0.45a 15.2±0.78a 14.9±0.20a
第25d 3.2±0.39a 15.0±0.56a 13.2±0.76a
第40d 2.7±0.4b 14.5±1.33a 10.1±0.97b
第65d 2.1±1.24c 13.7±0.27a 7.65±0.35c
同列数据之间不同小写字母示具有显著差异(P＜0.05)；同列数据之间不同大写字母示具有极显著差异(P＜0.01)。
实施例4菌株促生功能验证
使用玉米作为实验作物，进行种子萌发幼苗生长促生实验，菌株接入LB液体培养基35℃培养24h作为种子液，以1％的接种量(1×106CFU·mL-1)接到100mL的液体培养基中35℃培养24h。8000r·min-1离心5min后，收集菌体后以无菌水为空白对照，22℃昼夜比16/8的光照培养箱中培养7d。结果如下表5和图6所示。
表5促生试验结果
编号 根长/cm 鲜重/g 干重/g
CK 5.612±0.53c 0.0063±0.23c 0.0020±0.96c
LBSW21-04 15.514±1.28a 0.0098±0.36a 0.0035±1.56a
TXC-4 10.284±0.69b 0.0081±0.11b 0.0029±0.85b
TXC-3 9.547±0.51b 0.0086±0.50b 0.0027±2.1c
同列数据之间不同小写字母示具有显著差异(P＜0.05)；同列数据之间不同大写字母示具有极显著差异(P＜0.01)。
结果表明，植株在根长、干重、鲜重等方面进行测量后发现，在根长方面，LBSW21-04菌将玉米的根长显著增加。
实施例5促水稻生长试验
盆栽试验采用实施例1获得的产IAA的解磷菌LBSW21-04及土秀才微生物菌剂。将菌株活化后，在对数生长期内，制成菌悬液1×106CFU·mL-1浓度浸泡水稻苗根部，对照用无菌水浸泡。然后转接到装有水稻土的塑料盆中，每个塑料盆中再加入植物少氮营养液，4个重复，放室温下进行培养。定期管理，记录并检测水稻的叶长、根长、鲜重、干重及根重。
水稻经盆栽培养40天(d)后，测量水稻的叶长、根长、鲜重、干重及根重。结果见表6。可以看出，LBSW21-04接种水稻之后，与土秀才微生物菌剂相比水稻的叶长、根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对水稻有明显的促生作用。
表6水稻生长实验结果
编号 叶长/cm 根长/g 鲜重/g 干重/g 根重/g
CK 38.14±1.09c 9.56±0.77c 1.35±0.09c 0.56±0.02c 0.1±0.01c
LBSW21-04 50.82±0.85a 14.86±0.45a 3.98±0.27a 1.06±0.0.6a 0.19±0.03a
土秀才 45.26±0.54b 13.65±0.58a 2.84±0.32b 0.94±0.01a 0.14±0.07b
同列数据之间不同小写字母示具有显著差异(P＜0.05)；同列数据之间不同大写字母示具有极显著差异(P＜0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东绿邦生物科技有限公司
<120> 贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂、肥料及其应用
<130> MP21037933
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1349
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60
gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120
ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca tggttcagac 180
ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240
aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360
acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540
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ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720
ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840
ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020
gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260
ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatg 1349

Claims (8)

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于，所述菌株的保藏编号为：CGMCC No.24160。
2.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌以及可接受的助剂。
3.肥料，其特征在于，包括如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或如权利要求2所述的微生物菌剂以及可接受的营养物质。
4.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、如权利要求2所述的微生物菌剂和/或如权利要求3所述的肥料在提高植物解磷能力和/或产吲哚乙酸能力中的应用。
5.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、如权利要求2所述的微生物菌剂和/或如权利要求3所述的肥料在促进植物生长中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物包括：黄瓜、番茄、水稻中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或如权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，取所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或所述的微生物菌剂培养后，浇灌。
8.如权利要求3所述的肥料的使用方法，其特征在于，取所述肥料施用。
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