CN111849856A - P.indica厚垣孢子、P.indica孢子菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属现代农业领域。P.indica厚垣孢子，其特征是，所述P.indica厚垣孢子如下发酵方法获得：培养基接种P.indica摇瓶培养72h获得培养液，按体积比1:10接种到灭菌的发酵罐中，继续培养96h后，加入0.3‑0.5wt％的Ca(OH)₂培养48h，诱导产生厚垣孢子。P.indica孢子菌剂，其有效成分为P.indica厚垣孢子。本发明还公开了上述P.indica孢子菌剂的制备方法。本发明制备的P.indica孢子菌剂可以在作物根际定殖共生，促进农作物的生长，提高作物产量。

Description

P.indica厚垣孢子、P.indica孢子菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属现代农业领域，涉及一种用于促生作物生长的植物内生真菌Piriformospora indica孢子菌剂及其制备方法。

背景技术

P.indica是印度科学家最早从塔尔沙漠中灌木根际分离获得的植物根际内生真菌，是目前唯一鉴定的担子菌门、层菌纲、梨形孢属的一个种。P.indica菌丝定殖于植物根系表面、表皮细孢和细孢间隙，并形成典型的梨形厚垣孢子，长期定殖存活在作物根系。P.indica寄主范围广泛，可以与150多种单子叶植物、双子叶植物共生，通过促进植物对氮、磷等营养物质的吸收，诱导植物产生系统抗性，在促进植物生长、提高产量的同时，增强植物的系统抗病、抗旱、耐盐能力，是一种具有广泛开发潜力的抗病、增效多功能植物内生真菌。番茄接种定殖P.indica，生物量增加了19-28％，坐果率增加了15％；大麦经P.indica处理不仅产量提高，而且增强了植物抵抗镰刀菌等病原菌的侵染能力。2019年沙特阿拉伯阿卜杜拉国王大学研究报道，P.indica通过诱导活性氧(ROS)清除系统和调节N⁺/K⁺离子平衡保护植物免受盐胁迫侵害，使番茄产量提高了56％，Science发表专题评论认为是提高产量、改良土壤盐碱化的有效方法。

P.indica是重要的农业微生物资源。但当前国内外对P.indica等植物内生菌研究主要集中在该菌对植物抗病、促生作用及相关机理方面，应用研究相对滞后。P.indica是一种可在人工培养基上完成纯培养的内生植物真菌。现有对P.indica的研究主要集中在P.indica菌丝上。由于菌丝是营养增殖体，对环境条件敏感，生长不适宜条件下菌丝容易衰败死亡，导致腐生细菌繁殖，影响产品质量和货架期，而且，实际使用过程中经常面临高温、干旱、光照、土壤酸碱度等多种逆境因素，影响产品的推广应用价值。

公开号CN104541668A、2016年6月22日的中国发明专利申请说明书公开了一种提高烟草漂浮育苗种子发芽率和壮苗的方法，是将用液体培养基培养的植物根内生真菌印度梨形孢的菌体和培养滤液与烟草育苗基质混匀，利用印度梨形孢的菌体及其释放在培养滤液中的物质提高烟草漂浮育苗的种子发芽率并促进烟苗生长和抗逆；具体包括以下步骤：(1)用人工液体培养基培养印度梨形孢，获得菌液；菌液包括菌体和培养滤液，菌体包括印度梨形孢菌丝和孢子；(2)将前述菌液与烟草育苗基质(以下简称基质)混匀得到菌液基质混合物；(3)将菌液基质混合物装入聚苯乙烯格盘后播种烟草，或者，按常规方法播种烟草后覆盖一薄层菌液基质混合物；(4)按常规方法进行漂浮育苗、炼苗和移栽。上述方法主要利用了菌体菌丝，无法解决菌丝易衰败死亡，导致腐生细菌繁殖的技术问题。

公开号CN105766492A、公开日2016年7月20日的中国发明专利申请说明书公开了一种利用印度梨形孢和聚六亚甲基双胍盐酸盐联合防治烟草青枯病的方法，包括以下步骤：(1)将烟草种子播种于混有印度梨形孢(Piriformospora india)菌丝的育苗基质中，成苗后移栽至大田；(2)移栽前，用聚六亚甲基双胍盐酸盐药液浇灌烟草苗移栽用洞穴；移栽后10-15天，再用聚六亚甲基双胍盐酸盐药液对每株烟草植株进行灌根处理。上述方法主要利用了菌体菌丝，无法解决菌丝易衰败死亡，导致腐生细菌繁殖的技术问题。

公开号CN105850535A、公开日2016年8月17日的中国发明专利申请说明书公开了一种一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，利用在蒺藜苜蓿根部寄生印度梨形孢来提高蒺藜苜蓿耐盐性的方法，其主要利用了菌体菌丝，无法解决菌丝易衰败死亡，导致腐生细菌繁殖的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的提供一种P.indica厚垣孢子，以解决P.indica菌丝易衰败死亡，导致腐生细菌繁殖的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，一种P.indica厚垣孢子，其按如下发酵方法获得：培养基接种P.indica摇瓶培养72h获得培养液，按体积比1:10接种到灭菌的发酵罐中，继续培养96h后，加入0.3-0.5wt％的Ca(OH)₂培养48h诱导产生厚垣孢子。

人工培养的P.indica主要以丝状菌丝体生长繁殖，后期在菌丝端部可产生具有抗逆性的厚垣孢子。厚垣孢子是真菌特定生长阶段无性繁殖体，通过菌丝断裂、细胞膨大、原生质浓缩、细胞壁加厚形成的一种具有抵御逆境能力的厚壁孢子，适宜条件下萌发产生菌丝。因此，以厚垣孢子作为P.indica的繁殖体，研制开发P.indica孢子菌剂是延长产品货架期、提高产品使用性能的重要途径。采用本发明的诱导方法，诱导产生大量的P.indica厚垣孢子，利用其抗逆性，延长其寿命。

对本发明作进一步改进，所述培养基组成成分重量比为：玉米粉1-3％，CaCO₃0.1-0.5％，蛋白胨0.05-0.2％，酵母膏0.05-0.1％，余为H₂O补足。

对本发明作进一步改进，所述培养条件：温度25-28℃。摇瓶速度100rpm，发酵罐搅拌速度30rpm。

本发明的第二个目的是提供一种促进作物生长的P.indica孢子菌剂，以解决现有P.indica菌丝产品稳定性差，货架期短的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，一种促进作物生长的P.indica孢子菌剂，其有效成分为P.indica厚垣孢子。

本发明在分离筛选、鉴定植物内生真菌P.indica的基础上，通过内生真菌液体深层培养及孢子诱导技术，提高内生真菌纯培养的发酵水平，利用厚垣孢子抗逆性，研制开发稳定性好、持效期长的多功能植物内生菌孢子菌剂，为发挥微生物在维持与提高土壤肥力、保持土壤质量及健康，实现农业生产的持续稳定发展提供有效生物技术及供给支撑。

对本发明作进一步改进，所述促进作物生长的P.indica孢子菌剂还包含作为保护剂的甘油和奶粉、作为吸附载体的白炭黑、作为分散剂的NNO、作为乳化剂的脂肪醇聚氧乙烯醚和作为悬浮载体介质的矿物油。

对本发明作进一步改进，所述P.indica厚垣孢子为液体发酵培养诱导形成的厚垣孢子浓缩固形物，重量占所述孢子菌剂总重量的比例为5-10％，孢子含量≥1×10⁷cfu/g；

所述奶粉的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述甘油的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述白炭黑的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为3-5％；

所述NNO的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述脂肪醇聚氧乙烯醚的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.3-0.5％；

余量为悬浮载体介质矿物油。

对本发明作进一步改进，所述P.indica孢子菌剂中各组分的含量(重量比)分别为：10％发酵厚垣孢子固形物，0.5％奶粉，0.5％甘油，5％白炭黑，1％NNO，0.5％脂肪醇聚氧乙烯醚，82.5％矿物油。

本发明的第三个目的是还提供一种促进作物生长的P.indica孢子菌剂的制备方法，以解决P.indica孢子菌剂的制备问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，一种促进作物生长的P.indica孢子菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)P.indica厚垣孢子发酵培养液经匀浆、离心脱去水分，获得厚垣孢子固形物。血球计数板显微镜检厚垣孢子含量>10⁷cfu/g；

(2)上述浓缩的P.indica厚垣孢子固形物中分别按比例加入奶粉、甘油搅拌混合均匀；

(3)上述混合物中加入白炭黑、NNO搅拌混合均匀。

(4)按比例取脂肪醇聚氧乙烯醚、矿物油置于反应釜中，边搅拌边加入上述混合物并混合均匀，置剪切机中高速剪切成稳定油乳状而制备获得P.indica孢子菌剂。

优选的，所述离心速度为1000-2000rpm；高速剪切时间为15-20min；剪切速度为2000-3000rpm。

本发明制备的P.indica孢子菌剂可以在番茄、西瓜、辣椒、油菜等作物根际定殖共生。油菜苗期用孢子菌剂处理15d后，油菜根际皮层细胞间定殖共生了P.indica，形成典型的梨形厚垣孢子。不同浓度的孢子菌剂对油菜幼苗生长具有明显的促进作用，特别是地上茎叶鲜重增加明显。与对照相比，不同浓度孢子菌剂处理的油菜苗地上部分鲜重分别增加了65.3％和92.7％。

附图说明

图1本发明实施例3P.indica厚垣孢子在番茄根际的定殖图；

图2本发明实施例3P.indica厚垣孢子在西瓜根际的定殖；

图3本发明实施例3P.indica厚垣孢子在辣椒根际的定殖；

图4是本发明实施例4P.indica厚垣孢子在油菜苗根际的定殖观察图；

图5是本发明实施例4P.indica孢子菌剂灌根处理对油菜苗的促生效果图。

图6是本发明实施例4P.indica孢子菌剂对油菜苗不同组织部位的促生作用图。

具体实施方式

实施例1

P.indica菌种接种到PDA平板上活化，培养5d后形成菌落。(P.indica菌为现有菌种，可以采用公开号为CN107155896A、公开日2017年9月15日的中国发明专利中公开的P.indica菌。)按照玉米粉2wt％、CaCO₃ 0.3wt％、蛋白胨0.2wt％、酵母膏0.1wt％、H₂O97.4wt％比例配置液体发酵培养基，以0.1M HCl调节pH至6.5。发酵培养基按100mL/瓶的量装入250mL摇瓶中灭菌，无菌条件下挑取活化培养的菌落接种到摇瓶中，28℃震荡培养72h。无菌条件下收集摇瓶培养液，按照体积比1:10比例接种到灭菌的发酵罐培养基中，保持罐压0.1Mpa,通气量1:0.1(体积比)，28℃继续培养96h，同时接入0.1wt％Ca(OH)₂培养24h，诱导生成厚垣孢子，另以同样条件培养、未接入0.1wt％Ca(OH)₂的处理为对照。培养终止后取样测定生物量，测定厚垣孢子的含量。生物量测定采用湿重法，培养液经高速离心(12000rpm，15min)去除上清液，称量固体沉淀物的湿量，计算培养生物量。厚垣孢子量计算以培养液在匀浆机中匀浆，使厚垣孢子分散在培养液中，采用血球计数板显微镜下计数。结果表明，0.1wt％Ca(OH)₂对P.indica生物量的形成无明显影响，但显著促进厚垣孢子的产生，0.1wt％Ca(OH)₂诱导培养24h后，厚垣孢子含量达2.3×10⁵cfu/mL，较对照厚垣孢子量增加了近500倍(表1)。

表1 P.indica液体发酵诱导的生物量和厚垣孢子量

实施例2

实施例1中诱导产生的P.indica厚垣孢子培养液经离心机(8000rpm，15min)离心获得固形物，按照重量比5％厚垣孢子固形物中加入1wt％奶粉、1wt％甘油在混合器中搅拌混合。

混合器中按重量比加入3wt％白炭黑、1wt％NNO后继续搅拌混合至混合菌液被完全吸附。

反应釜中按重量比加入0.5wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、88.5wt％矿物油，边搅拌边加入上述混合物，移入剪切机中高速剪切致微乳状，制备获得10⁶cfu/mL P.indica孢子菌剂。厚垣孢子菌剂在55℃贮存14d后，测定厚垣孢子存活率，评价孢子菌剂的稳定性。

采用平板菌落计数法计算孢子菌剂中微生物的含量。取上述制备的孢子菌剂5mL，悬浮于500mL无菌水中。取悬浮液1mL，分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5X(由预试验得出)，取0.1mL的稀释菌液涂布于固体PDA培养细菌基平板上，28℃培养5d后，计算孢子菌剂中P.indica的活菌数(表2)。测定结果表明，按照本发明方法制备的P.indica孢子菌剂厚垣孢子含量达1.27×10⁶cfu/mL。孢子菌剂性能稳定，耐储存，高温55℃储存2周(14d)测定厚垣孢子含量仍达1×10⁶cfu/mL以上，符合产品设计的浓度要求。

表2 P.indica孢子菌剂含菌量测定

实施例3

试验P.indica孢子菌剂在番茄、西瓜、辣椒等不同作物根际的定殖作用。番茄、西瓜、辣椒种子以基质营养土穴盘育苗。各取苗龄相近、生长健壮的种苗10株用于移栽定植。移栽前，轻轻抖落根际基质营养土，使根系裸露，在实施例2中的P.indica孢子菌剂800X稀释液中蘸根5min，移栽到种植土壤中，浇透水使其活棵。正常农业管理15d后，随机选取3株不同植物并带土挖出根系，流水中洗净根系土壤，截取不同部位根系，解剖镜下撕取皮层，置于棉兰染色液中浸泡过夜，400X光学显微镜下观测，可以发现，P.indica在番茄、西瓜、辣椒根际皮层都能形成定殖，并形成典型的梨形厚垣孢子，见图1、图2、图3。

实施例4

室内盆钵试验P.indica孢子菌剂对油菜生长的影响。取农用土表层30cm土样，破碎混合均匀后，分成3等分，分别装填到3个直径30cm、高35cm的盆钵中，上述盆钵中分别播种50粒油菜种子并浇透水。种子发芽出苗后10d，间苗保留长势大小相近的油菜苗40株，其中1个处理以20mL清水灌根作对照，另2个处理分别以20mL的400X、800X孢子菌剂稀释液灌根，继续培养15d，观察植物生长情况，取样测定地上植株和地下根部鲜重，同时显微镜检观察根际内生菌定殖情况。结果表明，孢子菌剂处理15d后，油菜根际皮层细胞间定殖共生了P.indica，形成典型的梨形厚垣孢子(图4)。不同浓度的孢子菌剂对油菜幼苗生长具有明显的促进作用，特别是地上茎叶鲜重增加明显(图5)。与对照相比，不同浓度孢子菌剂处理的油菜苗地上部分鲜重分别增加了65.3％和92.7％(图6)。

Claims (9)

1.P.indica厚垣孢子，其特征是，所述P.indica厚垣孢子通过如下发酵方法获得：培养基接种P.indica摇瓶培养72h获得培养液，按体积比1:10接种到灭菌的发酵罐中，继续培养96h后，加入0.3-0.5wt％的Ca(OH)₂培养48h，诱导产生厚垣孢子。

2.根据权利要求1所述的P.indica厚垣孢子，其特征是，所述培养基组成成分重量比为：玉米粉1-3％，CaCO3 0.1-0.5％，蛋白胨0.05-0.2％，酵母膏0.05-0.1％，余为H₂O补足。

3.根据权利要求1所述的P.indica厚垣孢子，其特征是，所述培养条件：培养温度25-28℃；摇瓶速度100rpm，发酵罐搅拌速度30rpm。

4.P.indica孢子菌剂，其特征是，P.indica孢子菌剂有效成分为权利要求1-3任一项所述的P.indica厚垣孢子。

5.根据权利要求4所述的P.indica孢子菌剂，其特征是，所述P.indica孢子菌剂还包含：甘油、奶粉、白炭黑、NNO、脂肪醇聚氧乙烯醚、矿物油。

6.根据权利要求5所述的P.indica孢子菌剂，其特征是，所述P.indica厚垣孢子为液体发酵培养诱导形成的厚垣孢子浓缩含固，P.indica厚垣孢子重量占所述孢子菌剂总重量的比例为5-10％，孢子含量≥1×10⁷cfu/g；

所述奶粉的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述甘油的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述白炭黑的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为3-5％；

所述NNO的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.5-1％；

所述脂肪醇聚氧乙烯醚的重量占所述孢子菌剂总重量的比例为0.3-0.5％；

余量为悬浮载体介质矿物油。

7.根据权利要求5所述的P.indica孢子菌剂，其特征是，所述促进作物生长的P.indica孢子菌剂包括：10wt％发酵厚垣孢子固形物，0.5wt％奶粉，0.5wt％甘油，5wt％白炭黑，1wt％NNO，0.5wt％脂肪醇聚氧乙烯醚，82.5wt％矿物油。

8.根据权利要求4-7任一项所述的P.indica孢子菌剂的制备方法，其特征是，所述制备方法包括以下步骤：

(1)P.indica厚垣孢子发酵培养液经匀浆、离心脱去水分，获得厚垣孢子固形物；血球计数板显微镜检厚垣孢子含量>10⁷cfu/g；

(2)步骤(1)得到的浓缩的P.indica厚垣孢子含固物中分别加入配方量的奶粉、甘油搅拌混合均匀；

(3)步骤(2)得到的混合物中加入配方量的白炭黑、NNO搅拌混合均匀；

(4)将配方量的脂肪醇聚氧乙烯醚、矿物油置于反应釜中，边搅拌边加入上述混合物并混合均匀，置剪切机中高速剪切成稳定油乳状，获得P.indica孢子菌剂。

9.根据权利要求8所述的P.indica孢子菌剂的制备方法，其特征是，所述离心速度为1000-2000rpm；高速剪切时间为15-20min；剪切速度为2000-3000rpm。

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