CN107427012A

CN107427012A - 微生物组合物和方法

Info

Publication number: CN107427012A
Application number: CN201580060885.7A
Authority: CN
Inventors: 玛格丽特·拜沃特-埃克加德; 阿南达·菲茨西蒙斯
Original assignee: Inocucor Technologies Inc
Current assignee: Concentric Agricultural Co
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2017-12-01
Also published as: BR112017004660A2; SG11201701820VA; AU2015313924A1; DOP2017000061A; US10588320B2; IL250998A0; EP3190894A2; JP2017534671A; CA2960340C; US20160100587A1; MX2017003050A; EP3190894A4; CA2960340A1; WO2016038460A3; WO2016038460A2; AU2019275655A1

Abstract

本公开包括用于生物刺激如种子萌发和植物生长的组合物和方法。例如，本公开包括用于影响、增强、调节、刺激或辅助植物生长的组合物和方法。本摘要旨在作为用于在特定领域中进行检索的扫描工具，并不旨在限制本公开。

Description

微生物组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年9月9日提交的美国临时申请No.62/048,256的权益，其全部内容通过引用并入本文。

通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用

2015年9月9日作为名称为“26148_0002P1_Seq_ST25.txt”的文本文件提交的序列表创建于2015年9月9日，大小为1,348字节，根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，其通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及通过施用所公开的组合物有效改善植物生长反应，包括如萌发率、早期植物生长、植物产量和生物量的组合物和方法。

本公开的背景

植物生物刺激剂是在叶面施用和/或在加入土壤时影响植物生长和/或代谢的不同于化肥的成分。植物生物刺激剂包括但不限于含激素的产品、含氨基酸的产品和含腐殖酸的产品。示例性植物生物刺激剂包括基于海藻提取物、腐殖酸、氨基酸、水杨酸、生物固体、水解蛋白质、硅酸盐和/或合成化合物的组合物。植物生物刺激剂用于在商业环境中处理作物，部分原因是其提高生长速率、降低有害植物生长、提高胁迫耐受性、提高光合速率以及提高病害耐受性的能力。虽然植物生物刺激剂对植物发挥作用的精确机制，一种假设是其通过上调或下调植物激素来起作用。

尽管农业组合物和方法有了进步，但是仍然需要可以进行植物生物刺激，即改善植物生长反应和发育，同时减少化学肥料的使用的组合物和方法。本文公开的方法和组合可以满足这些需求和其他需求。

概要

根据本文的公开内容，如本文中体现和广泛描述的，在一个方面，本公开涉及用于植物生物刺激的组合物和方法。在各个方面，本文公开了包含微生物培养物的无细胞上清液的组合物，所述微生物培养物包含微生物的混合物，其可以包含细菌、真菌、藻类和/或微生物中的一种或多种。本公开的方法包括使用本文公开的组合物来增强植物的生长。

公开了包含用分离的微生物接种的微生物培养物的无细胞上清液的组合物，其中所述微生物包含曲霉属(Aspergillus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、乳杆菌属(Lactobacillusspp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、酵母属(Saccharomyces spp.)或链球菌属(Streptococcus spp.)或其组合。

还公开了增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供所公开的无细胞上清液组合物，从而增强植物生长。当用本文公开的组合物处理的植物与在相同条件下生长的未用该组合物处理的植物相比具有不同(例如，改善)的生长特性时，生长得到增强。

还公开了制备包含无细胞上清液的制品的方法，其包括向制品的表面提供所公开的无细胞上清液组合物。

还公开了制备无细胞上清液组合物的方法，其包括以下步骤：(a)用一种或多种分离的微生物接种发酵液，其中所述微生物包含曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合；(b)将接种的发酵液孵育至少5小时；以及(c)在步骤(b)之后将所述培养物以10,000×g的离心力离心至少10分钟；从而提供无细胞上清液。

还公开了通过所公开方法制备的无细胞上清液组合物。

虽然本公开的方面可以在特定的法定类别(例如系统法定类别)中描述和要求保护，但这仅是为了方便，本领域的技术人员将会理解，本公开的每个方面可以在任何法定类别中描述和要求保护。除非另有明确说明，否则本文阐述的任何方法或方面绝不意味着要求以特定顺序执行其步骤。因此，如果方法权利要求在权利要求或说明书中没有特别说明将步骤限于特定顺序，则无论如何，在任何方面都不能推断出顺序。这适用于解释的任何可能的非明确基础，包括关于步骤设置或操作流程的逻辑问题，从语法组织或标点符号得出的明显含义，或说明书中描述的方面的数量或类型。

附图简述

并入并构成本说明书的一部分的附图示出了多个方面，并与描述一起用于解释本公开的原理。

图1A和图1B示出了关于所公开的组合物对萌发的影响的代表性数据。图1A示出与用蒸馏水处理的对照种子相比，IN-M1批次EA100510无细胞上清液(CFS)浓度对萌发刺激中的百分比差异的影响。图1B示出了重新绘制的图1A的数据，以显示具有相对于时间的延长影响的CFS稀释度。

图2A和2B示出了关于所公开的组合物对萌发的影响的代表性数据。图2A示出与用蒸馏水处理的对照种子相比，IN-M1批次EA110310发酵液的浓度对萌发刺激中的百分比差异的影响。图2B示出了重新绘制的图2A的数据，以显示具有相对于时间的延长影响的CFS稀释度。

图3A和3B示出了关于在非生物胁迫条件进行的所公开的组合物对萌发的影响的代表性数据。种子在非生物胁迫条件下暴露于100mM NaCl。图3A示出与用蒸馏水处理的对照种子相比，IN-M1批次EA110310发酵液的浓度对萌发刺激中的百分比差异的影响。每组柱下面的数字表示检测到萌发的以小时计的时间。图3B示出了重新绘制的图3A的数据，以显示具有相对于时间的延长影响的CFS稀释度。

图4示出了关于在时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的细菌群落的主成分分析的代表性数据。

图5示出了关于在时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的细菌群落的峰强度谱(intensity profile)的代表性数据。

图6示出了关于在时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的真菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图7示出了关于在生长一个月后IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的细菌群落的主成分分析的代表性数据。每批储存在4℃、25℃、-80℃(对照)和室温下。

图8示出了关于在4℃、25℃、-80℃(对照)和室温下生长一个月后IN-M1(A)中存在的细菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图9示出了关于在4℃、25℃、-80℃(对照)和室温下生长一个月后IN-M2(B)中存在的细菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图10示出了关于在4℃、25℃、-80℃(对照)和室温下生长一个月后IN-M1(A)中存在的真菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图11示出了关于在4℃、25℃、-80℃(对照)和室温下生长一个月后IN-M2(B)中存在的真菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图12示出了关于芝麻菜活力量表的代表性数据，所述量表被用作测量植物生长和叶体积的视觉方式。

图13示出了关于试验1中用IN-M1(A)和IN-M2(B)处理的芝麻菜的活力(13A)、植物数(13B)、叶绿素含量(13C)、芽干重(13D)、根干重(13E)和植物长度(16F)的代表性数据。

图14示出了用于试验2中用IN-M1(A)和IN-M2(B)处理的芝麻菜的活力(14A)、植物数(14B)、叶绿素含量(14C)、芽干重(14D)、根干重(14E)和植物长度(14F)的代表性数据。

图15示出了关于在两个时间点取样的时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的细菌群落的主成分分析的代表性数据。

图16示出了关于在两个时间点取样的时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的细菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图17示出了关于时间零点时IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的真菌群落的主成分分析的代表性数据。

图18示出了关于使用ITSI-F的IN-M1(A)和IN-M2(B)中存在的真菌群落的峰强度谱的代表性数据。

图19示出了关于不含微生物的液体产品的各种稀释度对最佳条件下的大豆种子萌发的影响的代表性数据。

图20示出了关于不含微生物的液体产物的各种稀释度对盐胁迫条件下大豆种子萌发的影响的代表性数据。

图21示出了关于IN-M1的各种稀释度对最佳条件下的大豆种子萌发的影响的代表性数据。

图22示出了关于IN-M1的各种稀释度对盐胁迫条件下的大豆种子萌发的影响的代表性数据。

图23示出了关于IN-M1对在标准花园土壤中生长的剪股颖(Agrostide)(本特草(bent grass))的影响的代表性数据。

图24示出了关于IN-M1对具有混合在土壤中的额外有机物质施肥的花园土壤中生长的剪股颖(本特草)的影响的代表性数据。

图25示出了关于IN-M1对在标准花园土壤中生长的草地早熟禾(Poa parturin)的影响的代表性数据。

图26示出了关于IN-M1对播种后40天的唐莴苣(Swiss Chard)的影响的代表性照片。

图27示出了草莓植物的代表性叶绿素含量。柱和误差棒分别示出叶绿素的平均值和标准偏差。

图27示出了草莓植物的代表性叶绿素含量。数据由与对照植物相比如实施例所述用IN-M1无细胞上清液处理的草莓植物获得。柱和误差棒分别示出叶绿素的平均值和标准偏差。

图28A和28B分别表示与对照植物相比如实施例所述用IN-M1无细胞上清液处理的草莓植物的叶高度和宽度。柱和误差棒分别示出了叶高度和宽度的平均值和标准偏差。****＝具有99.99％置信水平的统计学显著性(P＜0.0001)。

图29示出了在种植后第11周至第19周的草莓植物中果实产量的代表性数据。示出了与对照植物相比，如实施例中所述用IN-M1无细胞上清液处理的草莓植物的数据。示出了果实收获当天的产量数据；从第11周开始，每两天收获一次果实。

图30示出了与对照植物相比，如实施例中所述用IN-M1无细胞上清液处理的草莓植物中总果实产量的代表性数据。

图31示出了与对照植物相比，用IN-M1无细胞上清液处理的玉米植物中叶片进展发育的田间试验的代表性数据。

图32A-32E示出了关于所公开的组合物对萌发的影响的代表性数据。种子类型如每幅图上方所示。“A”表示IN-M1无细胞上清液，且“B”表示IN-M2无细胞上清液。无细胞上清液的稀释度如每个柱下方所示。

图33A-33D示出了关于所公开的组合物对萌发的影响的代表性数据。种子类型如每幅图上方所示。“A”表示IN-M1无细胞上清液，且“B”表示IN-M2无细胞上清液。无细胞上清液的稀释度如每个柱下方所示。

本公开的另外的优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过本公开的实践来了解。本发明的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，上述一般描述和以下详细描述仅仅是示例性和解释性的并不是对所要求保护的公开内容的限制。

详述

通过参考以下本公开的以下详述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本公开。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料可用在本公开的实践或测试中，但是现在描述示例性方法和材料。

本文使用的术语仅用于描述特定方面，而不是限制性的。在本说明书和以下权利要求中，将提及若干定义为具有以下含义的术语：

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”及“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“农学上可接受的载体”包括两种或更多种这样的载体的混合物，等等。

本文所用的词语“或”是指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

范围可以在本文中表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一具体值。当表示这样的范围时，另一个方面包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当通过使用前面的“约”将值表示为近似值时，应理解，具体值形成了另一个方面。还应进一步理解，每个范围的端点在相对于另一端点和独立于另一端点时都是有意义的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值除了所述值本身之外，还在本文中公开了“约”所述具体值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，当公开一个值时，则还公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员所适当理解的。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于等于10”以及“大于等于10”。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据代表终点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点15，则应当理解，认为还公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15以及10和15之间。还应当理解，还公开了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开10和15，则还公开了11、12、13和14。

“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况以及不发生的情况。

如本文所用，术语“葡萄糖酸内酯”旨在包括以下葡萄糖酸内酯结构的所有异构体、溶剂合物、水合物，多晶型、结晶形式、非结晶形式和盐变体：

如本文所用，术语“异构体”旨在包括本文提及的化合物和/或分子(例如葡萄糖酸内酯、LCO、CO、壳多糖化合物、类黄酮、茉莉酸或其衍生物、亚油酸其衍生物、亚麻酸或其衍生物、kerrikins等)的所有立体异构体，包括对映体、非对映体以及所有构象异构体、旋转异构体和互变异构体，除非另有说明。本文公开的化合物和/或分子包括基本上纯左旋或右旋形式的对映体，或外消旋混合物，或任何比例的对映体。当方面公开(D)-对映体时，该方面还包括(L)-对映体；当方面公开(L)-对映体时，该方面还包括(D)-对映体。方面公开(+)-对映体时，该方面还包括(-)-对映体；当方面公开了(-)-对映体时，该方面还包括(+)-对映体。当方面公开(S)-对映体时，该方面还包括(R)-对映体；当方面公开(R)-对映体时，该方面还包括(S)-对映体。方面旨在包括非对映体纯形式和所有比例的混合物形式的本文所述的化合物和/或分子的任何非对映体。除非在化学结构或化学名称中明确指出立体化学，否则化学结构或化学名称旨在涵盖所描述的化合物和/或分子的所有可能的立体异构体、构象异构体、旋转异构体和互变异构体。

如本文所用，术语“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”意指引起增强的植物生长的生物刺激剂组合物的量、浓度或剂量。为绝对值的实际有效剂量取决于包括但不限于用于施用生物刺激剂组合物的土地的尺寸(例如面积、总面积等)的因素。生物刺激剂组合物的“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”可以例如通过常规剂量反应实验确定。

如本文所用，术语“载体”旨在包括“农学上可接受的载体”。“农学上可接受的载体”意指可用于向植物、植物部分(例如，种子)或土壤递送单独的或与一种或多种农业有益成分和/或生物活性成分等组合的本文所述的生物刺激剂组合物的任何材料，优选地载体可以添加(至植物、植物部分(例如，种子)或土壤)而不会对植物生长、土壤结构、土壤排水等产生不利影响。

如本文所用，术语“种子相容性载体”意指可用于递送单独的或与一种或多种农业有益成分和/或生物活性成分等组合的本文所述的生物刺激剂组合物的任何材料，其可以添加或施用于种子而不会对种子、从种子生长的植物、种子萌发等产生/具有不利影响。

如本文所用，术语“土壤相容性载体”意指可用于递送单独的或与一种或多种农业有益成分和/或生物活性成分等组合的本文所述的生物刺激剂组合物的任何材料，其可以添加或施用于土壤而不会对植物生长、土壤结构、土壤排水等产生/具有不利影响。

如本文所用，术语“叶相容性载体”意指可用于递送单独的或与一种或多种农业有益成分和/或生物活性成分等组合的本文所述的生物刺激剂组合物的任何材料，其可以添加至植物或植物部分而不会对植物、植物部分、植物生长、植物健康等产生/具有不利影响。

如本文所用，术语“微量营养素”意指有利于植物生长、植物健康和/或植物发育的营养物质。

如本文所用，术语“除草剂”意指能够杀死植物(例如，杂草)和/或抑制杂草生长(抑制在某些条件下是可逆的)的任何试剂或试剂的组合。

如本文所用，术语“杀真菌剂”意指能够杀死真菌和/或抑制真菌生长的任何试剂或试剂的组合。

如本文所用，术语“杀虫剂”意指能够杀死一种或多种昆虫和/或抑制一种或多种昆虫生长的任何试剂或试剂的组合。

如本文所用，术语“农业有益成分”意指能够一般地在植物生长、生产、土壤、水和植物农业中引起或提供有益和/或有用效果的任何试剂或试剂的组合。

如本文所用，“生物活性成分”意指除了本文所述的一种或多种细菌分离株以外的生物活性成分(例如，信号分子、其他微生物等)。

如本文所用，术语“确定”可以指测量或确定活动的量或数量或变化。例如，如本文所用，确定本文所述微生物或生长培养物的特征可以指将被技术人员用来测量或确定样品中的一些可量化值的步骤。本领域熟悉测量样品中的特征的方法。术语样品以其常见含义使用，为来自较大溶液、来自部位、来自培养物或其他较大实体的部分，部分(样品)可以从所述较大实体取得并任选地作用。

如本文所用，术语“生物刺激”是指植物和/或土壤中代谢和/或生理过程的增强。在特定情况下，生物刺激是指刺激植物(例如，施用生物刺激剂的植物)的生长的过程。

如本文所用，术语“生物刺激剂”意指能够增强植物和土壤中的代谢或生理过程的任何组合物。除非另有明确说明，否则生物刺激剂可以由单一成分或多种不同成分的组合组成，并且增强的植物代谢和/或生理过程可归因于独立地或组合地起作用的一种或多种成分。

如本文所用，术语“环境”是由情况定义的区域，包括生物要素和非生物要素，以及在所定义区域中发现的生物要素之间以及生物要素和非生物要素之间的相互关系的模式。所有三种物理状态固体、液体和气体都包含在构成环境的要素中。

如本文所用，术语“微生物”包括但不限于细菌、病毒、真菌、藻类、酵母、原生动物、蠕虫、螺旋体、单细胞生物体和多细胞生物体，其包括在分类模式如原核生物、真核生物、古细菌(Archea)和细菌以及本领域技术人员已知的那些中。

如本文所用，术语“增强的植物生长”意指增加的植物产量(例如，增加的生物量、增加的果实数量或其组合，如通过常用的农业测量所测量的，例如每英亩的蒲式耳)、增加的根数、增加的根质量、增加的根体积、增加的叶面积、增加的植株密度、增加的植物活力或其组合。

如本文所用，术语“植物”和“植物部分”意指所有植物和植物种群，例如期望和不期望的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是可以通过常规植物育种和优化方法或通过生物技术和基因工程方法或这些方法的组合获得的植物，包括转基因植物，并且包括可被植物育种者权利保护或不可保护的植物品种。植物部分应理解为意指植物地上和地下的所有部分和器官，如种子、芽、叶、花和根，可能提到的实例是叶、针、茎、花、子实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括收获的材料以及营养和生殖繁殖材料(例如，插条、块茎、根状茎、芽和种子等)。

如本文所用，术语“微生物”或“微生物的”涵盖可以在实验室中传播和操作的任何通常单细胞生物体。在本公开中，该术语优选涉及细菌和/或酵母和/或真菌。在本公开中，术语微生物通常表示活微生物，即能够繁殖和/或具有代谢活性。

如本文所用，术语“菌株(strain)”通常指相同物种的生物体的闭锁种群。因此，术语“乳酸菌的菌株”通常是指乳酸菌物种的菌株。更特别地，术语“菌株”是指微生物物种的成员，其中这些成员(即菌株)具有不同的基因型和/或表型。本文中，术语“基因型”包括微生物的基因组和重组DNA含量。在本文中，术语“表型”是指依赖于微生物的遗传组成的可观察到的物理特性。如本领域技术人员将认识到的，微生物菌株因此由具有共同基因型和/或表型的个体微生物细胞组成。此外，个体微生物细胞可以具有可以将其鉴定为属于其特定菌株的特定特征(例如，特异性rep-PCR模式)。微生物菌株可以包含微生物的一个或多个分离株。

如本文所用，术语“接种物”意指能够在培养基中繁殖的任何形式的微生物细胞或孢子。

术语“微生物组合物或培养物”意指本文公开的微生物的组合物，并用在本文所述的方法中。通过用本文公开的微生物接种培养基并允许微生物生长、繁殖等确定的时间段来制备微生物培养物或微生物组合物。本文公开和要求保护的无细胞上清液组合物是通过从微生物培养物或微生物组合物中除去微生物而得到或产生。

如本文所用，术语“分离株”是指从原代分离板获取的单个菌落生长的培养的微生物。假定分离株来源于单个微生物。

如本文所用，术语“分离的”应用于微生物是指已经从其天然存在的环境中移除和/或纯化的微生物。因此，本文所用的微生物的“分离的菌株”是从其天然环境中移除和/或纯化的菌株。因此，“分离的微生物”不包括驻留在其天然存在的环境中的微生物。此外，术语“分离的”不一定反映微生物已被纯化的程度。应注意，与通常未在自然界中发现的其他菌株或化合物或材料结合的菌株也定义为“分离的”。

如本文所用，术语“基本上纯的培养物”是指基本上不含有微生物的期望菌株以外的其他微生物的菌株或培养物。换句话说，微生物菌株的基本上纯的培养物基本上不含其他污染物，所述其他污染物可以包括微生物污染物以及不期望的化学污染物。

如本文所用，术语“生物学上纯的培养物”意指基本上不含生物污染物并具有遗传均一性的培养物，使得从其中获得的不同的续代培养物将显示基本上相同的基因型和表型(例如，培养物的纯度至少为60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、直到100％)。此外，如本文所用，“生物学上纯的”菌株意指与在自然界中其通常结合的材料分离的菌株。

如本文所用，“培养基”定义为支持微生物细胞生长的混合物，该混合物可以包含但不限于成分如碳水化合物或细胞能源、氨基酸来源、蛋白胨、大豆蛋白胨和酵母提取物粉末。培养基的一个方面是其支持本公开的分离的微生物生长的能力。

在整个申请中，引用了多个出版物。这些出版物的公开内容整体通过引用并入本申请中，以更充分地描述这些本发明所属领域的技术状态。在依赖于参考文献的句子中讨论的包含在参考文献的材料，公开的参考文献也单独和特别地通过引用并入本文。本文所讨论的出版物仅仅是为了提供在本申请的申请日之前的其公开内容。本文中没有内容可以解释为承认本公开不具有凭借在公开的而早于这样的出版物的权利。此外，本文提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立确认。

组合物

在一个方面，本文称为无细胞上清液组合物的所公开组合物包含用一种或多种分离的微生物接种的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包含曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合。在一个方面，通过所公开方法制备无细胞上清液组合物。

一种组合物，其包含用一种或多种分离的微生物接种的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包含曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合。一种组合物，其包含用混合培养物IN-M1接种的微生物培养物的无细胞上清液，IN-M1的ATCC专利保藏号为PTA-12383。一种组合物，其包含用混合培养物IN-M2接种的微生物培养物的无细胞上清液，IN-M2根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-M2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121556。本文公开的组合物，其中无细胞上清液是过滤灭菌的。公开的无细胞上清液组合物，其还包含除草剂。公开的无细胞上清液组合物，其还包含杀虫剂。公开的无细胞上清液组合物，其还包含杀真菌剂。公开的无细胞上清液组合物，其还包含液体营养液。无细胞上清液组合物，其包含IN-M1和/或INM2，还包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、液体营养液或其组合。

公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述曲霉属是米曲霉(Aspergillus oryzae)，或其中所述曲霉属是米曲霉IN-AO1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-AO1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121551。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或其中所述芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌IN-BS1，ATCC专利保藏号PTA-12385。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，或其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP1，保藏号PTA-12387。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述假丝酵母属是产朊假丝酵母(Candida utilis)，或其中所述假丝酵母属是产朊假丝酵母IN-CU1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-CU1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121550。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobaccillusrhamnosus)或植物乳杆菌(Lactobacillus planterum)或其组合。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是瑞士乳杆菌IN-LH1，ATCC专利保藏号PTA-12386。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是干酪乳杆菌，在本文称为IN-LC1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LC1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121549。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是乳酸乳杆菌，在本文称为IN-LL1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LL1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121552。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是植物乳杆菌IN-LP1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LP1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121555。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述乳杆菌属是鼠李糖乳杆菌IN-LR1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LR1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121554。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述假单胞菌属是绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP1，ATCC专利保藏号PTA-12383。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP2，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-RP2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121553。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述酵母属是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述酵母属是酿酒酵母IN-SC1，ATCC专利保藏号PTA-12384。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中所述链球菌属是乳链球菌(Streptococcus lactis)。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其还包含至少一种分离的菌根真菌(micorrhyzal fungus)。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中用来自曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属中的至少两种接种微生物培养物。公开的来自微生物培养物的无细胞上清液组合物，其中用米曲霉、枯草芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母接种微生物培养物。

在一个方面，无细胞上清液组合物是过滤灭菌的。在一个方面，无细胞上清液组合物还可以包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、液体营养组合物或可有助于期望植物生长或抑制不期望植物、昆虫、线虫或其他植物害虫生长的其他化合物或组合物。

在各个方面，无细胞上清液组合物可以是呈液体、凝胶、浆体、固体或粉末(可湿性粉末或干粉)的形式。在另外的方面，无细胞上清液组合物可以是呈种子包衣的形式。液体、浆体或粉末(例如可湿性粉末)形式的组合物可适用于涂覆种子。当用于涂覆种子时，可将无细胞上清液组合物施用于种子并使其干燥。在各个方面，无细胞上清液组合物可以配制成粉末(例如可湿性粉末)，可以在施用到种子之前将液体(例如，水)加入到粉末中。

除本文所述的一种或多种葡萄糖酸内酯之外，本文公开的无细胞上清液组合物可任选地包含本文所述的一种或多种生物活性成分。生物活性成分的非限制性实例包括植物信号分子(例如，脂壳寡糖(LCO)、壳寡糖(CO)、壳多糖化合物、类黄酮、茉莉酸或其衍生物、亚油酸或其衍生物、亚麻酸或其衍生物、kerrikins等)和一种多种有益微生物(例如，根瘤菌属(Rhizobium spp.)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium spp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium spp.)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium spp.)、球囊霉属(Glomus spp.)、巨孢囊霉属(Gigaspora spp.)、Hymenoscyphous spp.、树粉孢属(Oidiodendron spp.)、蜡蘑属(Laccaria spp.)、豆马勃属(Pisolithus spp.)、须腹菌属(Rhizopogon spp.)、硬皮马勃属(Scleroderma spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、不动杆菌属(Acinetobacterspp.)、节杆菌属(Arthrobacter spp)、节丛孢属(Arthrobotrys spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、固氮螺菌属(Azospirillum spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、华丽单胞菌属(Chryseomonas spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、正青霉菌(Eupenicillium spp.)、微小杆菌属(Exiguobacterium spp.)、克雷伯菌属(Klebsiella spp.)、克吕沃尔菌属(Kluyvera spp.)、微杆菌属(Microbacterium spp.)、毛霉菌属(Mucor spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.)、青霉菌属(Penicilliumspp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、链孢子囊菌属(Streptosporangium spp.)、Swaminathania spp.、硫杆菌属(Thiobacillus spp.)、有孢圆酵母属(Torulospora spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、黄色杆菌属(Xanthobacter spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)等。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含液体营养液。如本文所用，术语“液体营养液”是指含有营养素的液体，包括但不限于溶液或混合物中的能源分子(例如葡萄糖)、氨基酸、维生素、矿物质、用于植物代谢的辅因子。液体营养液旨在包括使植物生长的任何液体，包括含氧水或充气水混合物，其可以含有或不包含添加的营养素。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含一种或多种有益的微量营养素。用于本文所述组合物的微量营养素的非限制性实例包括维生素(例如维生素A、维生素B复合物(即维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B8、维生素B9、维生素B12、胆碱)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄素、叶黄素、番茄红素、玉米黄质等)、大量矿物质(如磷、钙、镁、钾、钠、铁等)、微量矿物质(如硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒、锌等)、有机酸(乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、牛磺酸等)及其组合。在一个方面，组合物可以包含磷、硼、氯、铜、铁、锰、钼、锌或其组合。

在某些方面，其中本文所述的组合物可以包含磷，预期可以提供任何合适的磷源。在一个方面，磷可以来源于来源。在另一个方面，磷的合适来源包括能够被一种或多种微生物(例如，青霉菌等)增溶的磷源。在一个方面，磷可以来源于磷酸岩来源。在另一个方面，磷可以来源于包含一种或多种磷源的肥料。市售的磷肥种类繁多。一些常见的是含有磷酸岩、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三重过磷酸盐和/或多磷酸铵的那些。所有这些肥料都是通过大规模肥料生产设施中不溶性天然磷酸岩的化学处理生产的，产品价格昂贵。通过本公开，可以减少施用于土壤的这些肥料的量，同时仍然保持从土壤吸收相同量的磷。

在另一个方面，磷可以来源于有机磷源。在另一特定方面，磷源可以包括有机肥料。有机肥料是指来源于天然来源的土壤改良剂，其提供至少一定百分比的氮、磷酸盐和/或钾碱。有机肥料的非限制性实例包括植物和动物副产物、岩石粉末、海藻、接种物和调理剂。这些通常在园艺中心和园艺供应公司提供。磷源可以来自骨粉、肉粉、动物粪肥、堆肥、污水污泥或鸟粪或其组合。

在一个方面，磷可以来源于磷源的组合，包括但不限于磷酸岩，包含一种或多种磷源(例如，磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钙、过磷酸盐、三重过磷酸盐、多磷酸铵等)、一种或多种有机磷源及其组合的肥料。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含一种或多种有益的生物刺激剂。生物刺激剂可以增强代谢或生理过程，例如呼吸作用、光合作用、核酸摄取、离子摄取、营养物质输送或其组合。生物刺激剂的非限制性实例包括海藻提取物(例如，岩衣藻(ascophyllumnodosum))、腐殖酸(例如腐殖酸钾)、富里酸、肌醇、甘氨酸及其组合。在一个方面，组合物可以包含海藻提取物、腐殖酸、富里酸、肌醇、甘氨酸或其组合。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含一种或多种植物信号分子。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种LCO。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种CO。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种壳多糖化合物。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种类黄酮或其衍生物。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种非类黄酮nod基因诱导剂(例如茉莉酸、亚油酸、亚麻酸及其衍生物)。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种kerrikins或其衍生物。在一个方面，一种或多种植物信号分子是一种或多种LCO、一种或多种CO、一种或多种壳多糖化合物、一种或多种类黄酮及其衍生物、一种或多种非类黄酮nod基因诱导剂及其衍生物、一种或更多的kerrikins及其衍生物或其任何信号分子组合。

脂壳寡糖化合物(LCO)也称为共生Nod信号或Nod因子，由具有在非还原末端稠合的N-连接的脂肪酰基链的β-I，4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺(“GlcNAc”)残基的寡糖主链组成。LCO在骨架中的GlcNAc残基的数目、脂肪酰基链的长度和饱和度以及还原和非还原性糖残基的取代方面不同。LCO旨在包括所有LCO以及其异构体、盐和溶剂合物。可以从细菌获得(分离和/或纯化)LCO，例如根瘤菌，例如根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属和固氮根瘤菌属。LCO结构是每种这样的细菌物种的特征，并且每种菌株可以产生具有不同结构的多种LCO。

来自大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的LCO描述于美国专利No.5,175,149和5,321,011中。广泛地，它们是包含甲基岩藻糖的五糖类植物激素。描述了多种这些大豆慢生根瘤菌衍生的LCO：BjNod-V(C18：1)；BjNod-V(AC，C18：1)、BjNod-V(C16：1)；和BjNod-V(AC，C16：0)，“V”表示存在五个N-乙酰葡糖胺；“Ac”乙酰化；“C”之后的数字表示脂肪酸侧链中的碳数；以及“：”之后的数字是双键数。

可以从产生LCO的细菌菌株获得(即，分离和/或纯化)本公开组合物中使用的LCO，例如固氮根瘤菌属、慢生根瘤菌属(包括大豆慢生根瘤菌)、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属(包括豌豆根瘤菌(R.leguminosarum))、中华根瘤菌属(包括苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti))的菌株，和经基因工程以产生LCO的细菌菌株。

本公开还包括使用从菌根真菌(例如球囊菌门(Glomerocycota)的真菌，例如丛枝菌根真菌(Glomus intraradicus))获得的LCO的组合物。从这些真菌获得的代表性LCO的结构描述于WO 2010/049751和WO 2010/049751(其中所述的LCO也称为“Myc因子”)。

本公开的组合物可以包含合成LCO化合物，例如WO 2005/063784中描述的那些，以及通过基因工程产生的重组LCO。基本的天然存在的LCO结构可能包含在天然存在的LCO中发现的修饰或取代，例如在Spaink，Crit.Rev.Plant Sci.54：257-288(2000)和D′Haeze等人，Glycobiology 12：79R-105R(2002)中描述的那些。用于构建LCO的前体寡糖分子(CO，其如下所述也可用作本公开中的植物信号分子)也可以通过基因工程生物体合成，例如，如Samain等人，Carb.Res.302：35-42(1997)；Samain等人，J.Biotechnol.72：33-47(1999)。

LCO可以以各种形式的纯度使用，并且可以单独使用或以产生LCO的细菌或真菌的培养物的形式使用。提供基本上纯的LCO的方法包括从LCO和微生物细胞的混合物中除去微生物细胞，或进一步的步骤，通过LCO溶剂相分离，然后通过HPLC色谱法分离和纯化LCO分子，如例如美国专利No.549,718中所述。可以通过重复的HPLC增强纯化，并且可以将纯化的LCO分子冷冻干燥以进行长期储存。

壳寡糖(CO)在本领域中已知为β-1-4连接的N-酰氨基葡糖胺结构，被鉴定为壳多糖寡聚物，也称为N-乙酰壳寡糖。CO具有独特且不同的侧链装饰，使其与壳多糖分子[(C8H13NO5)n，CAS No.1398-61-4]和壳聚糖分子[(C5H1NO4)n，CAS No.9012-76-4]不同。描述CO的结构和产生的代表性文献如下：Van der Hoist等人，Current Opinion inStructural Biology，11：608-616(2001)；Robina等人，Tetrahedron 58：521-530(2002)；Hanel等人，Planta 232：787-806(2010)；Rouge等人，第27章，“The Molecular Immunologyof Complex Carbohydrates”，Advances in Experimental Medicine and Biology，Springer Science；Wan等人，Plant Cell 21：1053-69(2009)；PCT/F100/00803(2000年9月21日)；和Demont-Caulet等人，Plant Physiol.120(l)：83-92(1999)。CO可以是合成的或重组的。制备重组CO的方法是本领域中已知的。参见，例如Samain等人(同上)；Cottaz等人，Meth.Eng.7(4)：311-7(2005)以及Samain等人，J.Biotechnol.72：33-47(1999)。CO旨在包括其异构体、盐和溶剂合物。

作为真菌细胞壁以及昆虫和甲壳类动物的外骨骼的主要成分的壳多糖和壳聚糖也由GlcNAc残基组成。壳多糖化合物包括壳多糖(IUPAC：N-[5-[[3-乙酰基氨基-4，5-二羟基-6-(羟甲基)噁烷-2基]甲氧基甲基]-2-[[5-乙酰基氨基-4，6-二羟基-2-(羟甲基)噁烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟甲基)噁烷-3-基]乙酰胺)、壳聚糖、(IUPAC：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4，6-二羟基-2(羟甲基)噁烷-3-基]氧基-4-羟基-2-(羟甲基)噁烷-3-基]氧基-2(羟甲基)噁烷-3，4-二醇)，及其异构体、盐和溶剂合物。

这些化合物可以商购获得，例如从Sigma-Aldrich获得，或由昆虫、甲壳类壳或真菌细胞壁制备。用于制备壳多糖和壳聚糖的方法是本领域已知的，并且已经描述于例如美国专利No.4,536,207(由甲壳类贝壳的制备)，Pochanavanich等人，Lett.Appl.Microbiol.35：17-21(2002)(由真菌细胞壁制备)和美国专利No.5,965,545(由螃蟹壳制备和市售壳聚糖水解)。可以获得脱乙酰化的壳多糖和壳聚糖，其范围从小于35％到大于90％的脱乙酰化，并且覆盖大范围的分子量，例如小于15kD的低分子量壳聚糖寡聚物和0.5至2kD的壳多糖寡聚物；分子量约15kD的“实用级”壳聚糖；和高达70kD的高分子量壳聚糖。配制用于种子处理的壳多糖和壳聚糖组合物也可商购。商业产品包括例如(Plant Defense Boosters，Inc.)和BEYOND^TM(Agrihouse，Inc.)。

类黄酮是具有通过三碳桥连接的两个芳环的一般结构的酚类化合物。类黄酮由植物产生并具有许多功能，例如作为有益的信号分子，以及作为对昆虫、动物、真菌和细菌防治。类黄酮种类包括查尔酮、花青素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮和异黄酮。参见Jain等人，J.Plant Biochem.&Biotechnol.11：1-10(2002)；Shaw等人，EnvironmentalMicrobiol.11：1867-80(2006)。

可用于本公开的组合物中的代表性类黄酮包括木犀草素、芹菜素、柑橘黄酮、槲皮素、山萘酚、杨梅黄酮、漆黄素、异鼠李素、藿香黄酮醇(pachypodol)、鼠李金、橙皮素、柚皮素、芒柄花黄素、圣草酚、高圣草酚、花旗松素、二氢槲皮素、二氢山萘酚、染料木素、黄豆苷原、大豆黄素、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素3-没食子酸酯、没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-没食子酸酯、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、氰化、翠雀花素、锦葵色素、花葵素、芍药花青素、矮牵牛素或其衍生物。类黄酮化合物可商购，例如，来自Natland International Corp.，Research Triangle Park，N.C.；MPBiomedicals，Irvine，Calif.；LC Laboratories，Wobum Mass。类黄酮化合物可以从植物或种子中分离出来，例如如美国专利No.5,702,752、5,990,291和6,146,668中所述。类黄酮化合物也可以通过基因工程生物如酵母产生，如Ralston等人，Plant Physiology 137：1375-88(2005)中所述。类黄酮化合物旨在包括所有类黄酮化合物及其异构体、盐和溶剂合物。

茉莉酸(JA，[1R-[1α，2β(Z)]]-3-氧代2-(戊烯基)环戊烷乙酸)及其衍生物、亚油酸((Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸)及其衍生物和亚麻酸((Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸)及其衍生物也可用于本文所述的组合物中。非类黄酮nod基因诱导剂旨在不仅包括本文所述的非类黄酮nod基因诱导剂，而且包括其异构体、盐和溶剂合物。

茉莉酸及其甲酯茉莉酸甲酯(MeJA)统称为茉莉酮酸酯(jasmonate)，是在植物中天然存在的基于十八碳酸(octadecanoid)的化合物。茉莉酸由小麦幼苗的根和真菌微生物如可可球二孢菌(Botryodiplodia fulibromae)和赤霉菌(Gibbrellafujikuroi)、酵母(酿酒酵母)以及大肠杆菌的致病和非致病菌株产生。在茉莉酸生物合成过程中产生亚油酸和亚麻酸。茉莉酮酸酯、亚油酸和亚油酸(及其衍生物)据报道是根际细菌的nod基因表达或LCO产生的诱导物。参见，例如Mabood，Fazli，Jasmonates induce the expression of nodgenes in Bradyrhizobium japonicum，2001年5月17日；以及Mabood，Fazli，“Linoleicand linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobiumjaponicum，”USDA 3，2001年5月17日。

可用于添加到无细胞上清液组合物中的亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的有用衍生物包括酯、酰胺、糖苷和盐。代表性的酯是其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基已被-COR基团替代的化合物，其中R为-OR1基团，其中R1为：烷基，例如C1-C8非支链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8非支链或支链烯基；炔基，例如C2-C8非支链或支链炔基；具有例如6至10个碳原子的芳基；或具有例如4至9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。代表性的酰胺是其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基被-COR基团替代的化合物，其中R为NR2R3基团，其中R2和R3独立地为：氢；烷基，例如C1-C8非支链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8非支链或支链烯基；炔基，例如C2-C8非支链或支链炔基；具有例如6至10个碳原子的芳基；或具有例如4至9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。酯可以通过已知方法制备，例如酸催化的亲核加成，其中羧酸在催化量的无机酸存在下与醇反应。酰胺也可以通过已知的方法制备，例如通过在中性条件下在偶联剂如二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下使羧酸与适当的胺反应。亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的合适的盐包括例如碱加成盐。可用作制备这些化合物的代谢可接受的碱盐的试剂的碱包括衍生自阳离子如碱金属阳离子(如钾和钠)和碱土金属阳离子(如钙和镁)的那些碱。这些盐可以通过将亚油酸、亚麻酸或茉莉酸与碱的溶液混合容易地制备。盐可以从溶液中沉淀出来，并通过过滤收集，或者可以通过其他方法如通过蒸发溶剂回收。

Karrikins是插烯(vinylogous)4H-吡喃酮，例如2H-呋喃并[2，3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和类似物。旨在包括其异构体、盐和溶剂合物。

在一个方面，无细胞上清液组合物还可包含一种或多种葡萄糖酸内酯。所述一种或多种葡萄糖酸内酯可以是天然葡萄糖酸内酯(即，非合成产生的)、合成葡萄糖酸内酯(例如，化学合成葡萄糖酸内酯)或其组合。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含除草剂。示例性除草剂包括但不限于咪唑啉酮、磺酰脲、草甘膦、草铵膦、L-膦丝菌素、三嗪、苄腈、麦草畏(3，6-二氯邻茴香酸或3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)，除草剂如BANVEL^TM(BASF)、CLARITY^TM(BASF)和VANQUISH^TM(Syngenta)的活性成分，除虫菊酯和合成除虫菊酯；唑类，噁二嗪衍生物；氯烟碱；硝基胍衍生物；三唑；有机磷酸酯；吡咯；吡唑；苯基吡唑；二酰肼；和氨基甲酸酯。上文所列类别中的一些除草剂可在The Pesticide Manual，第12版，C.D.S.Tomlin编辑，British CropProtection Council，Farnham，Surry，UK(2000)中找到。

在一个方面，无细胞上清液组合物可包含杀虫剂。示例性的杀虫剂包括但不限于任何细菌物种(即，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))、病毒(即，浓病毒属(densoviruses))、生物防治杀虫剂、阿维菌素、磷化铝(phostoxin)/烟毒素(fumitoxin)、联苯菊酯、甲萘威、溴虫腈(chlorfenapyr)、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、敌敌畏(dichlorvos)、D-苯醚菊酯、D-反式烯丙菊酯、苄呋菊酯、灭多威(methomyl)、氟蚁腙、苯氧威、氟虫腈、吡虫啉、吡虫啉、λ-三氯氟氰菊酯、马拉硫磷、甲氧普林、二溴磷、硝虫噻嗪(nithiazine)、对二氯苯、苄氯菊酯、苄氯菊酯-增效醚、胺丙畏(propetamphos)、残杀威(propoxur)、除虫菊酯、苯醚菊酯、烯丙菊酯、烯虫乙酯(hydroprene)、苄呋菊酯(resmethrin)、多杀菌素、sumthrin、sumthrin-增效醚、替美磷(temephos)、杀幼蚊剂或其任何组合。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含杀真菌剂。示例性杀真菌剂包括但不限于精甲霜灵和咯菌腈(Mefenoxam&Fludioxonil)(ApronMaxx RTA，Syngenta USA)、戊唑醇、硅氟唑(simeconazole)、氟喹唑(fluquinconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、4，5-二甲基-N-(2-丙烯基)-2-(三甲基甲硅烷基)-3-噻吩甲酰胺(硅噻菌胺)、己唑醇(hexaconazole)、乙环唑(etaconazole)、丙环唑(propiconazole)、灭菌唑(triticonazole)、粉唑醇(flutriafol)、氟环唑(epoxiconazole)、腈苯唑(fenbuconazole)、糠菌唑(bromuconazole)、戊菌唑(penconazole)、抑霉唑(imazalil)、四氟醚唑(tetraconazole)、氟硅唑(flusilazole)、叶菌唑(metconazole)、烯唑醇(diniconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、三唑醇(triadimenol)、联苯三唑醇(bitertanol)、pyremethanil、嘧菌环胺(cyprodinil)、十三吗啉(tridemorph)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、嘧菌酯(azoxystrobin)、ZEN90160、拌种咯(fenpiclonil)、苯霜灵(benalaxyl)、呋霜灵(furalaxyl)、甲霜灵(metalaxyl)、R-甲霜灵、甲呋酰胺(orfurace)、噁霜灵(oxadixyl)、萎锈灵(carboxin)、咪鲜胺(prochloraz)、氟菌唑(trifulmizole)、啶斑肟(pyrifenox)、阿拉酸式苯-5-甲基(acibenzolar-5-methyl)、百菌清(chlorothalonil)、霜脲氰(cymoaxnil)、烯酰吗啉(dimethomorph)、噁唑菌酮(famoxadone)、喹氧灵(quinoxyfen)、苯锈啶(fenpropidine)、螺环菌胺(spiroxamine)、唑菌嗪(triazoxide)、BAS50001 F、噁霉灵(hymexazole)、戊菌隆(pencycuron)、咪唑菌酮(fenamidone)、双胍盐和环唑醇(cyproconazole)。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含一种或多种杀虫剂。对本文所述的组合物有用的杀虫剂将适当地显示针对广泛范围的昆虫的活性，包括但不限于金针虫(wireworm)、切根虫(cutworm)、蛴螬(grub)、玉米根虫(corn rootworm)、种蝇(seed cornmaggot)、跳甲(flea beetle)、高粱长蝽(chinch bug)、蚜虫、叶甲(leaf beetle)、椿象及其组合。

适用于本文公开的组合物的商业杀虫剂的非限制性实例包括CRUISER(Syngenta，Wilmington，Del)、GAUCHO和PONCHO(Gustafson，Plano，Tex.)。这些和其他商业杀虫剂中的活性成分包括噻虫嗪、噻虫胺和吡虫啉。商业杀虫剂最适于根据制造商的说明书按照推荐浓度使用。

在各个方面，无细胞上清液组合物包含挥发性脂肪酸。在另一个方面，挥发性脂肪酸包括乙酸、丁酸、异丁酸和丙酸。在各个方面，挥发性脂肪酸浓度可以通过发酵条件(包括培养物中微生物的选择)和/或向无细胞上清液中添加纯化的挥发性脂肪酸来调节，以达到期望浓度。

另一个方面，无细胞上清液中乙酸的浓度为约2000-2400ppm。在另一个方面，无细胞上清液中丁酸的浓度为约1300-1800ppm。在另一个方面，无细胞上清液中异丁酸的浓度为约200-700ppm。在另一个方面，无细胞上清液中丙酸的浓度为约100-1200ppm。

在另一个方面，无细胞上清液中乙酸的浓度为约2000-2400ppm。在另一个方面，无细胞上清液中的丁酸浓度为约1300-1750ppm。在另一个方面，无细胞上清液中异丁酸的浓度为约600-650ppm。在另一个方面，无细胞上清液中丙酸的浓度为约140-1100ppm。

在另一个方面，乙酸、丁酸、异丁酸和丙酸的比例是固定的比例。在另一个方面，该比例是由本文提供的乙酸、丁酸、异丁酸和丙酸的水平确定的比例。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以由包含至少一种分离的菌根真菌的微生物培养物制备。菌根真菌通过增加根部的表面吸收面积，并通过向土壤中释放溶解难捕获营养物质(包括有机氮、磷、铁和其他“紧密结合”的土壤养分)的强大的酶，从而增加植物的营养吸收。这种提取过程在植物营养中是有用的，并且可表明为什么非菌根植物需要高水平的肥料来维持其健康。菌根真菌形成复杂的网络，捕获和吸收营养物质，保护土壤中的营养成分。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含农学上可接受的载体。本文描述的载体可以允许无细胞上清液组合物保持有效(例如，能够增加植物生长)。包含载体的无细胞上清液组合物的非限制性实例包括液体、凝胶、浆体或固体(包括可湿性粉末或干粉)。载体材料的选择将取决于预期的应用。载体可以是例如土壤相容性载体、种子相容性载体和/或叶相容性载体。在一个方面，载体是土壤相容性载体。在一个方面，载体是种子相容性载体。在一个方面，载体是叶相容性载体。

在一个方面，载体是液体载体。可用作本文公开的组合物的载体的液体的非限制性实例包括水、水溶液或非水溶液。在一个方面，载体是水。在一个方面，载体是水溶液。在一个方面，载体是非水溶液。如果使用液体载体，液体(例如水)载体可以进一步包含生长培养基以培养所述组合物中使用的一种或多种微生物菌株。用于微生物菌株的合适的生长培养基的非限制性实例包括YEM培养基、甘露醇酵母提取物、甘油酵母提取物、Czapek-Dox培养基、马铃薯葡萄糖发酵液或本领域技术人员已知的与可包含在本文所述组合物中的微生物菌株相容和/或向所述微生物菌株提供生长营养物质的任何培养基。

在一个方面，载体是水。在一个方面，将无细胞上清液在水中稀释。在一个方面，将无细胞上清液在水中从无细胞上清液的储备浓度稀释至约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/150或1/200。

在一个方面，本文所述的无细胞上清液组合物可以包含一种或多种聚合物。聚合物在农业产业中的非限制性用途包括农业化学品输送、重金属去除、保水和/或水输送及其组合。Pouci等人，Am.J.Agri.&Biol.Sci.，3(1)：299-314(2008)。在一个方面，一种或多种聚合物是天然聚合物(例如琼脂、淀粉、藻酸盐、果胶、纤维素等)、合成聚合物、可生物降解的聚合物(例如聚己内酯、聚交酯、聚(乙烯醇)等)或其组合。

对于可用于本文所述组合物的聚合物的非限制性列表，参见Pouci等人，Am.J.Agri.&Biol.Sci.，3(1)：299-314(2008)。在一个方面，本文所述的组合物可以包含纤维素、纤维素衍生物、甲基纤维素、甲基纤维素衍生物、淀粉、琼脂、藻酸盐、果胶、聚乙烯吡咯烷酮及其组合。

在一个方面，本文所述的无细胞上清液组合物可包含一种或多种润湿剂。润湿剂通常用于土壤，特别是疏水性土壤，以改善水进入土壤的渗透和/或穿透。润湿剂可以是佐剂、油、表面活性剂、缓冲剂、酸化剂或其组合。在一个方面，润湿剂是表面活性剂。在一个方面，润湿剂是一种或多种非离子表面活性剂、一种或多种阴离子表面活性剂或其组合。在一个方面，润湿剂是一种或多种非离子表面活性剂。

在一个方面，无细胞上清液组合物可以包含表面活性剂。适用于本文所述组合物的表面活性剂可以是非离子表面活性剂(例如，半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子)。表面活性剂可以润湿和乳化土壤和/或污垢。预期所述组合物中使用的表面活性剂对于制剂中所含的任何微生物具有低毒性。进一步预期，所述组合物中使用的表面活性剂具有低植物毒性(即物质或物质的组合对植物的毒性程度)。可以使用单一表面活性剂或多种表面活性剂的共混物。

阴离子表面活性剂或阴离子和非离子表面活性剂的混合物也可用于本文公开的组合物中。阴离子表面活性剂是在水溶液中具有阴离子或带负电荷状态的亲水部分的表面活性剂。本文描述的组合物可以包含一种或多种阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂可以是水溶性阴离子表面活性剂、水不溶性阴离子表面活性剂或水溶性阴离子表面活性剂和水不溶性阴离子表面活性剂的组合。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括磺酸、硫酸酯、羧酸及其盐。水溶性阴离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基酰胺醚硫酸盐、烷基芳基聚醚硫酸盐、烷基芳基硫酸盐、烷基芳基磺酸盐、单酸甘油酯硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基酰胺磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、枯烯磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基二苯醚磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石蜡磺酸盐、木质素磺酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、乙氧基化磺基琥珀酸盐、烷基醚磺基琥珀酸盐、烷基酰胺磺基琥珀酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烷基磺酸乙酸盐、烷基磷酸盐、磷酸酯、烷基醚磷酸盐、酰基硬脂酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基-N-烷基牛磺酸盐、烷基羧酸盐或其组合。

非离子表面活性剂是当溶解或分散在水性介质中时没有电荷的表面活性剂。本文描述的组合物可以包含一种或多种非离子表面活性剂，其用于提供所需的润湿和乳化作用并且不显著抑制孢子稳定性和活性。非离子表面活性剂可以是水溶性非离子表面活性剂、水不溶性非离子表面活性剂或水溶性非离子表面活性剂和水不溶性非离子表面活性剂的组合。

水不溶性非离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基和芳基：甘油醚、乙二醇醚、乙醇胺、环丁砜基酰胺、醇、酰胺、醇乙氧基化物、甘油酯、乙二醇酯、甘油酯和乙二醇酯的乙氧基化物、基于糖的烷基聚糖苷、聚氧乙烯化脂肪酸、链烷醇酰胺缩合物、链烷醇酰胺、叔炔二醇、聚氧乙烯化硫醇、羧酸酯、聚氧乙烯化聚氧丙烯二醇、脱水山梨糖醇脂肪酯或其组合。还包括EO/PO嵌段共聚物(EO是环氧乙烷，PO是环氧丙烷)、EO聚合物和共聚物、聚胺和聚乙烯吡咯烷酮。

水溶性非离子表面活性剂的非限制性实例包括脱水山梨醇脂肪酸醇乙氧基化物和脱水山梨糖醇脂肪酸酯乙氧基化物。

在一个方面，本文所述的组合物包含至少一种或多种非离子表面活性剂。在一个方面，组合物包含至少一种水不溶性非离子表面活性剂和至少一种水溶性非离子表面活性剂。在一个方面，组合物包含具有基本上相同长度的烃链的非离子表面活性剂的组合。

在一个方面，本文所述的组合物可以包含有机硅氧烷表面活性剂，在硅氧烷类和矿物油类消泡剂中用作表面活性剂的硅氧烷类消泡剂。在一个方面，本文所述的组合物可以包含脂肪酸的碱金属盐(例如脂肪酸的水溶性碱金属盐和/或脂肪酸的水不溶性碱金属盐)。

用分离的微生物接种微生物培养物

本公开的无细胞上清液组合物是用一种或多种分离的微生物接种的微生物培养物的无细胞上清液。这些微生物的实例包括但不限于曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、酵母属和链球菌属。本文公开的微生物培养物可以包含这些和其他微生物的不同量和组合，这取决于由具体无细胞上清液组合物进行的方法。

可用于本公开的微生物包括但不限于以下的一种或多种：

微生物

可用于本公开的细菌包括但不限于以下的一种或多种：

细菌

在各个方面，培养以产生本公开的无细胞上清液组合物的微生物可以以大的工业规模量生长。例如，不限于，在1000升批次中生长微生物的方法包括包含50升无硫农业糖蜜、3.75升麦麸、3.75升海藻、3.75升膨润土、1.25升鱼乳液(市售的有机土壤改良剂，来自Nutrivert，Dunham，Quebec非巴氏消毒的)、1.25升大豆粉、675mg市售海盐、50升选择的微生物菌株、高达1000升非氯化温水以形成微生物培养。用于生长微生物的方法还可以包括将糖蜜溶解在一些温水中，将上面列出的其他成分加入到填充槽中，保持温度在30℃，并且在5天内pH降至约3.7之后，每天轻轻搅拌一次并且监测pH值，形成微生物培养物。微生物培养物可孵育2-8周。在孵育确定的时间段之后，将微生物与微生物培养物的液体部分分离，剩余的无细胞液体是本公开的无细胞上清液组合物。无细胞上清液组合物可以例如在室温下装瓶并储存在例如气密容器中或者避光。微生物培养物可以如美国专利申请No.13/979419中所教导的，其全部内容并入本文。

本公开的微生物培养物可以用多个属和/或物种的微生物的组合接种。这些微生物以合作的方式生长和生活，因为一些属或物种可以提供对组合中的其他微生物有益的副产物或合成化合物。例如，微生物培养物可以用需要氧用于代谢活动的需氧微生物和使用其他能源如日光或其他底物的存在的厌氧微生物两者接种。

微生物培养物可以用兼性微生物接种，例如乳杆菌属菌株，其根据环境中的氧和/或营养浓度调节代谢活性。

所有物种的活生物体包括在遗传和生物化学上彼此不同但在物种内正常变异范围内的个体。这些个体的天然变异可能是基因序列中的非破坏性替代或缺失，基因表达或RNA加工的变化和/或肽合成的变化和/或细胞内、膜或分泌分子的细胞加工变化的结果。微生物培养物可以用物种正常变异内或外的微生物接种。可以通过本领域技术人员已知的遗传、分子生物学方法和/或通过生物化学测试的方法来检测这些微生物的身份。

例如，可以用通过分离特定微生物的个体菌落而选择的微生物接种本公开的微生物培养物。通过测试分离的微生物中存在的酶水平和在一组底物中对于特定底物的活性来表征菌落成员，以建立分离的微生物的酶谱。这些底物代表了本公开的组合物中微生物所需的生物化学途径的横截面，以用于一般修复目的，例如植物或动物物质的有机物质的分解，或用于特定修复目的，例如特定化学物质的分解。

在一个方面，微生物培养物包括曲霉属，例如米曲霉。在一个方面，曲霉属是本文称为IN-AO1的米曲霉，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-AO1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121551。

在一个方面，微生物培养物包括芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌。在一个方面，芽孢杆菌属是本文称为IN-BS1的枯草芽孢杆菌，其根据布达佩斯条约于2011年1月12日在帐号200139下保藏于ATCC，ATCC专利保藏号PTA12385。

在一个方面，微生物培养物包含红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌。在一个方面，红假单胞菌属是本文称为IN-RP1的沼泽红假单胞菌，其根据布达佩斯条约于2011年1月12日在帐号200139下保藏于ATCC，ATCC专利保藏号PTA-12387。

在一个方面，微生物培养物包括假丝酵母属，例如产朊假丝酵母。在一个方面假丝酵母属是在本文称为IN-CU1的产朊假丝酵母，根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-CU1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121550。

在一个方面，微生物培养物包含乳杆菌属，例如瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌或其组合。在一个方面，乳杆菌属是瑞士乳杆菌。在一个方面，乳杆菌属是本文称为IN-LH1的瑞士乳杆菌，其根据布达佩斯条约于2011年1月12日在帐号200139下保藏于ATCC，ATCC专利保藏号PTA-12386。在一个方面，微生物培养物包含乳杆菌属，例如植物乳杆菌。在一个方面，乳杆菌属是本文称为IN-LP1的植物乳杆菌，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LP1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121555。在一个方面，微生物培养物包括乳杆菌属，例如鼠李糖乳杆菌。在一个方面，乳杆菌属是本文称为IN-LR1的鼠李糖乳杆菌，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LR1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121554。在一个方面，微生物培养物包含乳杆菌属，例如乳酸乳杆菌。在一个方面，乳杆菌属是本文称为IN-LL1的乳酸乳杆菌，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LL1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121552。在一个方面，微生物培养物包含乳杆菌属，例如干酪乳杆菌。在一个方面，乳杆菌属是本文称为IN-LC1的干酪乳杆菌，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LC1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121549。

在一个方面，微生物培养物包含假单胞菌属，例如绿脓假单胞菌。在一个方面，假单胞菌属是绿脓假单胞菌。

在一个方面，微生物培养物包含红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌。在一个方面，红假单胞菌属是本文称为IN-RP1的沼泽红假单胞菌，其根据布达佩斯条约于2011年1月12日在帐号200139下保藏于ATCC，ATCC专利保藏号PTA-12383。在一个方面，微生物培养物包含红假单胞菌属，例如本文称为本文称为IN-RP2的沼泽红假单胞菌，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-RP2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121553。

在一个方面，微生物培养物包含酵母属，例如酿酒酵母。在一个方面，酵母属是本文称为IN-SC1的酿酒酵母，其根据布达佩斯条约于2011年1月12日在帐号200139下保藏于ATCC，ATCC专利保藏号PTA-12384。在一个方面，微生物培养物包含酵母属，例如乳酸酵母。

微生物培养物可以包含分离的微生物的混合物，包括本文称为IN-AO1的米曲霉(ATCC专利保藏号PTA-121551)、本文称为IN-BS1的枯草芽孢杆菌(ATCC专利保藏号PTA-12385)、本文称为IN-RP1的沼泽红假单胞菌(ATCC专利保藏号PTA-12387)、本文称为IN-CU1的产朊假丝酵母(ATCC专利保藏号PTA-121550)、本文称为IN-LC1的干酪乳杆菌(ATCC专利保藏号PTA-121549)、本文称为IN-LH1的瑞士乳杆菌(ATCC专利保藏号PTA-12386)、本文称为IN-LR1的鼠李糖乳杆菌(ATCC专利保藏号PTA-121554)、本文称为IN-LP1的植物糖乳杆菌(ATCC专利保藏号PTA-121555)、绿脓假单胞菌、本文称为IN-RP1的沼泽红假单胞菌(ATCC专利保藏号PTA-12387)、本文称为IN-RP2的沼泽红假单胞菌(ATCC专利保藏号PTA-121553)、本文称为IN-SC1的酿酒酵母(ATCC专利保藏号PTA-12384)和乳酸酵母。在本公开的微生物培养物中接种的分离的微生物的实例包括但不限于米曲霉、沼泽红假单胞菌、产朊假丝酵母、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、绿脓假单胞菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母和乳酸酵母。

微生物培养物可以包含这些和其他分离的微生物的不同量和组合。因此，在各个方面，用以下的至少两种接种微生物培养物：曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌物属。在一个方面，用以下接种微生物培养物：米曲霉、枯草芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母。在一个方面，用混合培养物IN-M1(ATCC专利保藏号PTA-12383)接种微生物培养物。保藏的混合培养物IN-M1由菌株IN-LH1、IN-BS1、IN-SC1、IN-RP1组成；以及干酪乳杆菌和米曲霉，使用上文使用的名称。在一个方面，用米曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、干酪乳杆菌、瑞士孔杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、沼泽红假丝酵母和酿酒酵母接种微生物培养物。在一个方面，用本文称为IN-M2的混合培养物接种微生物培养物接种并且微生物培养物包含本文称为IN-M2的混合培养物，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-M2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121556。保藏的混合培养物IN-M2由菌株IN-LC1、IN-LH1、IN-LP1、IN-LR1、IN-LL1、IN-BS1、IN-AO1、IN-SC1、IN-CU1、IN-RP1和IN-RP2组成，使用上文使用的名称。任何公开的微生物培养物可以是本公开的无细胞上清液组合物的微生物培养物来源。本公开的无细胞上清液组合物可用于本文教导的方法。

选择标准

一个或多个选择标准能够将微生物制剂用于微生物的微生物培养物，以提供标准化的生态系统并提供无细胞上清液组合物来进行特定的反应。例如，可以测试提供酶的微生物对底物的酶活性水平，酶谱测试。

选择用于微生物培养物的微生物的方法包括测试酶谱活性，在不同条件如氧气或温度下的生长特性，在特定培养基条件如硝酸盐、碳水化合物、矿物质或特定污染物下的生长，以及特定微生物的特征反应，如形成孢子的能力。这些测试允许表征特定微生物和形成有用的微生物培养物。因此用于微生物培养物的微生物的一个测试标准是各种微生物物种的相互作用。一种微生物可能满足酶谱测试和其他标准，但是当添加到微生物群体中时可能不能很好地生长，因此不会选择所述微生物作为微生物培养物的组分。

酶谱测试

酶谱测试的实例包括提供底物并注意存在高活性(+3或更高)以及低至没有活性(+2和更低)的情况。例如，测试了乳酸杆菌，碱性磷酸酶具有+5酶水平，脂肪酶具有0酶水平。这样的乳杆菌可以在微生物培养物中与脂肪酶产生为+4或+5的另一种微生物混合。例如，在需要分解有机物质的反应时，两种酶活性在微生物培养是期望的。使用具有不同强度的微生物允许协作完成代谢途径，以便不具有不完全的生物化学途径，这些途径在环境中留下生物不可利用或不适于其他微生物物种作为营养或益生元的中间体化合物，或者不提供针对特定污染物的活性化合物/酶。不完全的生物化学途径也不提供参与用于组合物或接种环境中的不同物种的营养元素的生产或活化的分子；激素、生长因子、抗菌剂等，对受损环境的生长和再生产具有旁分泌影响(paracrine influence)。不完全生物化学途径的另一个有害影响是生产有毒和/或有气味的中间化合物，如硫化氢。

例如，从芽孢杆菌物种分离的细菌菌株的特征在于包括水解纤维物质(纤维素和半纤维素)、蛋白质和脂肪的能力的酶谱；以及完成在代谢过程中积累的许多中间分子和细胞的降解的能力。这些特征对降解有机物和降低或防止气味和其他气体排放是有用的。在0至5的范围内，通过训练有素的眼睛评估酶反应的颜色变化，评级+4至+5通常是最佳的，但特定生物体的更低反应可能是可接受的。

酶测试是可商购的，微生物的测试程序和确定活性水平的方法是本领域熟知的。其他特征包括例如筛选用于发酵酶的酿酒酵母和用已知酶谱的芽孢杆菌属物种。测试微生物以确定那些菌株在参与经证实的发酵途径的某些酶中具有高酶活性使得能够鉴定在微生物培养物中表现良好的微生物。单个菌落的分离和这些酶谱测试允许分离酶的强表达菌株。其他功能筛选测试可用于表征微生物培养物中的微生物。

孢子的形成

微生物的选择标准可能是孢子的形成或不形成。例如，可以基于从饥饿培养基转移到营养丰富的培养基时的响应来选择菌株。从饥饿培养基转移到营养丰富的培养基时显示出积极生长，并且在饥饿培养基中还表现出减少的孢子形成或较少量的孢子形成的菌株可能是最佳的。通过形成孢子而在不利条件下生存的物种对微生物培养可能不是最佳的。

温度

用于待在微生物培养物中接种的微生物的选择标准可以是微生物在不同温度下的生长。例如，基于在需氧条件下在不同温度下生长的能力来选择一种或多种芽孢杆菌菌株。使用在15℃至40℃不同温度下OD和pH随时间的细菌生长曲线数量作为选择标准。选择的菌株可能能够在硝酸盐存在下生长，能够在厌氧条件下生长或具有其他选择的特征。例如，可用于微生物培养物的芽孢杆菌的特征如下：+5的纤维素酶水平，+2至+3的蛋白酶水平，至少+4的脂肪酶，在8％硝酸盐培养基中生长，在30℃至40℃的温度范围内生长，以及不形成孢子。

枯草芽孢杆菌将通过使用硝酸盐或亚硝酸盐作为末端电子受体或通过发酵厌氧生长。双组分信号转导系统是控制厌氧呼吸的调节途径的早期阶段。ResD和ResE在厌氧基因调控中的作用之一是在氧限制下诱导fnr转录。FNR是厌氧诱导基因，包括呼吸的硝酸还原酶narGHJI的转录活化因子。枯草芽孢杆菌具有两种不同的硝酸盐还原酶，一种用于硝化氮的同化，另一种用于硝酸盐呼吸。相比之下，一种亚硝酸还原酶在亚硝酸盐氮同化和亚硝酸盐呼吸两者中起作用。不同于使用丙酮酸甲酯裂解酶的许多厌氧菌，枯草芽孢杆菌可以在不存在外部电子受体的情况下进行发酵，其中使用丙酮酸脱氢酶以代谢丙酮酸。枯草芽孢杆菌通常在25-37℃生长，在15℃-40℃下观察到基因表达。

氧代谢和营养浓度

氧代谢和营养物浓度的选择标准可用于表征用于接种用于制备本公开的无细胞组合物的培养物的微生物。例如，可以基于根据生长培养基中的氧浓度或营养物浓度调节代谢活性的能力，以及通过延伸，当用在本公开的组合物中时乳杆菌在特定环境中将具有哪些活性，来选择乳杆菌属菌株。例如，乳杆菌将乳糖和其他糖转化为乳酸。乳酸的生成使乳杆菌环境呈酸性，抑制了一些有害细菌的生长。培养物中大多数酸化菌群通常控制环境的pH值。当提供生物刺激或生物保护时，该特征允许本公开的方法提供低pH组合物。这样的组合物可具有大于两年的保质期。在某些乳杆菌菌株，例如植物乳杆菌中，当pH低于pH 3时乳酸的分泌下调，当pH过高时上调，而pH 4-5是最佳的。

用于接种用于制备本公开的无细胞组合物的制剂的乳杆菌菌株可以基于其帮助在制剂中提供组分的能力来选择，所述组分为延长室温保质期提供稳定性。例如，如果本公开的组合物在室温下储存在密封或密闭的容器中，则通过打开容器并通过已知的微生物稀释步骤和添加糖蜜(营养源)并在30-37℃下孵育以重新活化组合物来测量该组合物的生物活性。通过观察pH在5-7天内下降到3.7及以下来进行监测。本公开的组合物的密封容器的在室温下储存时保质期长于2个月、长于4个月、长于6个月、长于8个月、长于10个月、长于12个月、长于18个月、长于24个月、长于30个月、或长于36个月。

酵母和真菌

有益的酵母、真菌和曲霉提供本公开无细胞组合物的组分，例如酶、蛋白质、脂肪酸以及在培养过程中主动分泌或来自裂解细胞的其他小分子组分。虽然不希望受任何具体理论的约束，但据信这些分泌的组分通过直接刺激主题植物的生长提供直接生物刺激作用和/或通过增加存在于植物生长环境中的多种微生物物种定殖和其他生物活性的能力来提供间接生物刺激作用。在本公开的组合物中，酵母、真菌和曲霉提供了诸如酶、蛋白质、脂肪酸和其他小分子组分的组分以提供生物刺激，以及细胞碎片以保持环境中存在的厌氧光合细菌。可用于本公开的组合物的特定用途的酵母或真菌的特征在于其对人和动物是非致病性和无毒性的，并且其分泌在无细胞组合物中发现的并且对人和动物非致病性和无毒性的组分。

增强植物生长的方法

在一个方面，本文公开了增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供所公开的无细胞上清液组合物，从而增强植物生长。组合物可以包含用分离的微生物接种的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包括曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合。在一个方面，微生物培养物包含IN-M1。在一个方面，微生物培养物包含IN-M2。

一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的种子施用所述无细胞上清液，或其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的根施用所述无细胞上清液，其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的叶或茎施用所述无细胞上清液。所述方法可以包括这样的植物，其中植物在水培条件下生长或其中植物在气培条件或组合的气培和水培条件下生长，或者其中植物在温室中生长，或者其中植物在田间生长。

一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中增强植物生长是刺激分生组织分化，或其中增强植物生长是提高种子萌发率，其中提高的萌发率是比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率提高10％、15％或20％，其中萌发率通过在无细胞发酵液中在诱导的非生物胁迫实验室条件下经过0-70小时来测定。一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中增强植物生长是叶面积或干生物量的增加，其中与未提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比叶面积的增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、26％、28％或30％，或其中与未提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比干生物量的增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、26％、28％或30％。一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中增强植物生长是与未提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的果实产量相比，提供无细胞上清液的植物的果实产量增加。一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中增强植物生长是与未提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的生产寿命相比，提供无细胞上清液的植物的生产寿命增加。一种增强植物生长的方法，包括向种子、植物或特定生长阶段的植物或其组合提供或处理所公开的无细胞上清液组合物，从而与未处理的植物相比，增强处理的植物中的植物生长，其中增强植物生长是与未提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的生产期相比，提供无细胞上清液的植物的生产期增加。

使用本公开的组合物的方法包括影响、增强、调节、刺激或辅助植物生长的方法，包括向植物生长的部位、向植物或向特定生长阶段的植物或其组合提供无细胞上清液组合物，使得与类似的未处理植物相比，增加、增强或刺激经处理的植物的生长。方法可以包括向植物的种子施用无细胞上清液组合物。方法可包括在将植物种植在生长培养基中之前或之后向植物的根施用无细胞上清液组合物。方法可以包括向植物的叶和/或茎施用无细胞上清液组合物。方法可以包括向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来增强种子萌发，其中与未处理的种子相比，种子萌发增强，例如更快的萌发或更好的生长。方法可以包括向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来增强根部生产，其中与未处理的植物相比，经处理的植物具有增强的根部生产。方法可以包括通过向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来与未处理植物相比，增加经处理植物的每株植物产量。方法可以包括通过向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来与未处理植物相比，增加经处理植物的生物量。方法可以包括通过向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来与未处理植物相比，增加经处理植物的果实产量。方法可以包括通过向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来与未处理植物相比，增加经处理植物的生产期。方法可以包括通过向植物、向植物种子、向植物所在的土壤(或生长培养基)或在向植物提供的水或其他液体中施用效量的本文公开的无细胞上清液组合物来与未处理植物相比，增加经处理植物的生产寿命。该方法可以包括使用在水培条件下生长的植物的方法。方法可以包括使用在温室中生长的植物的方法。方法可以包括使用在田间或外部生长的植物的方法。方法可以包括使用气培条件或组合的水培和气培条件下生长的植物的方法。方法可以包括使用垂直耕作的方法。

由分离的微生物(例如一种或多种混合培养物，如IN-M1或IN-M2)接种的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物，或者包含组合的或单独的IN-AO1、IN-BS1、IN-RP1、IN-RP2、IN-LH1、IN-LC1、IN-LL1、IN-LP1、IN-LR1和IN-SC1中的一种或多种和/或其他微生物的组合物的使用已表明对于利用菌根真菌在有机材料中生长的植物的植物生长刺激；抑制营养液中的藻类开花；抑制常见植物感染；以及抑制高尔夫球场的草坪草上的藻类生长和生长的植物叶上的霉菌。

本公开的组合物和方法包括增强种子萌发。因此，在各个方面，向种子(例如，大豆种子)提供由分离的微生物(例如一种或多种混合培养物，如IN-M1或IN-M2)接种的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物，或者包含组合的或单独的IN-AO1、IN-BS1、IN-RP1、IN-RP2、IN-LH1、IN-LC1、IN-LL1、IN-LP1、IN-LR1和IN-SC1中的一种或多种和/或其他微生物的组合物可增加种子萌发。在各个方面，可以通过用由分离的微生物(例如一种或多种混合培养物，如IN-M1或IN-M2)接种的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物，或者包含组合的或单独的IN-AO1、IN-BS1、IN-RP1、IN-RP2、IN-LH1、IN-LC1、IN-LL1、IN-LP1、IN-LR1和IN-SC1中的一种或多种和/或其他微生物的组合物处理草坪草种子来增强草坪草(例如，高尔夫球场中使用的那些)的种子萌发。

在一个方面，提供无细胞上清液组合物包括向植物的种子施用无细胞上清液。在一个方面，提供无细胞上清液组合物包括向植物的根施用无细胞上清液。在一个方面，提供无细胞上清液组合物包括将向植物的叶和茎施用无细胞上清液。在一个方面，提供无细胞上清液组合物包括将无细胞上清液组合物加入到向植物提供的水或其他液体组合物中。例如，可以将无细胞上清液组合物加入到灌溉系统中，使得当提供灌溉水时提供无细胞上清液组合物。

在一个方面，用本文所述的一种或多种组合物涂覆种子。在一个方面，可以以多种方式用本文所述的组合物处理种子，例如通过喷雾或滴落。可以通过配制本文所述的组合物并通过连续处理系统(其被校准以便以与种子的连续流成比例的预定速率进行处理)(例如，滚筒式处理器)将组合物喷雾或滴落到种子上进行喷雾和滴落处理。也可以使用批处理系统，其中将预定批次大小的本文所述的种子和组合物输送到混合器中。用于进行这些方法的系统和装置可从许多供应商商购，例如Bayer CropScience(Gustafson)。

在另在一个方面，种子处理包括涂覆种子。一个这样的过程包括用本文所述的一种或多种组合物涂覆圆形容器的内壁，加入种子，然后旋转容器以使种子与壁和组合物接触，所述方法在本领域称为“容器涂覆”。可以通过涂覆方法的组合来涂覆种子。浸泡种子通常包括使用液体形式的所述组合物。例如，可将种子浸泡约1分钟至约24小时(例如，至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、80分钟、3小时、6小时、12小时、24小时)。

在一个方面，待处理的植物在水培条件下生长。在一个方面，待处理的植物在气培条件下或组合的气培和水培条件下生长。在一个方面，待处理的植物在温室中生长。在一个方面，待处理的植物在田间生长。

在一个方面，增强植物生长包括与未处理的类似植物相比刺激分生组织分化。在一个方面，增强植物生长包括与未处理的种子相比，经处理的种子的萌发率增加。

在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高5％。在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高10％。在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高15％。在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高20％。在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高25％。在一个方面，用无细胞上清液组合物处理的种子的增加的萌发率比未提供无细胞上清液组合物的基本类似的种子的萌发率高10％、15％、20％、30％、40％、50％或更高。

在一个方面，在无细胞培养液中诱导的非生物胁迫实验室条件下经过0-70小时的时期内确定萌发率。

在一个方面，增强植物生长是叶面积或干生物量的增加。

在一个方面，增强植物生长是叶面积的增加。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加5％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加6％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加7％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加8％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加9％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，叶面积增加10％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加11％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加12％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加13％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加14％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加15％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加16％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加17％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加18％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加19％。与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加20％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加22％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加24％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加26％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加28％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加30％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的叶面积相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的叶面积增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、40％、50％或更多。

在一个方面，增强植物生长是干生物量的增加。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加5％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加6％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加7％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加8％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加9％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加10％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加11％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加12％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加13％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加14％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加15％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加16％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加17％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加18％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加19％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加20％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加22％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加24％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加26％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加28％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加30％。在一个方面，与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的干生物量相比，用无细胞上清液组合物处理的植物的干生物量增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、40％、50％或更多。

在一个方面，增强植物生长是与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的果实产量相比，提供无细胞上清液组合物的植物的果实产量的增加。

在一个方面，增强植物生长是与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的生产寿命相比，提供无细胞上清液组合物的植物的生产寿命的增加。

在一个方面，增强植物生长是与不提供无细胞上清液组合物的基本类似的植物的生产期相比，提供无细胞上清液的植物的生产期的增加。

制备制品的方法

在一个方面，本文公开了制备包含无细胞上清液的制品的方法，包括向制品的表面提供所公开的无细胞上清液组合物。方法可以包括向制品施用无细胞上清液组合物的步骤，然后将组合的无细胞上清液组合物和制品干燥，以使无细胞上清液组合物附着到制品的表面。方法可以包括处理制品的一个或多个表面以有助于无细胞上清液组合物附着的步骤。方法可以包括向无细胞上清液组合物中加入一种或多种组分以有助于无细胞上清液组合物附着在制品的一个或多个表面。方法可以包括向无细胞上清液组合物和制品的一个或多个表面添加一种或多种组分，以有助于无细胞上清液组合物附着在表面。这些组分可以是有助于无细胞上清液组合物附着在表面或制品上的任何材料、化合物或分子。例如，可以使用组分如胶水、淀粉、天然材料、聚合物材料以及已知附着在表面或制品上的材料。方法可以包括表面或制品，其中表面或制品是玻璃珠、惰性材料、编织材料、非织造材料、天然材料如植物材料、椰子垫、二氧化硅珠、聚合物材料、植物容器、容器、过滤结构、多孔惰性颗粒或沸石。通过本公开预期了用本发明的无细胞上清液组合物附着制备的制品。

一种制备包含无细胞上清液的制品的方法，包括向制品的表面提供所公开的无细胞上清液组合物。该方法还可以包括在提供无细胞上清液之后将制品干燥。该方法还可以包括在向制品的表面提供无细胞上清液之前处理制品的表面的步骤。该方法还可以包括在向制品的表面提供无细胞上清液之后处理制品的表面的步骤。提供包含无细胞上清液组合物的制品的方法，其中提供无细胞上清液组合物是喷雾，或者其中提供无细胞上清液组合物是将制品浸入含有无细胞上清液组合物的容器中。该方法还可以包括向无细胞上清液组合物中加入一种或多种表面附着助剂，其中表面附着助剂有助于将无细胞上清液的一种或多种组分附着到制品的表面，或其中表面附着助剂能够将无细胞上清液中的一种或多种组分连接到制品的表面，或其中表面附着助剂是化学化合物，或其中化学化合物在无细胞上清液的一种或多种组分与制品的表面之间提供可逆的化学键，或其中化学化合物在无细胞上清液的一种或多种组分与制品的表面之间提供不可逆的化学键，或其中表面附着助剂是核酸、蛋白质、寡核苷酸或肽。提供包含无细胞上清液组合物的制品的方法，其中所述制品是生物炭、珠、过滤器、容器、纳米颗粒、微粒、垫、筛网、粉末、颗粒或织物、纺织材料、无纺材料、植物材料、垫、容器、聚合物材料、多孔材料、无孔材料或沸石。

在一个方面，方法包括在向制品提供无细胞上清液组合物之后干燥涂有无细胞上清液组合物的制品。

在一个方面，方法包括在向制品的一个或多个表面提供无细胞上清液组合物之前处理制品的一个或多个表面的步骤。

在一个方面，方法包括在向制品的一个或多个表面提供无细胞上清液组合物之后处理制品的一个或多个表面的步骤。

在一个方面，提供无细胞上清液组合物包括用无细胞上清液组合物喷涂制品。在一个方面，向制品提供无细胞上清液组合物包括将制品浸入含有无细胞上清液组合物的容器中。

在一个方面，方法包括向无细胞上清液组合物中加入一种或多种表面附着助剂，其中表面附着助剂有助于无细胞上清液的一种或多种组分附着在制品的表面上。在一个方面，表面附着助剂能够将无细胞上清液中的一种或多种组分连接到制品的一个或多个表面上。在一个方面，表面附着助剂是化学化合物。在一个方面，化学化合物在无细胞上清液组合物的一种或多种组分与制品的一个或多个表面之间提供可逆的化学连接。在一个方面，化学化合物在无细胞上清液组合物的一种或多种组分与制品的一个或多个表面之间提供不可逆的化学键。在一个方面，表面附着辅助剂是核酸、蛋白质、寡核苷酸或肽。

在一个方面，制品是生物炭、珠、过滤器、容器、纳米颗粒、微粒、垫、筛网、粉末、颗粒或织物。在一个方面，制品是纺织材料、无纺材料、植物材料、垫、容器、聚合物材料、多孔材料、无孔材料或沸石。

制备无细胞上清液组合物的方法

在一个方面，本文公开了制备无细胞上清液组合物的方法，其包括以下步骤：(a)通过用分离的微生物接种培养基(也称为发酵液)形成本文公开的微生物培养物以形成微生物培养物，其中微生物包括本文公开的微生物，例如IN-M1、In-M2，本文公开的保藏菌株曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合；(b)将微生物培养物孵育至少5小时；以及(c)在步骤(b)之后将微生物培养物以10,000×g的离心力离心至少10分钟；从而将包含微生物的离心的材料与微生物培养物的液体分离并提供无细胞上清液组合物。方法可以包括测量微生物培养物的特征。测量微生物培养物的特征可以包括通过一种或多种其他选择的微生物测量一种或多种选择的微生物的捕食，测量由一种或多种所选微生物释放或制备的因子或蛋白质，pH变化，或者由一种或多种选择的微生物分泌的胞外酶或者其对一种或多种选择的其他微生物的影响，测量微生物培养物中一种或多种选择的微生物的每mL细胞数，确定一种或多种选择的微生物的生长速率，或者特征和测量的组合。方法可以包括使用微生物培养物的测量特征来确定是否要从微生物培养物中移除一种或多种微生物，或者是否将一种或多种微生物加入到微生物培养物中。方法可以包括，其中当从微生物培养物中移除一种或多种微生物时，该方法可包括杀死微生物培养物。方法可以包括，其中当将一种或多种微生物加入到微生物培养物中时，方法可以包括向微生物培养物中加入一种或多种期望的分离的微生物，并将微生物培养物生长至预定的细胞浓度以产生微生物培养，并且任选地包装微生物培养物的全部或部分。方法可以包括重复方法的步骤一次或多次。方法可以包括将微生物培养物的细胞生长至特定浓度以形成个别微生物培养物。方法可以包括制备一种或多种微生物培养物，和f)将各微生物培养物组合以形成微生物培养物。方法可以包括使微生物培养物生长至特定浓度；并包装微生物培养的全部或部分。所述方法可以包括生长微生物培养物并测量微生物培养物的特征。方法可以包括测量微生物培养物的特征的步骤，包括通过一种或多种其他选择的微生物测量一种或多种选择的微生物的捕食，测量由一种或多种所选微生物分泌的因子，pH变化，或者由一种或多种选择的微生物分泌的胞外酶或者其对一种或多种选择的其他微生物的影响，测量微生物培养物中一种或多种选择的微生物的每mL细胞数，确定一种或多种选择的微生物的生长速率，或者一种或多种测量组合。方法可以包括使用微生物培养物的测量特征来确定是否要从孵育混合培养物中移除一种或多种微生物，或者如果要将一种或多种微生物加入到培养混合培养物中，或者不对微生物做出变化。

一种制备无细胞上清液组合物的方法，包括以下步骤：(a)用分离的微生物接种发酵液，其中所述微生物包括曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属或其组合；(b)将接种的发酵液孵育至少5小时；(c)在步骤(b)之后将培养物以至少14,000×g的离心力离心至少10分钟；以及(d)用0.22um MCE过滤器过滤；从而提供无细胞上清液。所述方法，其中曲霉属是米曲霉，或其中曲霉属米曲霉IN-AO1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-AO1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121551。所述方法，其中所述芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌，或其中所述芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌IN-BS1，ATCC专利保藏号PTA-12385。所述方法，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌，或其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP1，ATCC专利保藏号PTA-12387。所述方法，其中所述假丝酵母属是产朊假丝酵母，或其中所述假丝酵母属是产朊假丝酵母IN-CU1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-CU1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121550。所述方法，其中所述乳杆菌属是干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌或其组合，或者其中所述乳杆菌属是瑞士乳杆菌IN-LH1，ATCC专利保藏号PTA-12386，或者其中所述乳杆菌属是干酪乳杆菌，在本文称为IN-LC1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LC1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121549，或者其中所述乳杆菌属是乳酸乳杆菌，在本文称为IN-LL1，其根据布达佩斯条约于20114年9月4日在帐号200139下以名称IN-LL1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121552，或者其中所述乳杆菌属是植物乳杆菌IN-LP1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LP1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121555，或者其中所述乳杆菌属是鼠李糖乳杆菌IN-LR1，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-LR1保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121554。所述方法，其中所述假单胞菌属是绿脓假单胞菌。所述方法，其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌，或者其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP1，ATCC专利保藏号PTA-12383，或者其中所述红假单胞菌属是沼泽红假单胞菌IN-RP2，其根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-RP2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121553。所述方法，其中所述酵母属是酿酒酵母，或者其中所述酵母属是酿酒酵母IN-SC1，ATCC专利保藏号PTA-12384。所述方法，其中所述链球菌属是乳链球菌。所述方法，其中所述微生物培养物还包含至少一种菌根真菌。所述方法，其中用来自曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属中的至少两种接种所述微生物培养物。所述方法，其中用米曲霉、枯草芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母接种所述微生物培养物。所述方法，其中用混合培养物IN-M1接种所述微生物培养物，IN-M1的ATCC专利保藏号为PTA-12383。所述方法，其中用其中用米曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、沼泽红假丝酵母和酿酒酵母接种所述微生物培养物。所述方面，其中用混合培养物IN-M2接种所述微生物培养物，IN-M2根据布达佩斯条约于2014年9月4日在帐号200139下以名称IN-M2保藏于ATCC专利保藏所，ATCC专利保藏号PTA-121556。所述方法还包括步骤(e)对无细胞上清液进行灭菌。灭菌可以是过滤灭菌。所述方法，其中孵育接种的发酵液(微生物培养)持续至少24小时，或至少60小时，或至少120小时，或至少360小时。通过所述方法制备的无细胞上清液组合物。

在一个方面，方法还包括对无细胞上清液进行灭菌的步骤(e)。

在一个方面，灭菌是过滤灭菌。

在一个方面，将微生物培养物培养至少24小时的时间段。在一个方面，将微生物培养物培养至少60小时的时间段。在一个方面，将微生物培养物培养至少120小时的时间段。在一个方面，将微生物培养物培养至少360小时的时间段。本领域技术人员可以确定用于孵育微生物培养物的有效时间段，并且时间可以取决于使用来自微生物培养物的无细胞上清液组合物的方法。

在一个方面，经由离心通过除去微生物培养物的细胞，由微生物培养物形成无细胞上清液。通过离心，培养物的细胞组分(即细菌)与上清液分离，以便提供无细胞上清液组合物。使用无细胞上清液组合物是将一部分无细胞上清液组合物添加到微生物培养物中。制备微生物培养物的步骤可以是向微生物培养物中加入无细胞上清液组合物。

在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约2500rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约5,000rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约7500rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约10,000rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约12,500rpm至约15,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约12,500rpm下进行。在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约10,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约7500rpm下进行。在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约5,000rpm下进行。在一个方面，离心可以在约1,000rpm至约2500rpm下进行。

在一个方面，由微生物培养物形成(或衍生、产生或制备)无细胞上清液，其中通过过滤将细胞或固体物质与微生物培养物的液体部分分离。在一个方面，用超滤膜实现过滤。通常用于形成超滤膜的高性能合成聚合物的实例包括聚砜、聚醚砜和聚丙烯腈。

在一个方面，超滤膜的孔径为约0.01μM至约0.1μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.03μM至约0.1μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.05μM至约0.1μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.07μM至约0.1μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.09μM至约0.1μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.01μM至约0.09μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.01μM至约0.07μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.01μM至约0.05μM。在一个方面，超滤膜的孔径为约0.01μM至约0.03μM。

在一个方面，超滤膜的孔径为约1,000标称分子量截留(nominal molecularweight cutoff，NMWC)至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约3,000NMWC至约750,0000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约5,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约10,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约30,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约50,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约100,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约300,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约500,000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约500,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约300,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约100,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约750,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约50,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1000NMWC至约30,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1,000NMWC至约10,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1,000NMWC至约5,000NMWC。在一个方面，超滤膜的孔径为约1,000NMWC至约3,000NMWC。

在一个方面，超滤膜是中空纤维交叉流超滤膜。中空纤维膜交叉流过滤广泛用于细胞浓缩，这通常是细菌或哺乳动物细胞培养物的“脱水”。该方法通常认为是微粒的直接浓缩，但也可以包括在后续步骤之前除去培养基组分的细胞洗涤步骤，例如均化(即，微流化)。

在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.0028m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.005m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.010m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.05m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.1m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.5m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约1m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约5m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约10m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约15m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约20m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约25m²至约28m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约25m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约20m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约15m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约10m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约5m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约1m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.5m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.1m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.05m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.01m²。在一个方面，中空纤维交叉流超滤膜的有效面积为约0.0016m²至约0.005m²。

应当理解，已经描述的本公开的方面是举例说明本发明的原理的一些应用。在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以进行许多修改。

已经参考其具体方面描述了本公开。然而，明显是的，在不脱离本公开的更广泛的精神和范围的情况下，可以对其进行各种修改和改变。因此，说明书和附图被认为是说明性的而不是限制性的。

实施例

实施例1-用于制备无细胞上清液组合物的微生物培养物的制备方法

基于其酶活性谱、其在培养基中生长的能力，其缺少孢子形成或本文所述的其他标准来选择微生物(例如细菌或酵母)来包含在组合物中。使微生物在用于所述生物体的标准培养基中生长，并且当在指数生长期时，将其取等分试样并储存。用于培养微生物(例如细菌或酵母)的培养基是本领域技术人员已知的。

例如，在制备I-M Lab时，将IN-LH1、IN-BS1和干酪乳杆菌各自的等分试样(5mL，1×10⁶细胞)加入到适于乳杆菌和芽孢杆菌的培养基中，例如水(700mL)、糖蜜(37.5g)、膨润土(3.75g)和海盐(3.75g)。使细菌生长至在600nm测定的0.752的光密度(以下称为“OD₆₀₀”)。

在制备I-M PNSB中，将IN-RP1的等分试样(5mL，1×10⁶细胞)加入到适合光营养细菌的培养基中。例如，将水(134mL)、鱼乳液(9mL)和IN-SC1培养物(1×10⁶细胞，1mL)合并，然后用水将体积调节至144mL，并使细胞生长至OD₆₀₀0.856。也可加入碳水化合物源(即，糖蜜)。本文所用的鱼乳剂可从Nutrivert，Dunham，Quebec(非巴氏消毒)作为有机土壤改良剂商购获得。

在制备I-M酵母中，将IN-SC1和米曲霉(OD₆₀₀0.3)(South River Miso Company，Conway，Massachusetts，USA)的等分试样(5mL，1×10⁶细胞)加入到适合酵母的培养基中，例如将水(390mL)、糖蜜(1g)、鱼乳液(29g)、海藻(9g)和小麦胚芽(1g)合并，用水将体积调节至432mL，并使细菌生长至OD₆₀₀0.574。

为了制备包含微生物如以ATCC专利保藏号PTA-12383保藏的IN-M1的微生物培养物，使用三种微生物培养物。将I-M Lab、I-M PNSB和I-M酵母加入到如下所示的包含水、糖蜜、矿物粉末、海盐和麦麸的培养基中。三种微生物组分混合物以下表所示百分比添加。种子培养物(初始混合培养物)包含IN-RP1、IN-BS1、IN-SC1、米曲霉、IN-LH1和干酪乳杆菌，并在无菌条件下制备。

将糖蜜、海盐、麦麸和矿物粉末溶解在一些温水中，并且将温度保持在45-50℃。将I-M LAB、I-M PNSB和I-M酵母一起加入到独立的容器中并共混。总计为50L，其中20L为I-MLAB，20L为I-M PNSB，且10L为I-M酵母(包含这三种微生物组分的组合物在本文称为种子培养物)。将这种种子培养物加入到培养基的主槽中，加入水到110L，轻轻搅拌下将温度保持在37℃，直到pH为pH 4.0或更低。

制备二次发酵培养物(混合培养物)以产生稳定的浓缩培养物(混合培养物)，其每升包含约10亿个微生物(1×10⁶细胞/mL)。浓缩组合物的保质期可以为3年或更久。用50升种子培养物(如上所述，20L为I-M LAB，20L为I-M PNSB，且10L为I-M酵母)接种典型的1000升二次发酵液批次，培养基为50-200升无硫农业糖蜜、3.75升麦麸(0.02-0.05体积％)、3.75升海藻(0.02-0.05体积％)、3.75升膨润土(0.02-0.05体积％)、1.25升鱼乳液(市售有机土壤改良剂，来自Nutrivert，Dunham，Quebec，非巴氏消毒)、1.25升大豆粉(0.005-0.03体积％)、675mg市售海盐，并且用足够的不含氯温水制备成1000L。

接种后第5天pH降至约3.7，使培养物生长，每天轻轻搅拌一次，并监测pH值。将培养物在32-37℃下孵育3-10周，得到以下实施例中使用的含微生物的组合物。将该组合物在室温下在避光的气密容器中，在缺氧条件下装瓶并储存。所得到的组合物可以称为浓缩组合物，细胞为1×10⁶细胞/mL。

如上文对于IN-M1的描述，由以ATCC专利保藏号PTA-121556的保藏的混合培养物储备物IN-M2制备微生物组合物，例如批次ID 140226的IN-M2和批次ID 140227的IN-M2。将批次ID 140226的培养物在30-32℃下孵育3-10周，并将批次ID 140227的培养物在35-37℃下孵育3-10周。

在替代方法中，二次发酵可以含有一种或多种微生物菌株，例如从商业实体购买的微生物和/或从环境分离的内源性微生物或微生物菌群。

实施例2-无细胞上清液组合物的制备

通过将使用上述方法制备的微生物培养物在14,171×g的离心力离心至少10分钟来获得无细胞上清液(“CFS”)组合物。然后通过吸光度(600nm)检查CFS组合物，以确定是否依然存在任何微生物，并通过倾析或移液移取液体部分。然后将上清液用0.22μM微米过滤器(MCE膜)过滤灭菌。

实施例3-组合物的特征

测定由包含IN-M1(产品A)和IN-M2(产品B)的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物的化学特征。对于每种无细胞上清液组合物，结果相当一致，每种具有相当高水平的钾(每克组合物约2500μg)，然后是氮(每g组合物约435-600μg)、钙(每g组合物约475-660μg)和镁(每g组合物约200-260μg)。钠的范围为160至360ppm。pH范围类似地在4.3-4.5。在测试的无细胞上清液组合物中硫以接近425-500ppm存在。磷以非常低的水平(50-90ppm)存在。所有其他金属都处于微量水平，除了铁以约20ppm存在。

存在显著水平的挥发性脂肪酸，乙酸最高(2000-2400μg/g)，其次是丁酸(1300-1750μg/g)。产物A的异丁酸含量低至约600ppm，但产物B为650ppm。相反，产物A的丙酸含量为940-1100ppm，而产物B的丙酸含量仅为147ppm。

两种样品含有相对少量的挥发性脂肪酸(VFA)。VFA如乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等是细菌厌氧发酵的代谢产物。已经在许多类型的部分发酵的材料中检测到这些生物化学物质，包括厌氧储存的液体肥料、堆肥、食品和有机产品(Cooper和Comforth(1978)J.Sci.Food Agric.29，19-27；Guenzi和Beard(1981)J.Environ.Qual.10，479-482；Patni和Jui(1985)Agric.Wastes 13，159-178)。VFA可以杀死人和动物微生物病原体(Goepfert和Hicks(1969)J.Bacteriol.97，956-968；Kenealy等人(1995)Appl.Microbiol.Biotechnol.44，507-513；Kunte等人.(1998)J.Appl.Microbiol.84，138-142)、食品腐败生物体(Corsetti等人(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.50，253-256)和作物植物(Lynch，J.M.(1977)J.Appl.Bacteriol.42，81-87；Lynch，J.M.(1978)SoilBiol.Biochem.10，131-135)。乙酸是一种注册的有机除草剂。乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸的高稀释度是未成熟堆肥的植物毒性的原因，并且当暴露于未成熟堆肥时，已经显示出抑制芜菁(Brassica rapa L.)的生长。毒性主要与丙酸和正丁酸有关(Chanyasak等人(1983)Soil Sci.Plant Nutr.29，251-259)。在掺入绿肥后常见的植物毒性与微生物降解过程中产生的乙酸的产生有关(Lynch，J.M.(1977)J.Appl.Bacteriol.42，81-87；Lynch，J.M.(1978)Soil Biol.Biochem.10，131-135)。经常向青贮物和水果添加VFA以防止腐烂，并且乙酸和丙酸被用作食品防腐剂(Doores，S.(1993)Organic acids.第95-136页：Antimicrobials in Food.P.M.Davidson and A.L.Banen编辑.Marcel Dekker，New York；Ohyama等人(1977)J.Sci.Food Agric.28，369-374)。已经显示VFA抑制许多微生物(包括植物病原体)的生长(Abbasi等人(2009)Phytopathology99，274-281；Conn等人(2005)Phytopathology95，28-35；Tenuta等人(2002)Phytopathology92，548-552)。新近堆肥的城市废物中的乙酸抑制疫霉菌(Phytophthora nicotianae)的菌落生长和柑橘幼苗的感染(Widmer等人(1998)Plant Dis.82，683-688)。McKellar和Nelson(2003)(Appl.Environ.Microbiol.69，452-460)也发现，堆肥诱导的腐霉属腐烂的抑制是由脂肪酸代谢种子定殖微生物群落介导的。

虽然不希望受任何特定理论的约束，但目前认为，非电离形式的VFA是有毒的(Freese等人(1973)Nature 241，321-325)。电离(即乙酸盐)与非电离(即乙酸)形式的VFA的比例取决于溶液的pH。使用Henderson-Hasselbalch方程估算溶液中单个VFA的非电离形式的稀释(Hasselbalch，K.A.(1915)Biochem.Z.78，112-144)。尽管非电离形式的VFA具有许多明显的益处，在农业中VFA的潜在用途一直被忽视。原因之一，大多数是对人类和动物风险很低的可食用产品。非电离形式的VFA在环境中短暂存在，通常只持续了几天。非电离形式的VFA可以作为土壤中许多微生物的营养来源。最重要的是，非电离形式的VFA在果实表面不留下化学残留物，允许在生长阶段的任何时候进行施用。Sholberg(1998)(PlantDis.82，689-693)开发了一种使用乙酸蒸气作为软果(tender fruit)的熏蒸剂以减少收获后腐烂的可能性的方法。一些被认为是有益的因素也可能是局限性的。在pH范围在6以上的土壤中，VFA主要以盐形式存在并且不具有生物活性。4.5的pH值接近IN-M1中许多VFA的pK_a；不希望受理论约束，这可能表明至少50％的VFA应该是其生物活性形式。

实施例4-使用无细胞上清液组合物和方法影响萌发

使用大豆、萝卜、油菜、芝麻菜和小麦以及上述实施例中所述的两个批次的无细胞上清液组合物IN-M1(A)和IN-M2(B)进行两种萌发试验。对于试验1，测试的稀释度为蒸馏水中1/10、1/20和1/40，对于试验2，测试的稀释度为蒸馏水中1/50、1/100、1/200、1/400和1/800。所有种子通过在70％乙醇中冲洗30秒进行表面灭菌。然后将其在无菌水中冲洗3次，并在无菌纸巾上干燥。将两片无菌滤纸放在预先灭菌的塑料培养皿的底部。在加入种子之前，将6mL的每种稀释液加入到培养皿中。对照板接收等体积的水。当滤纸完全饱和时，将10个种子随机放置在滤纸上。由于种子的大尺寸，每个板只加入8颗大豆。将种子用另外一个滤纸覆盖。将板用parafilm密封并放置在生长室内，直到完全萌发，大约(7天)。对萌发种子进行计数，并根据每次测试产生的萌发规模进行评级。对照和每种处理一式三份进行测试。

使用Windows，Graphpad Software的GraphPad Prism版本6.00(还参见www.graphpad.com)对所有数据进行单因素ANOVA，然后进行Dunnett的多重比较检验。施用IN-M1无细胞上清液对于种子萌发的影响的代表示出于图1A-1B、2A-2B和3A-3B中。下文将描述另外的实验。

试验1

通常，随着无细胞上清液组合物的浓度增加，所有作物中种子萌发以及下胚轴和根生长降低。在批次A和B之间发现植物响应的差异。在所有测试浓度下，批次B对芝麻菜和萝卜有害。

为了对结果评级，产生每种作物的萌发量表，其代表获得的不同程度的萌发。使用适当的量表对每个板进行评估。

小麦

批次A和B的稀释度1/10和1/20对小麦萌发具有不利影响(图32A)，而在接种产品的1/40稀释度或对照的存在下萌发的小麦中没有发现统计学显著差异(图1B)。

油菜

批次之间的差异在本实验中更为明显。IN-M2(B)的1/10和1/20的稀释度不利地影响油菜萌发，而IN-M1(A)的仅1/10稀释度积极地影响萌发(图32B)。当用1/40IN-M1(A)处理种子时，幼苗具有比对照植物更长和更强壮的芽，但是显著更小的根。

芝麻菜

所有测试的IN-M2(B)浓度对芝麻菜萌发具有不利影响。IN-M2(B)的稀释度1/10和1/20完全抑制萌发，当用1/40IN-M2(B)处理时，只有少数种子萌发。批次A(IN-M1)的稀释度1/10和1/20对于芝麻菜萌发也是有害的，仅处理1/40如对照一样萌发(图32C)。

萝卜

虽然IN-M2(B)的无细胞上清液组合物不抑制萌发，但所述上清液组合物处理对萝卜萌发是不利的。仅处理1/40IN-M1(A)如对照一样萌发(图32C)。

大豆

在任何稀释度测试和用任一制剂对大豆萌发没有抑制作用(图32E)。事实上，与对照相比，IN-M1(A)的无细胞上清液组合物的1/40稀释度处理显著改善了幼苗质量。

试验2

基于之前的结果，用IN-M1(A)和IN-M2(B)的无细胞组合物的稀释度1/50、1/100、1/200、1/400和1/800进行萌发试验7天。如图33A-D中所示，在任何测试种子上，没有处理影响萌发。

总之，较高浓度的产品IN-M1(A)和IN-M2(B)对种子萌发有一定的不利影响；这与抑制真菌生长所看到的类似。例外的是大豆，在1∶10的最高测试比率下，观察到了IN-M1的无细胞上清液组合物的积极效果。当使用较低浓度的IN-M1和IN-M2(稀释度1/50或更高)时，萌发不受影响。

实施例5-追踪随着时间微生物培养物中存在的细菌和真菌群落谱的变化

2014年3月10日交付了两个批次的微生物培养物用于化学分析和微生物群落谱分析。批次“A”是IN-M1，并且是2011年的高盐制剂。批次“B”是IN-M2，并且是低盐制剂，其中在二次发酵中未添加氯化钠，并且还包含2013年的腐殖酸。在厌氧条件下制备所述批次，然后放入密封的塑料瓶中。由于产品中存在的微生物含量，暴露于氧和温暖的温度可能会导致微生物群落的生长和潜在的变化。因此，重要的是确定群落的变化以及储存条件对变化的影响。

在抵达实验室后，将两个批次储存在4℃冰箱中。每个瓶在无菌条件下在生物安全柜中打开，收集60×1.5mL子样品并储存在2mL微量离心管中。将来自每个瓶的60个样品置于冷藏箱中并储存在-80℃冰箱中。这些样品作为实验其余部分的基线和对照。从每个瓶收集另外的6个1.5mL样品用于“时间零”点。

除了时间零点样品，收集来自每个瓶的9×45mL子样品并储存在50mL的falcon管中。将三个管放置在4℃冰箱中，三个在25℃孵育器，三个在室温下的实验台上。在每个温度位置储存总共6个管(来自批次A的3个和来自批次B的3个)。

每个月一次，从每个温度的每个50mL falcon管中取出2×1.5mL子样品。每个批次每个温度共收集6个子样品，总共36个样品。从-80℃冰箱中的储库中取出每个批次的三个对照样品。一年中每月一次，收集和分析42个样品。实验完成后，共收集了516个样品，并通过TRFLP进行分析(12个月×42个样品＝504个样品+在时间零点取得的12个样品)。分析样品的细菌和真菌TRFLP。因此，用于TRFLP的分析的样品总数为1032个样品(504个细菌样品和504个真菌样品加上在时间零点取得的24个(12个细菌+12个真菌)样品)。

时间零点-2014年3月21日

时间零点表示批次首次打开并暴露于氧气时存在的微生物群落。收到后，将批次储存在4℃的冰箱中，并在批次抵达实验室后的2天内取出时间零点样品。在时间零点，批次A和B的细菌群落彼此显著不同(图4)。不希望受到理论的约束，通过主成分分析观察到的差异可能是由于批次间群落多样性的差异。每个峰(正向或反向引物)理论上表示一种细菌，峰高表示丰度。批次A具有许多在批次B中没有发现的小峰，这将解释PCA的显著结果。批次A中存在的4个最丰富的峰是138、305、567/8和755的碱基对(图5)。批次B以138碱基对的1个大峰为主(图5)。批次A和B的真菌群落几乎相同，并且以204或205碱基对处的相同峰为主(图6)。在真菌群落中没有进行主成分分析，因为每个样品中只有1个或2个峰，并且很明显谱是相同的。

第一个月-2014年4月

细菌

在1个月的生长之后，批次A和B的细菌群落相当类似，只有少数显示出一些显著差异(图7)。储存在-80℃的对照A和对照B显著不同，这与时间零点样品的结果一致。储存在4℃的批次A和储存在室温下的批次A与储存在25℃、4℃的批次B以及对照显著不同。储存在25℃下的批次A与批次A对照显著不同。所有四个批次B样品彼此类似，仅对照紧密聚集在一起，远离储存在25℃和4℃下的批次B样品。所有四个批次A样品彼此类似，除了对照和25℃样品显著不同。

IN-M1(批A)

在1个月的生长之后，储存在-80℃、4℃、25℃和室温的批次A样品的谱线均共享在138、305和567碱基对处的主峰(图8)。然而，4个储存温度之间的共享峰的丰度非常不同。储存在-80℃和4℃下的批次A样品中最丰富的峰在305碱基对处。25℃和室温下批次A中最丰富的峰值在138碱基对处。有趣的是注意到在低温下储存的2个样品和温暖温度下储存的2个样品之间的丰度差异。在较低的温度下，负责305碱基对峰的生物体是最主要的，并且具有最高的强度。在较高的温度下，负责138碱基对峰的生物体是最主要的，并且具有最高的强度。在室温下，在305碱基对处的峰仅在6个重复中的2个中发现，并且处于非常低的强度水平，而138碱基对处的峰在所有6个重复中是所有样品温度的最高强度水平。尽管138和305碱基对的峰经历随温度变化的丰度变化，但是567/8碱基处的峰的丰度保持相对稳定，除了在室温下其仅存在于两个重复中。不希望受理论的约束，这些结果表明，给予正确的环境，负责138碱基对的峰的生物体增殖并导致其他生物体的减少和/或消除。

IN-M2(批次B)

在生长1个月后，储存在4℃、25℃、-80℃和室温下的批次B的细菌群落谱彼此都类似，共享了许多相同的大峰(图9)。4个温度中的每一个的所有6个重复共享138碱基对处的相同的主峰。在每个温度的至少5次重复中也发现了191、194、296、305、559和661碱基对处的峰。与批次A不同，所有重复和所有四个温度下的批次B以峰138为主，没有其他峰接近相同的强度水平。随着温度的变化，也没有观察到丰度的变化。群落之间唯一明显的差异在508碱基对处。508碱基对处的峰不具有高强度值，但仅存在于对照(-80℃)和4℃样品中。

真菌

IN-M1(批次A)

在1个月的生长之后，储存在所有4个温度下的样品中存在的真菌群落几乎相同，只有1或2个大峰(图10)。每个谱线中以204/5/6碱基对处的峰为主。仅1或2个碱基对不同的峰可能代表相同的生物体。

IN-M2(批次B)

在1个月的生长之后，储存在所有4个温度下的样品中存在的真菌群落几乎相同，只有1或2个大峰(图11)。每个谱线中以204/5/6碱基对处的峰为主，其具有非常高的强度值。

真菌群落谱分析的结果与时间零点样品的结果一致。

不希望受到理论的约束，储存批次A的温度可能对产品中存在的细菌群体产生影响。根据产品储存的温度，不同的生物体主导批次A的细菌群落。随着温度的升高，负责138个碱基对处的峰的生物体群也是如此。峰138的丰度的增加似乎随着其增殖减少和/或消除生物体。在1个月的生长之后，批次A和批次B的真菌群落保持一致，以1或2种生物体为主。1个月后，温度不影响真菌群落。

实施例6-具有植物性能的组合物和方法的使用

微绿色蔬菜(Microgreen)和小绿色蔬菜(Petite green)是由各种蔬菜、草药或其他植物产生的嫩的可食用绿色蔬菜。所述蔬菜在发育成较大的植物之前收获，尽管其具有小尺寸，但是具有强烈的味道和颜色。从高档市场和高级餐厅，对这些产品的需求不断增加。本研究选择了一种快速生长和广泛消费的小绿色蔬菜芝麻菜。将芝麻菜种植在来自Holland Marsh的有机土壤上，因为所述土壤类似于用于生长这些植物的土壤。

使用与不同浓度的无细胞上清液组合物混合的芝麻种子和土壤，所述无细胞上清液组合物由包含1N-M1的微生物培养物和包含IN-M2的微生物培养物制备。基于用植物致病真菌发现的控制效率选择处理：对照(n＝5)；1/10IN-M1(n＝5)；1/20IN-M1(n＝5)；1/40IN-M1(n＝5)；1/10IN-M2(n＝5)；1/20IN-M2(n＝5)；以及1/40IN-M2(n＝5)。

将360g Holland Marsh土壤(80％保水量)与不同浓度的接种产品混合。将10个芝麻菜种子种植在每盆的60g经处理土壤中，每个处理使用5盆(n＝5)。监测植物的出苗和生长，两周后收获植物，进行处理，并且分析结果。

试验1

种植后两周，处理芝麻菜，对植物数计数，并且测量叶绿素含量、芽长度、总植株长度和总植株干重。开发了一种芝麻菜活力量表，用作测量植物生长和叶体积的视觉方式(图12)。

使用活力量表，对每个处理的每盆植物进行评级。如图16A所示，任何处理和对照植物之间的活力没有统计学上的显著差异。此外，在测量的任何参数(植物数、叶绿素、芽干重、根干重和植物长度)中，处理和未处理植物之间没有发现差异(图13A-F)。虽然根生物量的差异不是统计学显著的，但不希望受理论的约束，但这些结果表明，具有较高浓度的IN-M1和IN-M2的处理可能对根发育有害。

试验2

如前所述，种植两周后，使用图15所示的量表对植物活力评级。将植物从其盆中取出，洗去根部的所有土壤以进行目视比较。对植物数计数，测量叶绿素含量和植物长度，之后分离根和芽并在60℃下干燥过夜。分别记录和比较芽和根的干生物量。如图14A-F中所示，在测量的任何参数中，在对照和处理的植物之间没有发现统计学上显著的差异。

在所测试的条件下，用1∶10至1∶40的稀释度的来自IN-M1的微生物培养物和IN-M2的微生物培养物的无细胞上清液组合物的处理不影响芝麻菜生长和植物性能。在处理对照植物和对照植物之间没有发现统计学上的显著差异。

实施例7-无细胞上清液组合物中使用的群落的微生物指纹

微生物分析-TRFLP

为了便于识别，将两个批次的微生物培养物标记为批次A，IN-M1和批次B，IN-M2。每个批次通过翻转瓶数次充分混合。从每个瓶中取出三个1.5mL子样品并置于2mL微量离心管中。将管置于离心机中并以14,000rpm旋转4分钟以沉淀任何微粒和微生物。使用NorgenGenomic DNA分离试剂盒(Norgen Biotek Corp.ON)按照制造商的方案对每种沉淀物进行DNA提取。

以最终反应体积50μL制备PCR主混合物。在细菌PCR中使用的两种引物是具有序列CAGGCCTAACACATGCAAGTC(SEQ ID NO：1)的63F引物和具有序列ACGGGCGGTGTGTACAAG(SEQID NO：2)的1389R引物。在真菌PCR中使用的两种引物是具有引物序列TCCGTAGGTGAACCTTGCGG(SEQ ID NO：3)的ITS1F和具有引物序列TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO：4)的ITS4。运行1％琼脂糖凝胶以检查反应产物。使用DNA清洁和浓缩器(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA，USA)纯化PCR产物。将12μL纯化的PCR产物加入到13μL限制性混合物中，并在35℃下在黑暗中孵育3小时，然后使用3730DNA分析仪和GeneScan1200LIZ Size Standards(Applied Biosystems，USA)一起进行测序凝胶分析。使用具有默认设置和修改的片段峰强度截止值50的Gene Marker(SoftGenetics LLC)分析TRFLP结果。将正向和反向片段大小加强度导出到Microsoft Excel中，并使用PCA与软件XLStat分析数据。基于峰值存在的相似性，将TRFLP数据被转换为二进制并聚类。每个处理组自动绘制95％的置信区间，其中识别统计学显著性。认为不重叠的组在其微生物群落中具有统计学差异。

铺板和分离鉴定

将每个批次的子样品铺板在7种不同的培养基类型上，以确定每个批次中存在哪些微生物，并鉴定对群落或新微生物的任何变化。

使用的培养基包括营养琼脂(NA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)、LB琼脂(LB)、梭菌培养基(RCM)、King培养基和MRS琼脂。培养基根据制造商的建议准备，并倒入直径85mm的预灭菌塑料培养皿中。

对于批次A和B，制备连续10倍稀释至10-6。对于每种培养基类型，制备用100μL溶液接种的重复板，用水作为对照。然后将板储存在25℃孵育器中并每天检查生长情况。将板保存在培养箱中长达10天，以确保不遗漏任何缓慢生长的生物体。

基于形态选择来自每种培养基类型的各个菌落，并通过划线分离到新的板上。将分离群重新划线并分离3次，以确保获得纯培养物。

通过16S rRNA的扩增和测序鉴定细菌

通过从板中取出1μL环的细菌并将其置于含有0.5mm玻璃珠和150μL无菌水的1.5mL微量离心管中，从每个菌株中提取DNA。将管置于沸水中10分钟。加热后，将管置于珠打浆机中2分钟，然后以14，000rpm离心2分钟。然后将含有DNA的上清液用作聚合酶链反应(PCR)的模板。在含有引物对27F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO：5)和1492R，GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO：6)的50μL终体积中进行16S rRNA的扩增。运行1％琼脂糖凝胶以检查反应产物。使用DNA清洁和浓缩器(Zymo Research Corporation，Irvine，CA，USA)纯化PCR产物。

表1

实施例8-使用无细胞上清液组合物促进大豆种子萌发

在各种稀释度(1/25、1/50、1/100和1/1000)下，在最佳和盐胁迫条件下大豆种子萌发上评估包含IN-M1或IN-M2的微生物培养物及其无细胞上清液(CFS)组合物。实验在含有2张滤纸(Whatman#8，Fisher Scientific，Canada)的培养皿中进行，并在每个培养皿中使用7mL溶液。通过将微生物培养物以13,000rpm离心至少10分钟获得无细胞上清液(CFS)组合物。然后通过移液管或倾析取出CFS组合物并且过滤灭菌以除去上清液中任何可能的细菌细胞。在无菌蒸馏水(最佳条件实验)或100mM盐水溶液(盐度胁迫条件)中制备微生物培养物及其CFS组合物的多个稀释度。每个培养皿中有10个均匀的大豆(RR2Y)种子。将板在温度22±1℃下孵育。在盐度实验的情况下，将微生物培养物及其CFS组合物在盐水溶液(100mM NaCl)中稀释。

应注意的是，尽管所有能够萌发的种子在测定的接近最佳条件下可能最终会萌发。但是，在野外条件下，情况是非常不同的。野外环境复杂，涉及范围更广泛的胁迫和各种土壤生命形式(昆虫、真菌、细菌)；不希望受到理论的约束，种子作物较慢出苗意味着幼苗出苗较少。这导致较少的群体(站立数)，许多农学研究表明，站立数与最终产量之间存在一般的相关性。如果生长季节的条件接近完美，那么初始低站立数的作物可能能够弥补这一点，并在季节结束之前弥补差距。然而，“正常”年份不是接近完美的，较小的初始站立可能导致较小产量。

无细胞上清液组合物

非胁迫(最佳)条件

来自各IN-M1或IN-M2微生物培养物的无细胞上清液组合物的1/100和1/50稀释度在整个实验中显示出更快的萌发率直到67小时，在40小时达到多达15％(图19)。生物学效应似乎是稀释度依赖性的；也就是说，效果在1/100和1/50之间是最佳的，在较低的稀释度1/25和较高的稀释度1/1000处次佳。

盐胁迫条件(100mM NaCl)

在盐胁迫条件下，用源自无细胞培养物的IN-M1或IN-M2微生物培养物处理的胁迫种子表现出多至31小时的类似的萌发率延迟(图20)。此后，相对于盐胁迫对照(红色：C-S)，无细胞上清液组合物的所有稀释度显示出在整个实验中保持的萌发率的初始增加；使用1∶50稀释度看到的主要差异类似于上述非胁迫样品。

微生物培养物组合物

非胁迫(最佳)条件

用来自IN-M1或IN-M2的微生物培养物的1/1000、1/100和1/50稀释液处理的种子从实验开始显示出更快的萌发率，在30小时达到约15％的增加(图21)。

盐胁迫条件(100mM NaCl)

用来自IN-M1或IN-M2的微生物培养物(包括微生物)处理的样品表现出至31小时的类似的萌发率延迟；此后，相对于盐胁迫对照，所有稀释液显示出萌发率的初始增加(图22)。

总之，在大豆的种子萌发率中观察到15-20％的剂量依赖性增加；这种增加也存在于胁迫条件下。种植时处理一次的草坪草苗在没有肥料的情况下在3-4周时间内表现出早期生物量增加20-30％，证明了在土壤中萌发后早期芽的活力(强劲)。在无细胞培养液中诱导的非生物胁迫实验室条件下，观察到在67小时内萌发率为15％的剂量依赖性影响。

数据进一步表明，生物刺激作用可能与萌发活动的离散时间段有关。例如，这些数据表明，在所研究的条件下，在萌发研究开始后约24小时时，萌发的生物刺激活性有一个初始峰或激增，然后当在最佳条件下进行萌发研究时，在约30-36小时出现萌发的生物刺激的第二峰或激增。当在胁迫条件(例如，100mM NaCl)下进行萌发研究时，萌发活性的第二峰转移到约42-48小时。在本文所述的萌发研究中观察到上述萌发活性峰或激增的存在与植物中的具体结果相关。因此，当如本文所述测定萌发活性时，CSF组合物与或萌发活性的两个峰或激增相关，当生长的植物如大豆和玉米使用CSF组合物时，观察到以下结果：

1.在温室或实验室种植的植物中生物量增加；

2.在温室或田间试验中种植的植物中叶面积增加(约10-15％)；以及

3.从温室或田间试验中种植的植物收获的叶干重增加(约10-15％)，即细胞质量的增加。

因此，如本文所述，萌发活性的体外或培养皿测定方法可用于评估用于期望生物刺激活性的CSF组合物。具体地说，发生在萌发后的萌发活性的功能活性“发生在从二次发酵到种子的CSF施用后的限定时间，例如大约100粒种子的测试批次中的大豆种子与植物中的生物刺激活性相关其中应用了CSF，例如叶片生物量、叶面积和芽生物量的增加。

实施例9-减少草地的碳足迹

在城市和郊区环境中，功能性土壤-植被系统通过与大气层交换温室气体、能量和颗粒物对全球和城市气候规模起决定性的作用。已经在高尔夫球场草坪和住宅草坪上进行了草地实地研究。不希望受到理论的约束，这些数据表明，当将无细胞上清液组合物添加到可持续的草坪管理程序中时，绿地人员(greens man)或景观设计者可以在3年内将合成肥料的量降低多达50％，而无营养胁迫的迹象。设计了以下实验，以验证是否可以减少草坪和高尔夫球场的碳足迹，而不会牺牲草皮的种子萌发率或强度(生物量)。

每个样品盆通过剪切至4厘米来同步，一周后用剪刀收获，以剪切自4厘米水平生长的草。收获10盆中的草并称重，计算平均湿重。表2示出了在标准花园土壤中生长的剪股颖(本特草)。用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物进行单次处理使得测量的6周幼苗的湿生物量与水对照相比增加21％，与培养基相比增加10％(图23)。6周时期内两次IN-M1处理幼苗表现出与幼苗样品2相比与水对照相比湿生物量降低8％，与培养基对照计算相比降低17％。6周时期内三次IN-M1处理幼苗保持了升高的湿生物量，与水对照相比升高29％，与培养基相比升高17％。

表2

表3示出了在花园土壤中生长并在土壤中混合有额外的机物质肥料时的剪股颖。用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物单次处理使得测量的6周幼苗的湿生物量与水对照相比增加40％，与培养基相比增加33％(图24)。6周时期内三次IN-M1处理的幼苗表现为与每一对照样品相比湿生物量降低6％。6周时期内两次IN-M1处理的幼苗表现为与幼苗样品2相比与每一对照样品相比湿生物量降低7％。

表3

表4示出了生长在标准花园土壤中的第二种草(草地早熟禾)，以观察两种不同草种的结果是否类似。与仅用水相比，用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物单次处理表现为湿生物量增加8％，这等效于在对照2培养基中观察到的增加(图25)。在6周时期内三次IN-M1处理的幼苗表现出与水对照相比湿生物量增加12％，与培养基相比增加3％。在6周时期内两次IN-M1处理的幼苗继续表现出与幼苗样品2(3次处理)相比与水对照相比湿生物量增加9％，与培养基中相比增加8％。

表4

这些研究是从播种到6周龄的幼苗，因此在萌发期和前6周的生长过程中，反映了IN-M1对植物的处理。表2中的结果证实了原始实验室观察，当接种在没有肥料的花园土壤中但是用包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物处理时，剪股颖(本特草)生物量发育增加。

生物量发育可能是物种特异性的(见表2和表4)。具体来说，在剪股颖幼苗发育阶段，在6周内没有合成施肥的三种处理似乎保持了生物量发育的增加。在草地早熟禾(肯塔基蓝草(Kentucky Blue Grass))中，在这个阶段的幼苗发育期间，在6周内没有合成施肥的两种处理似乎显示出最大的生物量发育。

不希望受到理论的约束，这些数据表明幼苗和芽的早期发育是健壮的，不受缺乏化学肥料的影响。然而，实验结果(表3)表明，如果添加额外的有机肥料，则在6周内增加和维持生物量发育。这些结果在幼苗中，可能无法验证田间结果，肥料的减少(20-50％)不会影响已建立成熟的草皮的活力。不希望受理论的约束，这些结果表明，在标准园林土壤混合物中生长的2草皮草物种的草苗能够萌发，并且在不使用合成化学肥料的情况下表现出强壮的芽发育。

小麦、玉米和稻都是草，是全世界食物的主要来源。使用化学品和农药对碳排放有相当大的影响。此外，切换草和其他生物燃料原料草(包括玉米)需要在较少的碳足迹下生长，以使化石燃料的变化有意义。不希望受理论的约束，这些数据表明，尽管缺乏化学肥料，对两种草皮草物种的萌发和早期芽发育有积极的影响。

实施例10-增加生物量发育

在南卡罗来纳州萨默维尔(2013年3月29日)的种植季节开始时开始对照实验，比较使用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合对唐莴苣(Swiss Chard)生长的影响。将唐莴苣种子(25×2)种植在用于萌发的群落盆中。对照植物仅施用20-20-20肥料；试验组用20-20-20肥料处理，并用1GS浇灌。

在2013年4月4日播种6天后将幼苗移植到花园土壤床上。移植后，将1GS幼苗的根浸在GS的1∶50的水稀释液中；种植孔也用相同的产品稀释液处理。两组并肩并排。

移植后，根据需要每周浇灌植物大约一次。此时，IN-M1测试植物用1至100的产品与水的比例的IGS喷雾浇灌。

测量五株植物，记录植物的平均高度和宽度。由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物处理的植物表现出显著更强的生长。表5示出在移植当天(播种后6天)、播种后15天和40天取得的平均测量值，表明在播种后40天，虽然对照组植物测量的平均高度为12英寸，宽度为15英寸，但IN-MI处理的植物的平均高度为20英寸和宽度为25英寸。

表5

在第40天(2013年5月14日)收获唐莴苣。图26示出了通过高度、宽度和叶数测量的生物量指示的改善的植物生长。

实施例11-使用组合物和方法对观赏植物进行生物刺激

Brookgreen Botanical的园艺组于2013年3月初种植了风信子。将鳞茎分为两批，一批在种植前和生长期间用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物处理，而对照组不处理。两组并排种植在植物园的三个地点。处理后的植物几乎全部在种植后28天开花，平均高度为6.6英寸；而未处理的组主要表现为叶，花朵很少，大部分芽深埋在叶簇中，平均高度为3.7英寸。不希望受理论的约束，这些数据表明由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物可能对观赏植物具有生物刺激作用。

在2013年3月7日种植60个风信子鳞茎。30个鳞茎浸泡在由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物中，1份由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物和100份水。种植处理的鳞茎的土壤在种植前浸透至4英寸深。根据需要，处理的植物用由包含IN-M1的微生物培养物制备的无细胞上清液组合物与水的1∶100稀释液浇灌。

对照组与处理的鳞茎种植在相同的位置。将对照组土壤浇灌至4英寸深，并与处理组同时对植物浇灌。定期监测两组风信子鳞茎的进展；记录芽的萌发，叶的高度和开花的频率。在每个位置监测十个鳞茎。

研究结果如下表6所示。处理组叶萌发发生在种植后平均6.1天；而在对照组，萌发发生在种植后平均7.7天；萌发21％的加速。在28天期间，相对于对照组，经处理的植物叶片持续表现出加速生长。在每个位置，经处理鳞茎中的开花与对照组相比加速。在风信子鳞茎的春季种植中证明了显著的影响；记录加速的萌发和高度的差异，以及早期的花发育。

表6

实施例12-无细胞上清液组合物对草莓植物生长和生产的影响

进行研究以测试IN-M1无细胞上清液(批号EA 130129-2)对草莓生长和生产的影响。

方法：田间总面积为522.6m²(5,625平方英尺)，种植12排，每排650株植物，间隔约15cm(6英寸)。每次处理的200个阿尔比恩草莓幼苗在种植在单排田地中间(4至6排)，每排的两端种植50个对照植物(用水预处理)。在这个田间试验中应用了施用九种不同处理。

草莓幼苗从新斯科舍(Nova Scotia)收到并且保持在4℃。在种植前一天，将幼苗浸入6升1/40稀释的IN-M1无细胞上清液(批号EA 130129-2)中。将幼苗首先完全浸没在处理溶液中，然后将根浸泡4小时。对照植物用水处理。种植后两个半月，通过将每株植物灌注约30ml相应的处理物来对植物进行重新处理。

草莓幼苗手工种植在加拿大安大略省兰贝斯(Lambeth，Ontario，Canada)的一个农场。土壤每周用4.5公斤(10磅)的等量硝酸钙和硝酸钾施肥。通过测量叶绿素含量、叶高和宽度，在种植后第6周和第11周监测植物生长。

在第11周期间，收获季节开始，在约两个月中每隔两天由农民收集果实。每次收获后，对每种处理的果实称重，将结果记录到A&L Biologicals中。

使用SAS程序和一般线性模型(GLM)程序分析数据。该程序给出三种不同的统计检验结果，包括T检验、邓肯多差距试验(Duncan′s Multiple Range Test)和杜凯氏差距检定(Tukey′s Studentized Range)。

结果：种植后6周，监测植物生长，用IN-M1上清液处理的草莓幼苗和对照幼苗表现出类似的生长生理学。使用SPAD 502叶绿素计(测量面积＝2mm×3mm，Konica)测定叶绿素含量。由SPAD 502叶绿素计确定的值指示草莓植物叶中存在的叶绿素的相对量。从每种处理的40株植物的3片叶中取叶绿素读数。随机挑选植物。对照或IN-M1无细胞上清液处理的植物之间无统计学差异(图27)。

随机抽取每种处理的四十株植物，测定每株植物的4片叶的叶片宽度和高度。图28A和28B中的数据表明，用IN-M1无细胞上清液处理的植物的叶宽度和高度均分别明显大于对照叶(p＜0.0001)。这些结果表明IN-M1无细胞上清液刺激植物生长。

种植后11周，如上所述测量叶高和宽度。然而，在这个时间点，在处理植物和对照植物之间没有发现统计学上显著的差异。

在第11周期间，收获季节开始，然后每隔两天收集果实。图29示出了对照和接种物处理的植物之间果实产量的随时间的比较。一般来说，在整个季节期间，处理的植物产生高于对照植物的产量，随着时间的推移，产量保持更一致。最终收获(第19周)后收集的数据显示，IN-M1无细胞上清液处理的植物产生42.9千克(94.63lbs)，而对照植物产生32.8千克(72.23lbs)(图30)。这表明产量增加了31％。

本研究中的数据表明，在种植之前用IN-M1无细胞上清液处理草莓幼苗在早期阶段改善植物生长，并且更重要的是，与对照植物相比草莓产量提高31％。预期用其他公开的组合物(包括IN-M2无细胞上清液)进行处理具有类似结果。

实施例13-无细胞上清液组合物对温室玉米生长和产量的影响

进行研究以测试IN-M1无细胞上清液对温室玉米生长和产量的影响。

方法：本研究利用每盆4株玉米植物，每种处理4个重复。将植物种植在具有Hogrens肥料(1/2强度)的ProMix土壤中。处理如下：剂量1，1∶100稀释的IN-M1无细胞上清液施加5次(剂量1：幼苗期)；剂量2，第一次施用后1周；剂量3，第一次施用后3周；剂量4，第一次施用后6周；以及剂量5，第一次施用后9周。在最终收获时，每株植物的所有叶用于叶面积测量。

结果：数据表明，与对照植物相比，用1∶100稀释的IN-M1无细胞上清液处理的玉米植物从土壤中萌发平均增加20％。此外，在实验结束时，与对照植物相比，经处理的植物的植物高度平均增加17％。虽然与对照植物相比，每个经处理植物的叶数没有增加，但是与对照植物相比，经处理植物的叶面积(11％增加)和干生物量(12％增加)增加。

实施例14-无细胞上清液组合物对田间条件下的玉米植物生长和产量的影响

进行了研究以测试IN-M1无细胞上清液对田间条件下温室玉米生长和产量的影响。

方法：植物在播种时用1∶100稀释的IN-M1无细胞上清液给药，保持潮湿直到移植到田间。移植到田间后，每周进行一次1∶100稀释的IN-M1无细胞上清液的叶面施用。

结果：经处理植物表现出在第15天萌发增加20％。具体地，处理组在第15天具有64％的萌发，相对于对照组在第15天具有44％的萌发。叶发育进展数据(种植后6-43天时期)的数据示出在图31中。数据显示，经处理植物叶片发育进展中移动到下一叶的曲线的前沿比对照更快。

实施例15-无细胞上清液组合物对田间条件下大豆植物生长和产量的影响

进行了研究以测试IN-M2无细胞上清液对温室玉米生长和产量的影响。该研究是在加拿大魁北克蒙特利尔麦吉尔大学Lods农学研究中心(Lods Agronomy ResearchCentre，McGill University，Montreal，Quebec，Canada)进行。在3叶片作物阶段将IN-M2无细胞上清液作为叶面喷雾剂喷洒，并在季节结束时评估作物产量。叶面喷雾剂包含除草剂(NufarmNufarm Agriculture，Inc.，Calgary，Alberta，Canada；以有效量2.5Lha^-1施用)和微量营养素制剂(CropAxter Agroscience，Inc.，Mont St-Hilaire，Quebec，Canada；以有效量2L ha^-1)施用，如下表所示。下表7和表8分别为2013年和2104年两个不同生长季的产量。

表7

表8.

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围或精神的情况下，可以对本公开进行各种修改和变化。通过考虑本文公开的本公开的说明书和实践，本公开的其他方面对于本领域技术人员将是显而易见的。意图是说明书和实施例仅被认为是示例性的，本公开的真实范围和精神由所附权利要求指示。

Claims

1.一种组合物，其包含用分离的混合微生物组合物接种的微生物培养物的无细胞上清液，所述分离的混合微生物组合物由ATCC专利保藏号PTA-12383的IN-M1或ATCC专利保藏号PTA-121556的IN-M2的分离的微生物组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述无细胞上清液是过滤灭菌的。

3.根据权利要求1所述的组合物，其还包含除草剂。

4.根据权利要求1所述的组合物，其还包含杀虫剂。

5.根据权利要求1所述的组合物，其还包含杀真菌剂。

6.根据权利要求1所述的组合物，其还包含液体营养液。

7.根据权利要求1所述的组合物，还包含至少一种分离的菌根真菌。

8.一种组合物，其包含农学上可接受的载体和有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的无细胞上清液组合物。

9.一种增强植物生长的方法，其包括向种子、向植物、向特定生长阶段的植物或其组合提供根据权利要求1-7中任一项所述的无细胞上清液组合物或根据权利要求8所述的组合物，从而增强植物生长。

10.根据权利要求9所述的方法，其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的种子施用所述无细胞上清液。

11.根据权利要求9所述的方法，其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的根施用所述无细胞上清液。

12.根据权利要求9所述的方法，其中提供所述无细胞上清液组合物包括向植物的叶或茎施用所述无细胞上清液。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物在温室中生长。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物在田间生长。

15.根据权利要求9所述的方法，其中增强植物生长是增加叶面积或干生物量。

16.一种用于制备无细胞上清液组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)用分离的混合微生物组合物接种发酵液，所述分离的混合微生物组合物由ATCC专利保藏号PTA-12383的IN-M1或ATCC专利保藏号PTA-121556的IN-M2的分离的微生物组成；

(b)孵育接种的发酵液；以及

(c)从所述接种的发酵液中移除基本上所有微生物；

从而提供无细胞上清液。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述移除步骤包括在步骤(b)之后将所述培养物以至少14,000×g的离心力离心至少10分钟。

18.根据权利要求16所述的方法，其还包括步骤(d)对所述无细胞上清液进行灭菌。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述灭菌是过滤灭菌。

20.一种无细胞上清液组合物，其通过根据权利要求16所述的方法制备。