CN113573586A - 对番茄进行防番茄细菌性溃疡病菌的生物保护的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有针对番茄细菌性溃疡病菌(“Cmm”)的抗微生物活性的组合物。本文还提供了制备和使用该抗微生物组合物以保护和处理番茄免受Cmm感染的方法。
Description
1.背景
番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，“Cmm”)是一种革兰氏阳性的需氧植物病原性细菌并且引起番茄萎蔫病和溃疡病(wilt andcanker disease)，该病害是最具破坏性且在经济上重要的番茄病害之一。Cmm可以通过几种不同的感染途径感染番茄植株。主要的接种源通常是感染的种子、移植物、土壤中残留的植物物质以及操作工具和设备。植物的继发感染由通过根、叶的病原体传播和栽培措施而引起。特别是，被感染的种子被认为是病害暴发和Cmm传染的主要来源。在有利的条件下，即使从种子到幼苗的传播率低也可能导致严重的病害流行。由于产量和经济损失严重，Cmm被认为是检疫病原体。
感染了Cmm的番茄植株表现出多种症状。通过毛状体、伤口或天然开口(如气孔和排水器)进入植物的病原体导致局部感染，最初的症状表现为小叶边缘坏死，出现干枯并向上卷曲。坏死区域逐渐扩大，导致叶片枯萎。病原体还可通过根或茎的伤口侵入木质部组织，并在整个植株中传播，从而引起全株感染。Cmm引起的木质部导管全株感染导致典型病害症状的出现，这些症状的形式为单侧枯萎、小叶坏死、导管变色、茎上出现溃疡病变，以及最终的植物死亡。果实表面的细菌感染显示出带有被称为“鸟眼(bird’s-eye)”的白色圆斑的典型点状病斑，这些果实产生的种子可能被Cmm污染。植物发育后期的感染导致无症状感染，从而产生导致被污染种子，这是商业化番茄生产中Cmm病害暴发的主要来源。该病原体可以在土壤中的植物残渣上存活长达3年，并且可以感染种子和幼苗/植物。
对Cmm进行控制具有挑战性。不幸的是，抗性或高度耐受性的番茄品种仍然不能用于商业生产，并且没有有效的方法来控制番茄的Cmm。链霉素和铜的施用已显示减少植物的Cmm附生种群和病害症状。然而，抗生素和铜基化合物的施用被认为导致病原体抗性和植物毒性作用的发展，因此引起了安全性和环境问题。已经提出使用来自噬菌体的内溶素对Cmm进行专门裂解作为控制Cmm的替代方法；但是，它尚未得到广泛实施。
因此，需要一种保护番茄免受Cmm侵害的安全有效的方法和组合物。
2.发明内容
本发明涉及一种保护番茄免受cmm侵害的新型组合物以及制备和使用该组合物的方法。
具体地，一方面，本发明提供了保护番茄免受Cmm侵害的方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的包含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的细菌培养物施用于番茄植株，其中所述番茄植株暴露于Cmm，其中所述有效量足以对番茄植株进行防Cmm的生物保护。
在一些实施方式中，细菌培养物包含接种有短小芽孢杆菌的培养基。
在一些实施方式中，在施用步骤之前将细菌培养物装瓶。在一些实施方式中，将细菌培养物与短小芽孢杆菌一起孵育3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天，然后装瓶。在一些实施方式中，将细菌培养物与短小芽孢杆菌在25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育，然后装瓶。
在一些实施方式中，培养基是LB肉汤。
在一些实施方式中，细菌培养物包含微球菌素P1。在一些实施方式中，细菌培养物包含浓度高于100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L、500μg/L、600μg/L、1000μg/L或5000μg/L的微球菌素P1。在一些实施方式中，微球菌素P1由短小芽孢杆菌产生。
在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，所述微生物混合物包含副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candidautilis)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，其中所述微生物混合物是通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生的。在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)的不同细菌培养物混合。
在一些实施方式中，番茄植株根植于盆中或田地中。
在一些实施方式中，细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，将细菌培养物施用于番茄植株以使在番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。
在一些实施方式中，将细菌培养物施用于番茄植株的根、叶或茎。
在一些实施方式中，有效量足以降低番茄植株的组织中的Cmm浓度。在一些实施方式中，在施用步骤后10天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后21天时测量的Cmm浓度低于109CFU/g。番茄植株的组织可以是根、茎或叶。
本发明的另一方面提供了保护番茄的方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的包含枯草芽孢杆菌的细菌培养物施用于番茄植株，其中所述番茄植株暴露于Cmm，其中所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
在一些实施方式中，细菌培养物包含接种有枯草芽孢杆菌的培养基。
在一些实施方式中，在施用步骤之前将细菌培养物装瓶。在一些实施方式中，将细菌培养物与枯草芽孢杆菌一起孵育3-20天、5-15天、5-10天，6-8天或7天，然后装瓶。在一些实施方式中，将细菌培养物与枯草芽孢杆菌在25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育，然后装瓶。
在一些实施方式中，培养基是LB肉汤。
在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，所述微生物混合物包含副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌。在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，其中所述微生物混合物是通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生的。在一些实施方式中，在将细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将细菌培养物与包含短小芽孢杆菌的不同细菌培养物混合。
在一些实施方式中，番茄植株根植于盆中或田地中。
在一些实施方式中，细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的枯草芽孢杆菌。一些实施方式中，将细菌培养物施用于番茄植株以使在番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。
在一些实施方式中，将细菌培养物施用于番茄植株的根、叶或茎。
在一些实施方式中，有效量足以降低番茄植株的组织中的Cmm浓度。在一些实施方式中，在施用步骤后10天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后21天时测量的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后10天或21天时测得的Cmm浓度低于108CFU/g。番茄植株的组织可以是根、茎或叶。
本发明的另一方面涉及用于处理Cmm的组合物，所述组合物包含：有效量的微球菌素P1；以及农业上可接受的载体，其中所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
在一些实施方式中，农业上可接受的载体选自由培养基、培养基的过滤级分或微生物培养物的过滤级分组成的组。
在一些实施方式中，农业上可接受的载体包含接种有短小芽孢杆菌的培养基。
在一些实施方式中，将培养基瓶装。在一些实施方式中，在瓶装之前，将培养基与短小芽孢杆菌一起孵育3-20天，5-15天，5-10天，6-8天或7天。在一些实施方式中，在瓶装之前，将培养基与短小芽孢杆菌在25-37℃，28-35℃，28-32℃或30℃孵育。
在一些实施方式中，该组合物还包含枯草芽孢杆菌。
在一些实施方式中，该组合物还包含微生物培养物的过滤级分。在一些实施方式中，该组合物不包含微生物培养物的过滤级分。
在一些实施方式中，微生物培养物包含副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌。在一些实施方式中，所述微生物培养物是通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生的。
在一些实施方式中，微球菌素P1的有效量高于100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L、500μg/L、600μg/L、1000μg/L或5000μg/L
在一些实施方式中，该组合物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，该组合物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的枯草芽孢杆菌。
在一些实施方式中，该组合物还包含铜或铜合金。
一方面，本发明提供了保护番茄免受Cmm侵害的方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的本发明的组合物施用于番茄植株，其中将番茄植株暴露于Cmm，其中所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
3.附图说明
图1提供了Cmm培养平板的图片，板上滴有一滴枯草芽孢杆菌培养物(左)和一滴短小芽孢杆菌培养物(右)。
图2A提供了短小芽孢杆菌培养物纯化提取物的HPLC色谱图，保留时间为8.140分钟。图2B提供了标准微球菌素P1的HPLC色谱图，保留时间为8.115分钟。
图3A提供了来自短小芽孢杆菌培养物的具有各种添加物的纯化的微球菌素P1的LC-MS色谱图。图3B提供了具有各种添加物的标准微球菌素P1的LC-MS色谱图。
图4A提供了来自短小芽孢杆菌培养物的纯化提取物的ESI-MS谱。图4B提供了标准微球菌素P1的ESI-MS谱。
图5提供了微球菌素P1的化学结构。
图6提供了Cmm培养平板的图片，板上滴有数滴含有微球菌素P1的短小芽孢杆菌培养物的部分纯化提取物。
图7提供了各种浓度的微球菌素P1对Cmm的抗菌活性。
图8提供了来自Cmm、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的提取DNA样品中CelA基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。将样品上样，一式两份(1和2)。
图9是从叶组织样品扩增的CelA基因的实时PCR标准曲线。
图10是从茎组织样品扩增的CelA基因的实时PCR标准曲线。
图11是从根组织样品扩增的CelA基因的实时PCR标准曲线。
图12A提供了实验I中通过实时PCR在叶组织样品中检测的CelA基因，该叶组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。图12B提供了实验II中通过实时PCR在叶组织样品中检测的CelA基因，该叶组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。
图13A提供了实验I中通过实时PCR在茎组织样品中检测的CelA基因，该茎组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。图13B提供了实验II中通过实时PCR在茎组织样品中检测的CelA基因，该茎组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。
图14A提供了实验I中通过实时PCR在根组织样品中检测的CelA基因，该根组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。图14B提供了实验II中通过实时PCR在根组织样品中检测的CelA基因，该根组织样品来自用Cmm处理(“Cmm”)，用Cmm和短小芽孢杆菌(“Bp”)处理，用Cmm和枯草芽孢杆菌(“Bs”)处理或用Cmm和短小芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌(“Mix”)处理的番茄(表6)。
这些附图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施方式。本领域的技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文描述的本发明的原理的情况下，可以采用本文所示的结构和方法的替代实施方式。
4.具体实施方式
4.1定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，术语“微生物”包括但不限于：细菌；病毒；真菌；藻类；酵母；原生动物；蠕虫；螺旋体；包含在分类纲目如原核生物、真核生物、古细菌和细菌中的单细胞和多细胞生物；以及本领域技术人员已知的那些。
如本文所用，术语“抗微生物的”是指降低或消除活性微生物的(相对)数量或降低微生物感染的病理结果的功效或活性(即试剂或提取物的功效或活性)。如本文所用，“抗微生物剂”是指预防或减少由病原性微生物引起的植物的体外和/或体内感染或损伤的生物保护剂。抗微生物剂包括但不限于抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂。
如本文所用，术语“载体”是指“农业上可接受的载体”。“农业上可接受的载体”意指可用于向植物、植物部分(例如种子)或土壤递送如本文所述的微生物组合物、农业有益成分、生物活性成分等的任何材料，并且优选地，该载体可以在不对植物生长、土壤结构、土壤排水等造成不利影响的情况下添加(添加到植物、植物部分(例如种子)或土壤中)。
如本文所用，术语“有效量”是指其使用时产生期望效果的剂量或量。在本方法的上下文中，有效量是通过其抗微生物活性而对于生物保护有效的量。
如本文所用，术语“足量”是指足以产生期望效果的量。具体地，如本文所用，术语“足以防Cmm的生物保护的有效量”是指足以进行防与Cmm感染相关的病理症状的生物保护的剂量或量。
如本文所用，术语“Cmm相关的病理症状”是指在感染了Cmm的番茄中检测到的各种症状。症状包括但不限于小叶坏死、叶子枯萎、叶子上出现水泡样斑点、茎上枯萎和溃疡、导管变色和植物死亡。症状还包括在被Cmm污染的果实表面和种子上带有被称为“鸟眼”的白色圆斑的点状病斑。Cmm感染也可能导致番茄总产量或适销性产量下降。
术语“生物保护剂”是指与处于类似环境中的未经处理的对照植物相比能够增强植物的抗微生物活性、植物的杀线虫活性、减少由植物病原体的作用引起的病理症状或病斑的任何组合物。除非另有明确说明，否则生物保护剂可以由单一成分或数种不同成分的组合组成，并且增强的抗微生物活性可以归因于一种或多种成分，这些成分独立地或组合地起作用。
术语“菌株”通常是指相同物种的封闭生物种群。因此，术语“乳酸菌菌株”通常是指乳酸菌物种的菌株。更具体地，术语“菌株”是指微生物物种的成员，其中这样的成员(即菌株)具有不同的基因型和/或表型。在本文中，术语“基因型”涵盖微生物的基因组和重组DNA所含之物以及微生物的蛋白质组学特征和/或代谢组学特征及其翻译后修饰。在本文中，术语“表型”是指取决于微生物的遗传构成的可观察的物理特性。如本领域技术人员将认识到的，微生物菌株因此由具有共同基因型和/或表型的独特的微生物细胞组成。此外，独特的微生物细胞可以具有特定特征(例如，特定的rep-PCR模式)，该特定特征可以将它们鉴定为属于其特定菌株。微生物菌株可以包含微生物的一种或多种分离株。
如本文所用，术语“暴露于Cmm的番茄植株”是指如下的番茄植株，所述番茄植株：(1)具有含至少103CFU/g Cmm的组织，(2)曾经具有含至少103CFU/g Cmm的组织，(3)从感染了Cmm的种子中生长，(4)从来自亲本番茄植株的种子中生长，其中该亲本番茄植株具有含至少103CFU/g Cmm的组织，(5)种植在含至少103CFU/g Cmm的土壤中，或(6)种植在土壤中的植物，其中根植于土壤中的植物具有至少103CFU/g的Cmm。该术语还包括如下的番茄植株，所述番茄植株：(1)具有Cmm感染相关的至少一种症状，(2)曾经具有Cmm感染相关的至少一种症状，(3)从具有Cmm感染相关的至少一种症状的种子中生长，(4)从来自亲本番茄植株的种子中生长，其中该亲本番茄植株具有Cmm感染相关的至少一种症状，或(5)种植在土壤中，其中根植于土壤中的植物具有Cmm感染相关的至少一种症状。
如本文所用，术语“暴露于Cmm的土壤”是指如下的土壤：(1)先前根植于该土壤中的植株表现出Cmm相关的病理症状；(2)当前生根于该土壤中的植株表现出Cmm相关的病理症状；或(3)将会根植于该土壤中而未经任何抗微生物处理的番茄植株预期表现Cmm相关的病理症状。
4.2其他解释约定
本文所列举的范围应被理解为该范围内所有值的简写形式，其包括所列举的端点。例如，1到50的范围应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组中的任何数字、数字的组合或子范围。
除非另有说明，否则对具有一个或多个立体中心的化合物的提及是指每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。
4.3用于对番茄进行防Cmm的生物保护的抗微生物组合物
在第一方面，提出了用于保护番茄免受Cmm侵害的组合物。在一些实施方式中，该组合物包含细菌培养物，该细菌培养物包含被证明对抑制Cmm活性有效的一种或多种芽孢杆菌菌株，例如短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。该组合物可包含短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两者。在一些实施方式中，该组合物包含短小芽孢杆菌的细菌培养物、枯草芽孢杆菌的细菌培养物或短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两者的细菌培养物。
在一些实施方式中，该组合物包含来自芽孢杆菌菌株的粗提取物。具体地，该组合物可以包含来自短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的粗提取物。在一些实施方式中，该组合物包含来自短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两者的粗提取物。在一些实施方式中，该组合物包含来自短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或这两者的粗提取物的纯化级分。
在一些实施方式中，该组合物包含微球菌素P1作为活性组分。在一些实施方式中，微球菌素P1由细菌产生。在其他实施方式中，使用化学合成的微球菌素P1。
在一些实施方式中，该组合物还包含农业上可接受的载体。在一些实施方式中，该组合物包含微生物培养物的无细胞上清液作为农业上可接受的载体。
4.3.1活性组分
4.3.1.1短小芽孢杆菌
在一些实施方式中，用于对番茄进行防Cmm的生物保护的组合物包含细菌培养物，所述细菌培养物包含短小芽孢杆菌。可以通过接种和培养短小芽孢杆菌来获得包含短小芽孢杆菌的细菌培养物。
在本发明的各种实施方式中使用的短小芽孢杆菌可以是经鉴定与SEQ ID NO:4的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％同一性的细菌菌株。在一些实施方式中，使用短小芽孢杆菌菌株NES-CAP-1(GenBank登录号MF079281.1)。
在本发明的各种实施方式中使用的短小芽孢杆菌可以是经API测试鉴定与“短小芽孢杆菌”具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％同一性的细菌菌株。
在本发明的各种实施方式中使用的短小芽孢杆菌可以是经鉴定表达微球菌素P1的短小芽孢杆菌菌株。可以使用本领域已知的各种方法(例如液相色谱(HPLC)和质谱)来测试微球菌素P1的表达。在一些实施方式中，基于微球菌素P1的表达水平选择短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，当短芽孢杆菌菌株在培养基中孵育3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天时可以表达至少100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L、500μg/L、600μg/L、1000μg/L或5000μg/L的微球菌素P1时，选择该短小芽孢杆菌菌株。
在一些实施方式中，基于短小芽孢杆菌抑制琼脂平板上Cmm的活性或生长的能力来选择短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于短小芽孢杆菌提取物抑制琼脂平板上的Cmm的活性或生长的能力来选择短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于短小芽孢杆菌保护盆中的番茄免受Cmm侵害的能力来选择短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于短小芽孢杆菌保护田地中的番茄免受Cmm侵害的能力来选择短小芽孢杆菌。
保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过比较在使用和不使用短小芽孢杆菌处理的情况下Cmm相关的番茄的损伤来确定。保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过目测检查在使用和不使用短小芽孢杆菌处理的情况下的番茄来确定。保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过测量在使用和不使用短小芽孢杆菌处理的情况下来自番茄植株的组织的Cmm特异基因的量来确定。
在一些实施方式中，当短小芽孢杆菌菌株可以降低用短小芽孢杆菌处理的番茄植株中的Cmm浓度或Cmm特异基因的量时，选择该短小芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，当短小芽孢杆菌菌株可以将盆中或田地中的Cmm的浓度或与Cmm相关的Cmm特异基因的量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％时，选择该短小芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，当短小芽孢杆菌菌株可以将Cmm的浓度降低至低于1010CFU/g、109CFU/g、108CFU/g或107CFU/g时，选择该短小芽孢杆菌菌株。可在用短小芽孢杆菌菌株处理后至少5天、7天、10天、14天、21天、28天、40天或50天确定Cmm浓度或Cmm特异基因的量的降低。可在用短小芽孢杆菌菌株处理后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周确定Cmm浓度或Cmm特异基因的量的降低。
在一些实施方式中，当短小芽孢杆菌菌株可以将盆中或田地中的Cmm相关损伤降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％时，选择该短小芽孢杆菌菌株。
在一些实施方式中，通过将短小芽孢杆菌接种到培养基中来获得包含短小芽孢杆菌的细菌培养物。培养基可以是LB肉汤或本领域可获得的其他培养基。
在一些实施方式中，接种有短小芽孢杆菌的培养基可以在装瓶前孵育1天、2天、3-30天、3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天。在一些实施方式中，接种有短小芽孢杆菌的培养基可以在20-37℃、25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育。
在一些实施方式中，选择在施用1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、10-20μL、20-30μL、30-40μL、40-50μL、50-100μL、100-500μL、500-1000μL的细菌培养物时具有产生直径大于2mm的抑制区的能力的芽孢杆菌菌株。在一些实施例中，在孵育后测量时，抑制区的直径大于3mm、大于4mm、大于5mm、大于6mm、大于7mm、大于8mm、大于9mm、大于1cm、或大于1.5cm。可以在施用细菌培养物后1天、2天、3天、3-7天或5-10天测量直径。
在一些实施方式中，选择在施用1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、10-20μL、20-30μL、30-40μL、40-50μL或50-100μL的来自细菌培养物的粗提取物时具有产生直径大于2mm的抑制区的能力的芽孢杆菌菌株。在一些实施例中，在孵育后测量时，抑制区的直径大于3mm、大于4mm、大于5mm、大于6mm、大于7mm、大于8mm、大于9mm、大于1cm、或大于1.5cm。施用粗提取物后，可以在孵育1天、2天、3天、3-7天或5-10天后测量直径。
在一些实施方式中，所述组合物包含根据《布达佩斯条约》于2018年9月26日保藏在美国典型培养物保藏中心(Americal Type Culture Collection，ATCC)的短小芽孢杆菌菌株(“短小芽孢杆菌菌株ITI-1”或“ITI-1”)，
专利标识名为PTA-125304，ATCC账户号为200139。
4.3.1.2枯草芽孢杆菌
在一些实施方式中，用于对番茄进行防Cmm的生物保护的组合物包含细菌培养物，所述细菌培养物包含枯草芽孢杆菌。可以通过接种和培养枯草芽孢杆菌来获得包含枯草芽孢杆菌的细菌培养物。
在本发明的各种实施方式中使用的枯草芽孢杆菌可以是经鉴定与SEQ ID NO:5或6的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％同一性的细菌菌株。在一些实施方式中，使用枯草芽孢杆菌菌株BSFLG01(GenBank登录号MF196314.1)。在一些实施方式中，使用枯草芽孢杆菌菌株SSL2(GenBank登录号MH192382.1)。
在本发明的各种实施方式中使用的枯草芽孢杆菌可以是经API测试鉴定与“枯草芽孢杆菌”具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％同一性的细菌菌株。
在一些实施方式中，基于枯草芽孢杆菌抑制琼脂平板上Cmm的活性或生长的能力来选择枯草芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于枯草芽孢杆菌提取物抑制琼脂平板上的Cmm的活性或生长的能力来选择枯草芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于枯草芽孢杆菌保护盆中的番茄免受Cmm侵害的能力来选择枯草芽孢杆菌。在一些实施方式中，基于枯草芽孢杆菌保护田地中的番茄免受Cmm侵害的能力来选择枯草芽孢杆菌。
保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过比较在使用和不使用枯草芽孢杆菌处理的情况下Cmm相关的番茄的损伤来确定。保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过目测检查在使用和不使用枯草芽孢杆菌处理的情况下的番茄来确定。保护番茄免受Cmm侵害的能力可以通过测量在使用和不使用枯草芽孢杆菌处理的情况下来自番茄植株的组织的Cmm特异基因的量来确定。
在一些实施方式中，当枯草芽孢杆菌菌株可以降低用枯草芽孢杆菌处理的番茄植株中的Cmm浓度或Cmm特异基因的量时，选择该枯草芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，当枯草芽孢杆菌菌株可以将盆中或田地中的Cmm的浓度或与Cmm相关的Cmm特异基因的量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％时，选择该枯草芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，当枯草芽孢杆菌菌株可以将Cmm的浓度降低至低于1010CFU/g、109CFU/g、108CFU/g或107CFU/g时，选择该枯草芽孢杆菌菌株。可在用枯草芽孢杆菌菌株处理后至少5天、7天、10天、14天、21天、28天、40天或50天确定Cmm浓度或Cmm特异基因的量的降低。可在用枯草芽孢杆菌菌株处理后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周确定Cmm浓度或Cmm特异基因的量的降低。
在一些实施方式中，当枯草芽孢杆菌菌株可以将盆中或田地中的Cmm相关损伤降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％时，选择该枯草芽孢杆菌菌株。
在一些实施方式中，通过将枯草芽孢杆菌接种到培养基中来获得包含枯草芽孢杆菌的细菌培养物。培养基可以是LB肉汤或本领域可获得的其他培养基。
在一些实施方式中，接种有枯草芽孢杆菌的培养基可以在装瓶前孵育1天、2天、3-30天、3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天。在一些实施方式中，接种有枯草芽孢杆菌的培养基可以在20-37℃、25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育。
在一些实施方式中，选择在施用1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、10-20μL、20-30μL、30-40μL、40-50μL、50-100μL、100-500μL、500-1000μL的细菌培养物时具有产生直径大于2mm的抑制区的能力的芽孢杆菌菌株。在一些实施例中，在孵育后测量时，抑制区的直径大于3mm、大于4mm、大于5mm、大于6mm、大于7mm、大于8mm、大于9mm、大于1cm、或大于1.5cm。可以在施用细菌培养物后1天、2天、3天、3-7天或5-10天测量直径。
在一些实施方式中，选择在施用1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、10-20μL、20-30μL、30-40μL、40-50μL或50-100μL的来自细菌培养物的粗提取物时具有产生直径大于2mm的抑制区的能力的芽孢杆菌菌株。在一些实施例中，在孵育后测量时，抑制区的直径大于3mm、大于4mm、大于5mm、大于6mm、大于7mm、大于8mm、大于9mm、大于1cm、或大于1.5cm。施用粗提取物后，可以在孵育1天、2天、3天、3-7天或5-10天后测量直径。
在一些实施方式中，所述组合物包含根据《布达佩斯条约》于2018年9月26日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株(“枯草芽孢杆菌菌株ITI-2”或“ITI-2”)，
专利标识名为PTA-125303，ATCC账户号为200139。在一些实施方式中，所述组合物包含根据《布达佩斯条约》于2018年9月26日保藏在典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株(“枯草芽孢杆菌菌株ITI-3”或“ITI-3”)，
专利标识名为PTA-125302，ATCC账户号为200139。
4.3.1.3微球菌素P1
在一些实施方式中，本发明的组合物包含微球菌素P1。在一些实施方式中，微球菌素P1由芽孢杆菌属菌株产生。芽孢杆菌属菌株可以根据其微球菌素P1的表达来选择。芽孢杆菌属菌株可以是短小芽孢杆菌。
在一些实施方式中，该组合物包含由基因工程细菌产生的微球菌素P1。在一些实施方式中，通过递送参与微球菌素P1的生物合成的一种或多种基因，对细菌进行基因工程改造以产生微球菌素P1。在一些实施方式中，通过使用Philip R.Bennallack等人,Reconstitution and Minimization of a Micrococcin Biosynthetic Pathway inBacillus subtilis,Journal of Bacteriology(2016)(通过引用全部内容并入本文)描述的方法对细菌进行基因工程改造。
在一些情况下，该组合物通过包含能够自然表达或通过基因修饰表达微球菌素P1的细菌而包含微球菌素P1。在其他情况下，该组合物通过包含能够自然表达或通过基因工程表达微球菌素P1的细菌粗提取物而包含微球菌素P1。粗提取物可通过获得包括微球菌素P1的细菌培养物级分来产生。
当将该组合物施用于Cmm的琼脂平板培养物中时，微球菌素P1可以以足以诱导抑制区的浓度存在。当将该组合物施用于盆中时，微球菌素P1可以以足以保护番茄免受Cmm侵害的浓度存在。当将该组合物施用于田地中时，微球菌素P1可以以足以保护番茄免受Cmm侵害的浓度存在。有效用于防Cmm的生物保护的微球菌素P1的浓度可通过测试剂量依赖性反应来确定。在一些实施方式中，微球菌素P1以大于1μg/L、10μg/L、100μg/L、500μg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、100mg/L或500mg/L的浓度存在。在一些实施方式中，微球菌素P1以大于1nM、10nM、100nM、200nM、500nM、1μM或10μM的浓度存在。在典型的实施方式中，微球菌素P1以大于100μg/L或150μg/L的浓度存在。
在一些实施方式中，微球菌素P1以大于1μg/L、10μg/L、100μg/L、500μg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、100mg/L或500mg/L的浓度施用。在典型的实施方式中，微球菌素P1以大于100μg/L或150μg/L的浓度施用。
在一些实施方式中，微球菌素P1以大于1μg/英亩、10μg/英亩、100μg/英亩、500μg/英亩、1mg/英亩、5mg/英亩、10mg/英亩、100mg/英亩、500mg/英亩或1g/英亩的量施用。
在一些实施方式中，该组合物可以包含化学合成的微球菌素P1。在一些实施方式中，该组合物可以包含生物学产生但纯化的微球菌素P1。
4.3.2农业上可接受的载体
在一些实施方式中，该组合物还包含农业上可接受的载体。可以添加农业上可接受的载体以增强组合物的抗微生物活性。在一些实施方式中，添加农业上可接受的载体以增强在储存期间或在将组合物施用于田地之后抗微生物剂(例如，微球菌素P1)的稳定性。在一些实施方式中，在将农业上可接受的载体施用到土壤或植物上之前，添加农业上可接受的载体以提供有效浓度的活性组分。
4.3.2.1培养基
在一些实施方式中，用于处理Cmm感染的组合物包含培养基作为农业上可接受的载体。培养基是支持微生物细胞(例如短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或本文公开的其他微生物)生长的混合物。培养基可以包含诸如蛋白胨、大豆蛋白胨、糖蜜、马铃薯淀粉、酵母提取物粉末或其组合的成分。
4.3.2.2微生物培养物的过滤级分
在一些实施方式中，处理Cmm的组合物还包含接种有一种或多种分离的微生物的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包括曲霉属(Aspergillus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas spp.)、假丝酵母属(Candidaspp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、酵母菌属(Saccharomyces spp.)或乳球菌属(Lactococcus spp.)；或其组合。
在一些实施方式中，处理Cmm的组合物还包含接种有一种或多种分离的微生物的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包括曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)或酵母菌属(Saccharomyces spp.)；或其组合。
在一些实施方式中，处理Cmm的组合物包含接种有一种或多种分离的微生物的微生物培养物的无细胞上清液，其中所述微生物包括：曲霉属，例如米曲霉IN-AOI，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA-121551；芽孢杆菌属，例如解淀粉芽孢杆菌IN-BS1，2012年1月11日保藏于ATCC，PTA-12385；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌IN-RP1，2012年1月11日保藏于ATCC，PTA-12387；沼泽红假单胞菌IN-RP2，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA-121533；假丝酵母属，例如，产朊假丝酵母IN-CU1，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA-12550；乳杆菌属，例如瑞士乳杆菌IN-LH1，2012年1月11日保藏于ATCC，PTA 12386；鼠李糖乳杆菌IN-LR1，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA 121554；副干酪乳杆菌IN-LC1，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA-121549；植物乳杆菌IN-LP1，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA121555；乳球菌属，例如乳酸乳球菌IN-LL1，2014年9月4日保藏于ATCC，PTA-121552；假单胞菌属，例如铜绿假单胞菌或荧光假单胞菌；酵母属，例如，酿酒酵母IN-SC1，2012年1月11日保藏于ATCC，PTA-12384；或链球菌属，例如乳酸链球菌；或其组合，或包含上述一种或多种微生物的微生物群，例如2012年1月11日保藏于ATCC的IN-M1(PTA-12383)和/或2014年9月4日保藏于ATCC的IN-M2(PTA-121556)。IN-BS1，ATCC保藏号PTA-12385，先前在美国公开第20160100587和20160102251号和美国专利第9175258号中基于16S rRNA序列和API测试被鉴定为枯草芽孢杆菌，但后来通过全基因组测序被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。IN-LC1，ATCC保藏号PTA-121549，先前在美国公开第20160100587和20160102251号和美国专利第9175258号中基于16S rRNA序列和API测试被鉴定为干酪乳杆菌，但后来通过全基因组测序被鉴定为副干酪乳杆菌。
在一些实施方式中，通过本领域技术人员已知的方法对无细胞上清液进行过滤灭菌或灭菌。无细胞上清液可以通过美国公开第20160100587和20160102251号和美国专利第9175258号(通过引用全部内容并入本文)中描述的方法制成。
例如，为产生本申请的无细胞上清液组合物而生长的微生物可以在大型工业规模的发酵、营养或培养肉汤中生长。例如但不限于，以1000L批次使微生物生长的方法包括如下的培养基，该培养基包括50L非硫农业糖蜜、3.75L麦麸、3.75L海草灰、3.75L膨润土、1.25L鱼乳状液(市售的有机土壤改良剂，来自Nutrivert,Dunham,Quebec，未经巴氏杀菌)、1.25L大豆粉、675mg市售海盐、50L选定的微生物菌株以及高至1000L的非氯化温水。使微生物生长的方法可以进一步包括将糖蜜溶解在一些温水中，将其他成分添加到加料罐中，将温度保持在30℃，并且在5天内pH下降至约3.7后，每天轻轻搅拌一次并监测pH值。培养物可以孵育6周或预定时间，然后将培养物标准化(稀释或浓缩)至1×105个至1×107个、或1×106个细胞/mL的浓度，然后将微生物去除以得到无细胞上清液组合物，即本申请的组合物。
作为本申请的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以用来自几个属和/或种的微生物的组合接种并包含该来自几个属和/或种的微生物的组合。这些微生物以协同方式生长和生活，因为某些属或种可能会提供有益于组合中其他微生物的副产物或合成化合物。例如，作为本申请的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以用好氧微生物和厌氧微生物接种并包含该好氧微生物和该厌氧微生物，该好氧微生物需要氧气进行代谢活动，该厌氧微生物利用其他能源(例如阳光)或特定底物的存在。这使得微生物能够在环境的不同区域中将底物定殖。作为本申请的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以用兼性微生物接种并包含该兼性微生物，该兼性微生物(例如乳杆菌菌株)根据环境中的氧气和/或营养物浓度调节代谢活性。
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但目前认为，作为本申请所公开的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以在发酵(培养)期间产生以协同方式反应的代谢产物。例如，培养物中其他微生物的分泌产物可以对由一种或多种微生物分泌的底物或酶起作用以形成代谢产物，该代谢产物可以被称为第三代谢产物。这些分泌产物和由分泌产物的相互作用形成的那些产物可以以有益的方式协同作用，以增强或诱导植物的生物保护特性。
所有活生物体的物种都包括个体，这些个体在遗传和生物化学上彼此不同，但仍处于该物种内正常变异范围之内。这些单独的自然变异可以是基因序列中无干扰性的取代或缺失、基因表达或RNA加工中的变异和/或肽合成中的变异和/或细胞内分子、膜分子或分泌分子的细胞加工的变异的结果。作为本申请的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以用在物种的正常变异之内或之外的微生物接种。这样的微生物可以通过本领域技术人员已知的遗传学、分子生物学方法和/或通过生化测试方法来检测。
例如，作为本申请的无细胞上清液组合物的来源的微生物培养物可以用接种通过分离特定微生物的单个菌落而选择的微生物并包含通过分离特定微生物的单个菌落而选择的微生物。例如，通过测试分离的微生物中存在的酶水平和一组底物中特定底物的活性来表征菌落成员，以针对分离的微生物建立酶谱。
可以在得到无细胞上清液的培养物中生长的这些微生物的实例包括但不限于曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、酿酒酵母属或链球菌属；其组合，或包含这些微生物中一种或多种的微生物群，包括2012年1月11日保藏于ATCC的IN-M1(PTA-12383)和/或2014年9月4日保藏于ATCC的IN-M2(PTA-121556)。
根据所进行的方法，本发明的组合物可包含这些和其他分离的微生物的不同量和组合。通过用本文公开的一种或多种微生物接种通常被称为肉汤的微生物营养液来形成微生物培养物。微生物培养物由接种微生物的生长和代谢活动形成。因此，在各个方面，所述微生物培养物用曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属中的至少两种接种并包含曲霉属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、假丝酵母属、乳杆菌属、假单胞菌属、酵母属或链球菌属中的至少两种。在一个方面，该微生物培养物用米曲霉、解淀粉芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母接种并包含米曲霉、解淀粉芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母。在一个方面，微生物培养物用混合培养物IN-M1(保藏号PTA-12383)接种并包含该混合培养物IN-M1(保藏号PTA-12383)。在一个方面，该微生物培养物用米曲霉、解淀粉芽孢杆菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母接种并且包括米曲霉、解淀粉芽孢杆菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、沼泽红假单胞菌和酿酒酵母。
在一个方面，微生物培养物用混合培养物接种并包含该混合培养物，该混合培养物是根据《布达佩斯条约》于2012年1月11日保藏在ATCC专利保藏中心的群IN-Ml，账户号为200139，登录号为PTA-12383。IN-M1群包括：沼泽红假单胞菌IN-RP1，ATCC保藏号PTA-12387；米曲霉；酿酒酵母IN-SC1，ATCC保藏号PTA-12384；解淀粉芽孢杆菌IN-BS1，ATCC保藏号PTA-12385；瑞士乳杆菌IN-LHI，ATCC保藏号PTA-12386；和副干酪乳杆菌。在一个方面，微生物培养物用混合培养物IN-Ml与一种或多种公开的微生物体一起接种并包含混合培养物IN-Ml与一种或多种公开的微生物体。生长后，将微生物培养物稀释或浓缩至1×105至1×107个细胞/mL、或1×106个细胞/mL，并通过去除存在于微生物发酵培养物中的微生物，从该IN-M1发酵培养物中获得无细胞上清液组合物。
在一个方面，微生物发酵培养物用混合培养物IN-M2接种，该混合培养物根据《布达佩斯条约》于2014年9月4日保藏在ATCC专利保藏中心，命名为IN-M2，账户号为200139，ATCC专利保藏号为PTA-121556。微生物群IN-M2包括：副干酪乳杆菌IN-LC1，ATCC保藏号PTA-121549；瑞士乳杆菌INN-LH1，ATCC保藏号PTA-12386；乳酸乳球菌IN-LL1，ATCC保藏号PTA-121552；鼠李糖乳杆菌IN-LRI，ATCC保藏号PTA-121554；植物乳杆菌IN-LP1，ATCC保藏号PTA-121555；沼泽红假单胞菌IN-RP1，ATCC保藏号PTA-12387；沼泽红假单胞菌IN-RP2，ATCC保藏号PTA-121553；酿酒酵母IN-SC1，ATCC保藏号PTA-12384；产朊假丝酵母IN-CUI，ATCC保藏号PTA-121550；米曲霉IN-AOI，ATCC保藏号PTA-121551；和解淀粉芽孢杆菌IN-BS1，ATCC保藏号PTA-12385。在一个方面，将微生物发酵培养物用混合培养物IN-M2与一种或多种公开的微生物体一起接种并包含混合培养物IN-M2与一种或多种公开的微生物体。生长后，将微生物培养物稀释或浓缩至1×105至1×107个细胞/mL、或1×106个细胞/mL，并通过去除存在于微生物培养物中的微生物，从该IΝ-Μ2培养物中获得无细胞上清液组合物。
4.3.2.2.1选择标准
可以基于本文提供的一种或多种标准来选择用于提供无细胞上清液的微生物的组成。具体而言，可以将活性组分的抗微生物活性与各种微生物的无细胞上清液合并，然后在培养平板上、在培养基中或在田地中针对Cmm进行测试。当微生物的上清液级分对活性组分(如短小芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、微球菌素P1或其组合)的抗微生物活性提供协同、累加或任何其他积极作用时，选择该微生物。
4.3.3其他可选组分
在一些实施方式中，本申请的抗微生物组合物还可包含一种或多种另外的或任选的组分，包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、营养化合物、肽、蛋白质、递送组分或其组合。
在一些实施方式中，抗微生物组合物还包含营养组分。营养组分可以是粉末、颗粒或丸剂、或在溶液或混合物中都含有营养的液体，包括溶液或混悬液。
在一些实施方式中，抗微生物组合物还包含铜或其合金，包括但不限于黄铜、青铜、白铜和铜-镍-锌。
4.4保护番茄免受Cmm侵害的方法
在一个方面，本文提供了通过将有效量的本发明的抗微生物组合物施用于暴露于Cmm的番茄植株来保护番茄免受Cmm侵害的方法。该有效量足以对番茄植株进行防Cmm的生物保护。
4.4.1施用方法
取决于在番茄植株中或种植有番茄植株的土壤中的Cmm种群、环境条件和番茄易感性，抗微生物组合物可以在特定时间施用或一次或多次施用。该组合物可以施用于番茄植株的根、叶或茎。
在一些实施方式中，将所述组合物施用于如下的土壤，(1)根植于该土壤中的植株表现出Cmm相关的病理症状，(2)当前根植于该土壤中的植株表现出Cmm相关的病理症状，或(3)将会根植于该土壤中的番茄植株预期表现出Cmm相关的病理症状。在一些实施方式中，将组合物施用于将会种植到这样的土壤上的种子。在一些实施方式中，将组合物施用于来自已被种植到这样的土壤上的亲本番茄植株的种子。在一些实施方式中，将组合物施用于植根于这样的土壤中的植物。在一些实施方式中，将组合物施用于显示出Cmm相关的病理症状的植物。
该组合物可以在被Cmm感染之后或之前施用。在一些实施方式中，在种植种子之前至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月施用该组合物。在一些实施方式中，在种植种子之后至少1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月施用该组合物。在一些实施方式中，在收获番茄之前1周、2周、3周、4周、5周或5至10周施用该组合物。
合适的施用方法包括但不限于高压或低压喷雾、喷淋、涂覆、浸渍和土壤注射。在各个方面，公开的组合物可以在种植之前或期间施用于土壤或其他植物生长介质和/或可以施用于种子。
当处理种子时，公开的组合物可以通过多种技术施用，包括但不限于高压或低压喷雾、涂覆、浸渍和注射。处理后，可以将种子种植在天然或人工土壤中，并使用常规方法进行栽培以生产植物。在从根据本申请处理的种子中繁殖出植株之后，可以通过一次或多次施用公开的组合物来处理植株。
公开的组合物可以施用于植株的全部或部分。例如，可以将公开的组合物施用于茎、根、叶和/或繁殖体(例如插条)。可以在一个或多个发育阶段对植株进行处理。在一种实施方式中，将公开的组合物施用于根。
在一些实施方式中，可以将组合物施用于递送媒介，其中该递送媒介用作将生物保护特性从该递送媒介转移至土壤、植株、种子、田地等的手段。例如，可以将公开的组合物施加于要用于过滤系统中的递送媒介(例如，颗粒、聚合物或基质)以处理灌溉水。该技术可能用于多种植物环境，例如田地、温室设施、垂直农场、城市绿化系统和水耕系统。在一些实施方式中，可以根据需要将公开的组合物作为释放水的湿润剂和/或凝胶而施用于聚合物。在一些实施方式中，可以将公开的组合物施用于影响溶解度的活性物质以浓缩用于种子涂覆的活性物质的递送系统。如本文所用，“活性物质”是指具有在发酵过程中产生的期望的生物保护性质的分子或分子组合。
4.4.2施用量
本发明的抗微生物组合物以有效量施用以对番茄进行防Cmm的生物保护。在一些实施方式中，该量足以预防Cmm感染。在一些实施方式中，该量足以处理或减轻Cmm相关的一种或多种症状。
在一些实施方式中，该量足以降低用该组合物处理的番茄植株的组织中的Cmm浓度。在一些实施方式中，在施用步骤后10天时，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后21天时，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后3、5、7、14、21、28、35或42天，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于109CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后3、5、7、14、21、28、35或42天，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于108CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后3、5、7、14、21、28、35或42天，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于107CFU/g。在一些实施方式中，在施用步骤后3、5、7、14、21、28、35或42天，在番茄植株的组织中测得的Cmm浓度低于106CFU/g。
具体的量根据土壤的类型和状况、番茄的类型和状况、Cmm的效力和活性等而变化。具体的量还可以根据环境而变化，例如根据它是在盆中还是在田地中而变化。在一些实施方式中，本发明的组合物在使用前与农业上可接受的载体混合或稀释于农业上可接受的载体中。
可以通过使用本领域已知的方法，例如通过测试剂量依赖性响应来确定具体的量。在一些实施方式中，通过测试对具有Cmm的培养平板上的剂量依赖性响应，例如通过测量抑制区，来确定具体的量。在一些实施方式中，通过测试在盆中或田地中的剂量依赖性响应来确定具体的量。在一些实施方式中，基于测量用组合物处理的番茄植株的组织中Cmm浓度或基因特异性Cmm的量来确定具体的量。在一些实施方式中，基于枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或两者的浓度确定具体的量。
在一些实施方式中，施用于番茄植株的细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。在一些实施方式中，施用于番茄植株的细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的枯草芽孢杆菌。
在一些实施方式中，将组合物施用于番茄植株，使得在番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。在一些实施方式中，将组合物施用于番茄植株，使得在番茄植株的根、茎或叶中测得的枯草芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。在一些实施方式中，将组合物施用于番茄植株，使得在番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。
该组合物可以以0.2至3gal/A、0.5至2.5gal/A、0.75至2gal/A、0.5gal/A、1gal/A、1.25gal/A、1.5gal/A、或2gal/A的量施用。
4.5实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员完全公开和描述如何制作和使用本发明，并且并非旨在限制发明人所认为的其发明所属的范围，也并非旨在代表以下实验是所进行的全部或唯一的实验。已经尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；等等。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
4.5.1实施例1：根际细菌的分离和纯化
从麦吉尔大学(McGill University)麦克唐纳校区(Macdonald Campus)的EmileA.Lods农学研究中心(45°26″05.5′N,73°55″57.2′)和摩根植物园(45°26′06.5″N,73°55″57.2′W)的各种植物根际中收集根际土壤和根样品。通过稀释平板技术使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液来分离根际细菌。在LBA(Luria-Bertani琼脂；组成(g/L)：胰蛋白-10g，酵母提取物-5g，NaCl-5g，琼脂-15g)和King’s B琼脂(组成(g/L)：蛋白胨-20g，甘油-10mL，K2HPO4-1.5g，MgSO4·7H2O-1.5g，琼脂-15g)平板上连续稀释根际细菌，并在30℃下孵育至少3天。在培养过程中时常观察平板上细菌菌落的出现。挑选在大小、颜色和形态上显示出差异的菌落，并分别在各自的培养基平板上划线，然后如前所述进行孵育。将单个菌落再次在各自的培养基平板上划线，直到获得纯培养物。选择形态上不同的菌落并使其在LB肉汤中生长(在30℃的旋转摇床上以150rpm摇动)，并储存于-80℃的25％的甘油(v/v)中。
4.5.2实施例2：拮抗性根际细菌的筛选
在LB琼脂(“LBA”)平板上培养所选的根际细菌分离株，并选择单个菌落用于抗Cmm的筛选研究。分离株的单菌落在LB肉汤中于30℃进一步生长至少24h，然后以150rpm振摇。
将Cmm在NBYA(营养肉汤酵母提取物琼脂)平板上划线，该板由营养肉汤(8.0g L-1)、酵母提取物(2.0g L-1)、K2HPO4(2.0g L-1)、KH2PO4(0.5g L-1)、葡萄糖(5.0g L-1)、MgSO4·7H2O(0.25g L-1)和琼脂(15g L-1)组成。将该平板在28℃下孵育72h，并将单个菌落在含有营养肉汤(Difco，Detroit，MI，USA)的试管中进一步传代培养，并在28℃下再孵育48h，同时在定轨摇床(Model 5430台式定轨摇床；Forma Scientific Inc.,Mariolta,OH,USA)上以150rpm振摇。使用无菌细胞涂布器将100μL Cmm细菌悬液均匀铺展在NBYA上，并风干。使用菌苔斑点测定(spot on lawn assay)测试了选定的根际细菌分离株(在上述条件下于LB肉汤中过夜生长)的抗微生物活性。在Cmm的菌苔上点样10μL的每种测试分离株。将平板在28℃孵育72小时。根际细菌分离株周围的抑制区揭示了抗菌活性。
4.5.3实施例3：微生物的鉴定
4.5.3.1实施例3-1：基于16S rRNA基因序列的微生物鉴定
选择如实施例2中提供的通过产生抑制区而对Cmm具有拮抗活性的菌落，并用其中一个菌落接种LB肉汤。然后使细菌培养物在30±1℃以150rpm在摇床上生长2天。使用QIAamp DNA Mini Kit(Cat.#51304，Qiagen，多伦多，加拿大)从细胞提取DNA。使用引物27F(5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')和1492R(5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')扩增近全长16S rRNA基因。聚合酶链反应(PCR)方案包括：25μL Dream Taq PCR预混液(Cat.#K1071，Fisher Scientific，蒙特利尔，加拿大)、5μL每种引物(1μM)(IDT，科勒维尔，IO，美国)、5μL模板DNA，最终反应体积为50μL。
热循环条件包括：95℃下3分钟；然后95℃下30秒，55℃下30秒，72℃下1分钟，40个循环；最后72℃下延伸5分钟。通过在
Safe DNA凝胶染料(Cat.#S33102，ThermoFisher Scientific，加拿大)染色的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检查扩增，并观察条带(Gel Doc EZ Imager，Bio-Rad，赫拉克勒斯，CA，美国)。将PCR片段的大小与100bp DNA梯状条带(Cat.#：15628019；ThermoFisher Scientific，加拿大)进行比较。16S rRNA基因测序是在Genome Quebec(麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心，蒙特利尔，加拿大)完成的，并使用NCBI核苷酸Blast搜索与已发表的16S rRNA基因序列进行了比较。比对正向和反向序列，并创建共有序列(表1至3)。
表1至3中提供的序列分析表明，对Cmm具有拮抗活性的细菌与NCBI提供的短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌序列的16s rRNA具有99％至100％的序列同一性。具体地，发现第一细菌(ITI-1)所具有的16s rRNA基因序列与短小芽孢杆菌NES-CAP-1菌株(GenBank登录号MF079281.1)具有100％的同一性和100％的覆盖率；发现第二细菌(ITI-2)所具有的16srRNA基因序列与枯草芽孢杆菌菌株BSFLG01(GenBank登录号MF196314.1)具有99％的同一性和100％的覆盖率；发现第三细菌(ITI-3)所具有的16s rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌菌株SSL2(GenBank登录号MH192382.1)具有100％的同一性和100％的覆盖率。
4.5.3.2实施例3-2：基于API测试的微生物鉴定
API 50 CHB/E培养基(Biomerieux 50 430)用于鉴定芽孢杆菌和相关的属。它是一种即用型培养基，可以在API 50 CH试纸条上使49种碳水化合物发酵。在培养基中制备测试微生物的细菌悬液，然后将悬液接种到具有试纸的每个试管中。在孵育过程中，碳水化合物被发酵成酸，从而导致pH值降低，这通过指示剂颜色变化来检测。
将在实施例3-2中鉴定为枯草芽孢杆菌(ITI-2和ITI-3)和短小芽孢杆菌(ITI-1)的三种细菌菌株(它们的16S rRNA基因序列在表1至3中提供)在LBA平板上划线并在30℃孵育48小时。使来自纯培养物的几个菌落悬浮在具有API NaCl 0.85％(2ml)的安瓿瓶中，以制备混浊的细菌悬液。使用API NaCl 0.85％的第二安瓿瓶，通过从先前的悬液转移一定滴数来制备相当于麦氏浊度为2的悬液，记录所使用的滴数(n)。通过将两倍滴数(2n)的悬液转移到安瓿瓶中，然后充分混合，进行API 50 CHB/E安瓿瓶的接种。然后，通过填充所有49个试管，将API 50 CHB/E培养基转移到回廊(gallery)中，然后在30℃孵育48小时(±2小时)，然后根据制造商的说明对活性进行评分。阳性测试与由培养基中包含的酚红指示剂变为黄色所揭示的酸化对应。对于七叶树素测试，观察到颜色从红色变为黑色。通过在apiweb鉴定网站apiweb.biometrieux.com中输入测试结果(阳性或阴性测试)来进行微生物鉴定。apiweb鉴定站点的结果在下表4中提供。
1(Ref.50 430；API 50 CHB/E Medium；Biomerieux Inc.,Durham,NC,USA)
2Logan NA &RCW Berkeley.1984.Identification of Bacillus strains usingthe API system.J.Gen.Microbiol.130:1871-1882.
+代表阳性反应；-代表阴性反应
API测试显示，一种菌株具有与短小芽孢杆菌99.9％相似的活性，而两种菌株具有与枯草芽孢杆菌99.8或99.9％相似的活性。这些结果证实了鉴定出对Cmm具有拮抗活性的一种菌株是短小芽孢杆菌(ITI-1)，两种菌株是枯草芽孢杆菌(ITI-2和ITI-3)。
因此，基于16S rRNA基因测序和API测试，分离株被鉴定为短小芽孢杆菌(ITI-1)、枯草芽孢杆菌(ITI-2)和枯草芽孢杆菌(ITI-3)，如以下表5所总结。
4.5.4实施例4：短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对Cmm的抗微生物活性
将以上在实施例3中鉴定出的短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在LBA上划线并在30℃孵育。使来自该培养物的单细胞菌落在LB肉汤中进一步生长，并在摇床上以150rpm在30℃孵育24小时。将在NBYA平板上生长的Cmm的单个菌落接种到含有营养肉汤的试管中，并在28℃孵育48小时，同时在定轨摇床上以150rpm振摇。用无菌涂布器将100μL该培养物(Cmm)的悬液均匀地铺展在新鲜NBYA平板上。将10μL短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的过夜培养物(如上所述)滴到Cmm的NBYA菌苔上，并在28℃孵育3天。短小芽孢杆菌(右)和枯草芽孢杆菌(左)菌落周围的抑制区证明了对Cmm的抗菌活性(图1)。
另外，通过琼脂孔扩散测定评估了短小芽孢杆菌产生的各种级分和纯化的抗生素的抗菌活性。如上所述使Cmm生长，并使用无菌涂布器将100μL的悬液均匀地铺展在新鲜NBYA平板上。小心地在琼脂中制作直径为6mm的孔，并将50μL提取自短小芽孢杆菌的测试级分或抗生素测试样品倒入琼脂孔中。将灭菌蒸馏水作为对照处理。将皮氏培养皿在28℃孵育3天，并观察孔周围的抑制区。孔周围的明显的抑制区表明对Cmm具有抗菌活性(图6)。
4.5.5实施例5：短小芽孢杆菌产生的抗生素的提取、纯化和鉴定
收获了培养5天的短小芽孢杆菌细菌培养物，并通过用40％丁醇对细菌培养物进行相分配同时振摇30分钟(150rpm)来分离出抗微生物化合物。然后使丁醇混合物在4℃静置过夜以使丁醇相分配。仔细收集含有抗微生物化合物的顶层丁醇，并通过旋转蒸发(Yamato RE500；Yamato，CA，美国)在50℃将其真空浓缩至干。
将容器中的浓缩物质(粗提取物)悬浮在10％乙腈(AcN/H2O，v/v)中，并冷冻于-20℃直至进一步分析。将粗提取物以13,000rpm离心(Sorvall Biofuge Pico，MandelScientific，ON，加拿大)30分钟，以除去不溶性颗粒。将上清液过滤除菌(PVDF，0.45μm，Fisher Scientific，蒙特利尔，加拿大)，并测试针对Cmm的生物活性。然后将已过滤的提取物上样到C18柱(RestekTM，Fisher Scientific，蒙特利尔，加拿大)上并用20mL的10％、20％、40％、60％、80％和100％乙腈洗脱，并收集级分。将以不同浓度的乙腈洗脱的级分冻干(SNL216V，Savant Instruments Inc.，NY，美国)，悬浮在无菌蒸馏水中，并测试针对Cmm的生物学活性。选择显示出针对Cmm的抑制区的级分以通过HPLC进行进一步分级。在进行HPLC分析之前，将活性级分于4℃存储在灭菌小瓶中。
通过HPLC(Waters Corporation，美国)使显示针对Cmm的体外生物活性的级分进一步分级。HPLC系统配备有Vydac C18反相柱(4.6x250mm，5μm；cat.#218TP 5，Vydac，CA，美国)，并且装有waters 1525 Binary HPLC泵，设置为214nm的waters 2487双λ吸收检测器(Waters Corporatrion，美国)以及WISP 712自动进样器。在进行HPLC分析之前，将样品以13,000rpm离心10分钟，然后对100μL的活性级分进行HPLC分析。使用乙腈和水作为溶剂，以1mL/分钟的流速进行色谱法60分钟。使用10％-95％乙腈(v/v)(从0-50分钟)、95％-10％乙腈(从50-52分钟)，最后10％乙腈(从52-60分钟)的梯度进行洗脱。每隔1分钟收集级分。
生成HPLC色谱图，并收集与色谱图中出现的峰相对应的一分钟内的馏分，冻干以去除乙腈，重悬于无菌水中，并如前所述通过琼脂孔扩散测定来测试针对Cmm的生物学活性。将显示出针对Cmm的体外抗菌活性的级分合并在一起，进行另一轮HPLC纯化、冷冻干燥和生物活性评估，直到获得单个纯峰为止。收集洗脱为单峰的纯化活性物质，并储存于4℃，直到通过质谱进一步分析为止。
液相色谱电喷雾电离MS(LC-ESI-MS)：
在与LTQ Orbitrap Velos和ETD(Thermo Fisher Scientific)离子阱质谱仪结合使用的Agilent 1100 HPLC系统上，在正离子模式下，通过使用乙腈/H2O/0.1％(v/v)甲酸使纯化的样品通过Spurcil C18柱(Dikma Technologies Inc.，加拿大；Cat#：82013)(2.1x150mm，3μm粒径)，在m/z 50-2000的质量范围内进行LC-ESI-MS分析。样品以10-95％乙腈的梯度运行17.0分钟，然后以95-10％乙腈的梯度运行2.0分钟，最后以10％乙腈等度运行1.0分钟。流速为0.2mL/分钟，运行时间为20分钟(图2A至2B和3A至3B)。将来自短小芽孢杆菌的纯化级分的HPLC色谱图(图2A)与购自Bioaustralis Fine Chemcials(史密斯菲尔德，NSW，澳大利亚)的标准微球菌素P1的HPLC色谱图(图2B)进行了比较。
进一步比较了短小芽孢杆菌活性级分(图3A)和标准微球菌素P1(图3B)之间的LC-MS色谱图。分析的短小芽孢杆菌活性级分的LC-MS色谱图揭示了微球菌素P1同源物的三个峰，分别与m/z 1,144.22[M+H]+、m/z 1,161.25[M+NH4]+、m/z 1,166.22[M+Na]+对应(图3A)。标准微球菌素P1的LC-MS色谱图显示m/z 1,144.22[M+H]+、m/z 1,161.25[M+NH4]+、m/z1,166.21[M+Na]+(图3B)。测试生物活性时，标准微球菌素P1还显示出对Cmm的抗微生物活性。
还比较了来自短小芽孢杆菌的纯化级分的ESI-MS光谱(图4A)与标准微球菌素P1的ESI-MS光谱(图4B)。
短小芽孢杆菌的纯化级分(图2A、3A和4A)和标准微球菌素P1(图2B、3B和4B)之间的HPLC色谱图、LC-MS色谱图和ESI-MS谱图相同，表明纯化级分中的抗生素是微球菌素P1(图5)。
4.5.6实施例6：微球菌素P1的剂量依赖性抗菌活性
通过琼脂孔扩散测定评估了各种浓度的微球菌素P1的抗微生物活性。将Cmm的细胞悬液覆盖在NBYA上，并使平板风干。将50μL以各种浓度稀释的微球菌素P1滴入琼脂孔中。将皮氏培养皿在28℃孵育3天，然后观察细菌菌苔，以测量微球菌素P1施用周围的生长抑制区。
微球菌素P1表现出抗菌活性，仅在每孔50μL以7.8125ng或更高，即以大于0.156mg/L(即137nM)的浓度施用时，在平板上提供生长抑制区。抗菌活性与微球菌素P1的浓度成正比(图7)，并且在5mg/L(即4.37μM)的浓度(实验中测试的最高浓度)下效果最为显著。
这些结果证实微球菌素P1是抗菌成分，并且微球菌素P1必须以高于最小浓度0.156mg/L(即137nM)存在，以提供对LBA板上的Cmm的抗菌活性。
4.5.7实施例8：盆实验
4.5.7.1材料和方法
进行了番茄生物防治实验，以通过实时PCR定量来测试芽孢杆菌菌株针对番茄植株中Cmm感染的功效。
细菌生长和培养条件：Cmm在营养肉汤酵母提取物(YBYE)培养基中生长，并在28℃和120rpm下孵育72小时。NBYE的组成包括营养肉汤(8g/L)、K2HPO4(2g/L)、KH2PO4(0.5g/L)、酵母提取物(2g/L)、20％葡萄糖(25ml/L)和1M MgSO4·7H2O(1mL/L)。分别对葡萄糖和MgSO4·7H2O溶液进行高压灭菌，并在涂板之前
与其他成分混合。使两种实验性生物防治剂(枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)在Luria-Bertani(LB)培养基中于30℃生长24小时，并以120rpm摇动。LB培养基的组成包括：细菌用胰蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)和氯化钠(5g/L)。当微生物在琼脂培养基上生长时，以15g/L添加琼脂。对于番茄植株接种实验，使细菌在其各自的肉汤培养基中生长，随后通过离心来沉淀，重悬于盐水(0.85％NaCl)中，并将细胞密度调节至约10x8CFU/mL。
番茄幼苗的生产：将番茄品种Sub Artic Maxi(Stokes Seeds，ON，加拿大)的种子在25％商业漂白剂溶液中表面灭菌3分钟。然后将种子用无菌水小心地洗涤几次，以除去漂白剂溶液，并在设定为25℃，16小时光周期的生长室中生长，并根据需要定期浇水/施肥。
植物接种：将幼苗(4周龄)转移到装有Agromix盆栽混合物(Teris，拉瓦尔，魁北克，加拿大)的塑料盆(500mL容量)中，分为以下处理：1)对照(未接种，阴性对照)；2)仅Cmm(阳性对照)；3)短小芽孢杆菌+Cmm；4)枯草芽孢杆菌+Cmm；5)混合(枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌1:1混合物)+Cmm。将番茄植株小心地从生长培养基中移出，暴露出根，并用无菌水洗涤，然后在其各自的细菌处理中浸渍1分钟。实验进行了两次。对于第一次实验(表6中的实验I)，每种处理混合物均包含2.0×108CFU/mL的Cmm、2.5×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌和/或4.0×108cfu/mL的短小芽孢杆菌。对于第二次实验(表6中的实验II)，每种处理混合物均包含8.5×108CFU/mL的Cmm、1.8×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌和/或7.4×108CFU/mL的短小芽孢杆菌。将对照植物连根拔起，但不接种。每种处理重复3次。
植物组织采样程序：接种后第4、10和21天(DAI)收获番茄植株。从叶、茎和根中提取组织样品，并通过浸渍75％乙醇中1分钟进行表面消毒，用无菌水洗涤并用无菌吸水纸干燥。切下200mg的每种植物组织样品(叶、茎和根)，并储存于-80℃在无菌低温管中。如下采集植物组织样品：
4DAI：
根：冠状区域下方3cm
茎：冠部区域上方3cm(代表植物的中部)
叶：无菌切割第二片小叶
10DAI：
根：冠状区域下方3cm
茎：在植株的2到3叶片之间切开(代表植物的中部)
叶：无菌切割第三片小叶
21DAI：
根：冠状区域下方3cm
茎：在植株的6到7叶片之间切开(代表植物的中部)
叶：无菌切割第七片小叶
DNA提取：用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)将植物组织(200mg)浸软，用无菌研钵和研杵匀浆化，转移到无菌低温管中，用于总DNA提取。使用DNeasy PowerSoil试剂盒(Qiagen，Cat.#：12888-100)从植物组织提取总DNA。提取的总DNA用Nano drop(ThermoScientificTM NanodropTM One/OneC Microvolume)定量，并在洗脱缓冲液中稀释至3至5ng/μl；将从所有植物组织中提取的DNA稀释至此范围，以使所有样品的DNA浓度标准化。将提取的DNA储存于4℃，直至进一步使用。
PCR测定的靶基因和特异性：对从Cmm、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌培养物中提取的基因组DNA进行对Cmm具有特异性的CelA靶基因的扩增，以验证引物仅对Cmm具有特异性。
使用QIAamp DNA Mini Kit(Cat.#51304，Qiagen，多伦多，加拿大)从三种微生物(Cmm、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)中提取DNA。使用引物CelAfw(5'GGT TCT CCG CATCAA ACT ATC C 3')和CelArv(5'TGC TTG TCG CTC GTC 3')扩增CelA基因(136bp产物)。聚合酶链反应(PCR)方案包括：25μL Dream Taq PCR预混液(Cat.#K1071，FisherScientific，蒙特利尔，加拿大)、5μL每种引物(1μM)(IDT，科勒维尔，IO，美国)、5μL模板DNA，最终反应体积为50μL。热循环条件包括：95℃下3分钟；然后95℃下30秒，55℃下30秒，72℃下1分钟，40个循环；最后72℃下延伸5分钟。通过在
Safe DNA凝胶染料(Cat.#S33102，Thermo Fisher Scientific，加拿大)染色的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检查扩增，并观察条带(Gel Doc EZ Imager，Bio-Rad，赫拉克勒斯，CA，美国)。将PCR片段的大小与100bp DNA梯状条带(Cat.#：15628019；ThermoFisher Scientific，加拿大)进行比较。CelAPCR产物的测序是在Genome Quebec(麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心，蒙特利尔，加拿大)进行的，并使用NCBI核苷酸Blast搜索(BLASTn)与已发表的靶序列进行了比较。
CelA实时PCR分析的灵敏度测试和标准曲线生成：使用从已知Cmm浓度的加标番茄植株组织(叶、茎和根)中提取的DNA进行标准曲线绘制。使用连续十倍稀释的提取的DNA来生成标准曲线。实时PCR分析在20μL的最终反应体积中进行，其中包含5μL DNA、2μL每种CelA引物(终浓度1.25μM)和10μL SYBR Green PCR Master Mix。热分布为：95℃下3分钟；95℃下15秒和62.5℃下15秒，然后是72℃下30秒，35个循环。
CelA基因的实时PCR扩增以检测和定量番茄植株中Cmm：在运行软件CFXManagerTM3.1版的Bio-Rad CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)中进行实时PCR。使用SYBR-GreenPCR Master Mix(Sso AdvancedTM Universal
Green Supermix，Cat.#.1725271)在96孔光学板(Bio-Rad hard-shell)中进行扩增和检测。所有扩增均一式两份，在20μL的最终体积进行，其中包含5μL的总DNA、2μL的每种CelA引物(终浓度为1.25μM)和10μL SYBRGreen PCR Master Mix。循环程序由以下组成：95℃下预变性3分钟；然后95℃下15秒，62.5℃下15秒，72℃下30秒，35个循环。
为了检查特异性，通过将温度从70℃升高到95℃(以0.2℃为增量)并进行连续的荧光监测来进行熔解曲线(Tm)分析。进行熔解曲线分析以确保不存在非特异性产物和引物二聚体。使用两个阴性对照和一系列10倍稀释的总DNA作为模板以构建校正曲线。
4.5.7.2结果与结论
CelA基因引物对Cmm的特异性：为了验证CelA基因引物对Cmm的特异性，从Cmm、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中提取DNA，并使用PCR进行扩增。当PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳时，对于Cmm，仅观察到CelA产物条带，而对于短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌未观察到条带，表明缺乏CelA靶基因的PCR扩增(图8)。使用Sanger测序对从Cmm扩增的PCR产物进行测序，并且从Cmm扩增的PCR产物揭示了包括正向和反向引物序列(SEQ ID NO:7)的136bp的片段。使用NCBI核苷酸BLAST搜索，该片段与报道的Cmm CelA基因序列(GenBank登录号：KJ123730.1)(SEQ ID NO:8)显示出100％同一性。
实时PCR标准曲线：基于对CelA基因的检测，为每种植物组织构建标准曲线以使Cmm种群与扩增循环相关。所有标准曲线的效率均在建议的范围内(90％-110％)，R2大于0.99(Taylor等人，2010)。从10倍系列稀释的DNA样品中获得直线回归，所述DNA样品从加标有已知浓度的Cmm的浸软的番茄植株组织中提取。对于这三种组织，获得了相关系数(R2)大于0.99的线性方程式(图9、10和11)。图9是来自叶片组织的Cmm的标准曲线，图10来自茎组织，图11来自根组织。实时PCR测定的叶、茎和根组织检出限为103CFU/g。
通过实时PCR检测和定量Cmm：从没有扩增产物明显可见，在两次实验中均未在阴性对照(未接种植株)中检测到CelA靶基因。另一方面，在所有接种Cmm的处理中均检测到了CelA靶基因。另外，阳性对照(仅接种了Cmm的植株)(图12A-14B)中估计的Cmm CFU/g(根据CelA基因标准曲线计算)在所有收获时间和组织中与其他处理(短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或混合)相比更高。
即使在最早的收获时间(4DAI)，也可以在所有植物组织中检测到Cmm种群。Cmm的最高水平出现在根部，其次是茎和叶。这并不奇怪，因为植物是在根部被接种的。对于所有处理、组织和收获时间，两次实验均显示出了相似的趋势。但是，在两次实验中观察到了Cmm群体的细微差异–图12A、13A和14A提供了实验I(表6)的结果，图12B、13B和14B提供了实验II(表6)的结果。差异可以通过植物接受的接种密度的细微差异来解释。
在存在Cmm的情况下施用于番茄根部时，仅枯草芽孢杆菌、仅短小芽孢杆菌或两种微生物的混合物(1:1)均抑制Cmm在番茄植株内部所有组织中的扩散。这项研究的结果支持以下假设：实验性生物防治芽孢杆菌属降低番茄幼苗中Cmm的量。这项研究强调了两种芽孢杆菌属菌株作为针对Cmm的生物防治剂的重要性。实际上，由Cmm引起的病害症状只有当细菌在植物组织中的滴度达到108至109CFU/g时才会出现(Meletzus等人，1993；Gartemann等人，2003)。因此，减少病原性细菌的数量是病害管理和避免番茄植株萎蔫病和溃疡病的重要策略。
4.5.8实施例10：田地实验
在种植有用至少108至109CFU/g的Cmm感染的番茄的田地中测试番茄生物防治产品。将田地分为四组，并用水(对照)或不同量的BS(枯草芽孢杆菌)、BP(短小芽孢杆菌)或BS+BP(枯草芽孢杆菌+短小芽孢杆菌)处理。
测量每组番茄的产量、适销性产量和Cmm感染症状。在所有三个指标(产量、适销性产量和Cmm感染症状)上，用枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或两者处理的番茄均优于对照组。此外，鉴定了枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或两者用于保护番茄免受Cmm感染的有效量。
4.5.9实施例11：田地实验
在种植有用至少108至109CFU/g的Cmm感染的番茄的田地中测试进一步含有微生物培养物IN-M1的无细胞上清液的番茄生物防治产品。将田地分为四组，并用水(对照)或不同量的与微生物培养物IN-M1的无细胞上清液混合的BS(枯草芽孢杆菌)、BP(短小芽孢杆菌)或BS+BP(枯草芽孢杆菌+短小芽孢杆菌)处理。
测量每组番茄的产量、适销性产量和Cmm感染症状。在所有三个指标(产量、适销性产量和Cmm感染症状)上，用枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或两者处理的番茄均优于对照组。
短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(以及两者的组合)可以保护番茄免受Cmm感染，并且微生物混合物IN-M1的细胞上清液组合物具有如美国公开第20160100587和20160102251号和美国专利第9175258号(通过引用全部内容并入本文)中描述的其他益处。
5.通过引用合并
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过引用全文并入本文，程度就好像每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件都被单独地指出出于所有目的通过引用并入。
6.等价物
尽管已经图示和描述了各种特定的实施方式，但是以上说明书不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种改变。通过阅读本说明书，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。
序列
PCT/RO/134表
Claims (55)
1.一种保护番茄免受Cmm侵害的方法，包括以下步骤：
将有效量的包含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的细菌培养物施用于番茄植株，其中，所述番茄植株暴露于Cmm，
其中，所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌培养物包含接种有短小芽孢杆菌的培养基。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中，在施用步骤之前将所述细菌培养物装瓶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，将所述细菌培养物与短小芽孢杆菌一起孵育3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天，然后装瓶。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物与短小芽孢杆菌在25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育，然后装瓶。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，所述培养基是LB肉汤。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细菌培养物包含微球菌素P1。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细菌培养物包含浓度高于100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L、500μg/L、600μg/L、1000μg/L或5000μg/L的微球菌素P1。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述微球菌素P1由短小芽孢杆菌产生。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，所述微生物混合物包含副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，其中所述微生物混合物通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)的不同细菌培养物混合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述番茄植株根植于盆中或田地中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物施用于所述番茄植株以使在所述番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的根、叶或茎。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述有效量足以降低所述番茄植株的组织中的Cmm浓度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，在施用步骤后10天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，在施用步骤后21天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的方法，其中，在施用步骤后10天或21天时测得的Cmm浓度低于108CFU/g。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，所述番茄植株的组织是根、茎或叶。
22.一种保护番茄免受Cmm侵害的方法，包括以下步骤：
将有效量的包含枯草芽孢杆菌的细菌培养物施用于番茄植株，其中，所述番茄植株暴露于Cmm，
其中，所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述细菌培养物包含接种有枯草芽孢杆菌的培养基。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中，在施用步骤之前将所述细菌培养物装瓶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，将所述细菌培养物与枯草芽孢杆菌一起孵育3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天，然后装瓶。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物与枯草芽孢杆菌在25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育，然后装瓶。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，所述培养基是LB肉汤。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，所述微生物混合物包含副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌。
29.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与微生物混合物的无细胞上清液混合，其中所述微生物混合物通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的方法，其中，在将所述细菌培养物施用于番茄植株的步骤之前，将所述细菌培养物与包含短小芽孢杆菌的不同细菌培养物混合。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法，其中，所述番茄植株根植于盆中或田地中。
32.根据权利要求22至31中任一项所述的方法，其中，所述细菌培养物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。
33.根据权利要求22至32中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物施用于所述番茄植株以使在所述番茄植株的根、茎或叶中测得的短小芽孢杆菌的终浓度为107至109CFU/cm3、2.5×107至109CFU/cm3、2.5×107至8.5×108CFU/cm3、5×107至8.5×108CFU/cm3、2×108至8.5×108CFU/cm3、3×108至8×108CFU/cm3、或108CFU/cm3。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中，将所述细菌培养物施用于所述番茄植株的根、叶或茎。
35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中，所述有效量足以降低所述番茄植株的组织中的Cmm浓度。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，在施用步骤后10天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。
37.根据权利要求35所述的方法，其中，在施用步骤后21天时测得的Cmm浓度低于109CFU/g。
38.根据权利要求36至37中任一项所述的方法，其中，在施用步骤后10天或21天时测得的Cmm浓度低于108CFU/g。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中，所述番茄植株的组织是根、茎或叶。
40.一种用于处理Cmm的组合物，其包含：
有效量的微球菌素P1；和
农业上可接受的载体，
其中，所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中，所述农业上可接受的载体选自由培养基、培养基的过滤级分或微生物培养物的过滤级分组成的组。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中，所述农业上可接受的载体包含接种有短小芽孢杆菌的培养基。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中，将所述培养基瓶装。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中，将所述细菌培养物与短小芽孢杆菌一起孵育3-20天、5-15天、5-10天、6-8天或7天，然后装瓶。
45.根据权利要求43至44中任一项所述的组合物，其中，将所述细菌培养物与短小芽孢杆菌在25-37℃、28-35℃、28-32℃或30℃孵育，然后装瓶。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含枯草芽孢杆菌。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含微生物培养物的过滤级分。
48.根据权利要求40至46中任一项所述的组合物，其中，所述组合物不包含微生物培养物的过滤级分。
49.根据权利要求47至48中任一项所述的组合物，其中，所述微生物培养物包含副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌。
50.根据权利要求47至48中任一项所述的组合物，其中，所述微生物培养物通过孵育以ATCC登录号PTA-12383保藏的IN-M1或以ATCC登录号PTA-121556保藏的IN-M2而产生。
51.根据权利要求40至50中任一项所述的组合物，其中，所述微球菌素P1的有效量高于100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L、500μg/L、600μg/L、1000μg/L或5000μg/L。
52.根据权利要求40至51中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的短小芽孢杆菌。
53.根据权利要求40至52中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含浓度为107至109CFU/mL、2.5×107至109CFU/mL、2.5×107至8.5×108CFU/mL、5×107至8.5×108CFU/mL、2×108至8.5×108CFU/mL、或108CFU/mL的枯草芽孢杆菌。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含铜或铜合金。
55.一种保护番茄免受Cmm侵害的方法，包括以下步骤：
将有效量的权利要求40至53中任一项所述的组合物施用于番茄植株，其中，所述番茄植株暴露于Cmm，
其中，所述有效量足以对所述番茄植株进行防Cmm的生物保护。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005082149A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Itsuki Co., Ltd. | バチルス属細菌を用いた植物病害の防除方法および防除剤 |
| CN1766091A (zh) * | 2005-09-23 | 2006-05-03 | 中国农业大学 | 一株枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN103649303A (zh) * | 2011-01-12 | 2014-03-19 | 伊诺库克技术股份有限公司 | 微生物组合物和方法 |
| CN104982459A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-10-21 | 苏州市农业科学院 | 一株短小芽孢杆菌n103-1及其应用 |
| US20170188584A1 (en) * | 2014-05-23 | 2017-07-06 | Basf Se | Mixtures Comprising a Bacillus Strain and a Pesticide |
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| CN107646873A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-02-02 | 泰克美生物科技（喀左）有限公司 | 一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用 |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005082149A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Itsuki Co., Ltd. | バチルス属細菌を用いた植物病害の防除方法および防除剤 |
| CN1766091A (zh) * | 2005-09-23 | 2006-05-03 | 中国农业大学 | 一株枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN103649303A (zh) * | 2011-01-12 | 2014-03-19 | 伊诺库克技术股份有限公司 | 微生物组合物和方法 |
| US20170188584A1 (en) * | 2014-05-23 | 2017-07-06 | Basf Se | Mixtures Comprising a Bacillus Strain and a Pesticide |
| CN107427012A (zh) * | 2014-09-09 | 2017-12-01 | 伊诺库克技术股份有限公司 | 微生物组合物和方法 |
| CN104982459A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-10-21 | 苏州市农业科学院 | 一株短小芽孢杆菌n103-1及其应用 |
| CN107646873A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-02-02 | 泰克美生物科技（喀左）有限公司 | 一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《抗菌素生物理化特性》编写组编: "《抗菌素生物理化特性》", 31 October 1981, 人民卫生出版社 * |
| ROY,A.A ET AL.: "Influence of bacteria of Bacillus genus on the agent of bacterial cancer of tomatoes", 《MIKROBIOLOGICHNII ZHURNAL》 * |
| SVETLANA MILIJAŠEVIĆ-MARČIĆ ET AL.: "Antagonistic potential of Bacillus spp. isolates against bacterial pathogens of tomato and fungal pathogen of pepper", 《PESTIC.PHYTOMED.(BELGRADE)》 * |
| 徐忠等: "《苏德隆教授诞辰一百周年纪念集》", 30 April 2006, 第二军医大学出版社 * |
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