CN104982459A - 一株短小芽孢杆菌n103-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N103-1组成。其特征在于：分泌的代谢产物中包括蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素三种抗菌相关物质。该生防菌剂是水剂，其组成与重量百分含量为：5亿短小芽孢杆菌N103-1：98.8％；NNO：1.0％；山梨酸钾：0.2％。在草莓苗移栽或定植时，短小芽孢杆菌N103-1水剂1∶50-500倍稀释液均匀喷施植物叶面，用于防治草莓炭疽病。其优点是：通过引进对人畜安全、对多种植物病害具有较好防治作用的短小芽孢杆菌N103-1，达到利用生防菌剂防治植物病害；减少化学药剂用药量、降低用药成本；同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中残留量的目的。

Description

一株短小芽孢杆菌N103-1及其应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株短小芽孢杆菌N103-1及其在防治草莓炭疽病中的应用。

背景技术

草莓炭疽病是草莓的主要病害之一，一般可造成减产10％～20％，严重的可减产50％以上，南方草莓产区发生较为普遍。草莓炭疽病主要发生在育苗期(匍匐茎抽生期)和定植初期，其主要危害匍匐茎、叶柄、叶片、托叶、花瓣、花萼和果实，可造成局部病斑或全株萎蔫枯死。匍匐茎、叶柄、叶片染病，初始产生直径3～7毫米的黑色纺锤形或椭圆形溃疡状病斑；当匍匐茎和叶柄上的病斑扩展成为环形圈时，病斑以上部分萎蔫枯死，湿度高时病部可见肉红色黏质孢子堆。当母株叶基和短缩茎部位发病，初始1～2片展开叶失水下垂，傍晚或阴天恢复正常，随着病情加重，则全株枯死。浆果受害，产生近圆形病斑，淡褐至暗褐色，软腐状并凹陷，后期也可长出肉红色黏质孢子堆。此病由真菌半知菌亚门毛盘孢属草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae Brooks侵染所致，其有性阶段为子囊菌亚门小丛壳属的Glomerella fragariae。

目前生产上草莓炭疽病以化学防治为主，化学农药的大量使用不仅导致病原菌易产生抗药性，造成防效不佳、病害再猖撅；而且造成生态环境严重污染，直接增加农产品中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。生物防治具有安全无毒、无污染和病菌不易产生抗药性的特点，越来越受到各国政府和人民的关注。Seiju Ishikawa报道真菌Talaromyces flavus能有效防治草莓炭疽病(《Journal of general plant pathology》，2013，79(6))。Chalfoun等人研究发现一些无毒真菌可以诱导抗病性，提高对草莓炭疽病的防效(《Biological control》，2011，58(3))。Freeman等人发现木霉菌可以防治草莓炭疽病和灰霉病(《European journal of plant pathology》，2004，110(4))。国内杨敬辉等人报道黄色链霉菌NF0919对草莓炭疽病菌等多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用(《西北农业学报》，2013，22(4))。王美林等研究发现1000亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌对草莓炭疽病有较好的防效，与化学药剂多菌灵、咪鲜胺防效相当(《生物灾害科学》，2013，36(1))。刘诗胤等人报道枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌菌丝生长有较好的抑制作用(《浙江农业学报》，2012，24(4))。魏彩燕等从草莓炭疽病样上分离获得对草莓炭疽病具有较强拮抗作用的黄蓝状菌(Talaromyces flavus)菌株MT-06(《菌物学报》，2010，(4))。张雪等报道木霉菌剂能提高“红颜”草莓炭疽病的抗性(《西北农业学报》，2010，19(8))。马华升等采用生物发酵法制备木霉菌株HZ0501发酵液，对草莓炭疽病具有明显的抑菌活性(《山东轻工业学院学报》，2009，23(4))。

本专利申请人从北京市郊采集的土样中，分离纯化获得一株生防菌株N103-1。根据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等实验数据综合分析，菌株N103-1鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。同时，短小芽孢杆菌N103-1已于2013年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册， 保藏编号为CGMCC No.8484。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。前期研究发现：短小芽孢杆菌N103-1对室内多种病原真菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，草莓炭疽病的小区实验和田间实验防效良好，明显高于对照药剂多菌灵。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、短小芽孢杆菌属。短小芽孢杆菌呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，1.2～1.5×2.0～4.0微米。能运动，革兰氏阳性，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生。该菌能水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素等。短小芽孢杆菌一般为饲用微生物菌种，适用于猪、禽类反刍动物，也适用于鱼、虾等水产动物，能显著抑制动物肠道致病菌的生长。已有短小芽孢杆菌相关专利主要是：防治水稻稻瘟病(专利申请号：201210271396.4)、水稻纹枯病(ZL 201010572008)、小麦合谷孢囊线虫病(ZL 201310046055.1)、番茄灰霉病(ZL 200910223357.5)、黄瓜霜霉病(CN201110288018.2)辣椒疫病(ZL 201010268495.8)、松树苗木猝倒病(ZL 201010238823.X)、兰花茎腐病(ZL 201110413021.2)等。另外还有一些堆肥或微生物秸秆腐熟剂中含有短小芽孢杆菌(专利申请号：201410407424.X)，可以分解秸秆，同时具有生物防治功能，能抑制作物纹枯病、水稻稻瘟病、小麦根腐病、草莓灰霉病等病原菌的生长。

目前，国内外只有Min等人曾报道短小芽孢杆菌Bacillus pumilus分泌的挥发性物质对Colletotrichum gloeosporioidles(Penz.)引起的芒果炭疽病有较好的防效(《Biological control》，2013，65(2))。而申请人分离获得的短小芽孢杆菌N103-1作用机理和标靶病原菌与之完全不同。具体如下：1、短小芽孢杆菌N103-1活菌体可以直接抑制草莓炭疽病菌生长；2、Colletotrichum fragariae引起的草莓炭疽病和Colletotrichum gloeosporioides引起的芒果炭疽病属于盘孢属的两个不同种。众所周之，病原菌不同种之间千差万别。同一种化学药剂或生防菌对这个种有防治作用，可能对另一个种就没有任何作用。甚至病原菌同一个种在不同寄主植物上侵染，同一种化学药剂或生防菌产生的效果也是各不相同。在短小芽孢杆菌的这个大家族中，不同短小芽孢杆菌作用的靶标病原菌小种各不相同。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N103-1是由申请人采样分离获得一株新菌株，能有效防治Colletotrichum fragariae引起的草莓炭疽病，国内外未见相关报道，具有创造性和新颖性。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N103-1，该菌株已于2013年11月19日在中国微生物菌种保藏中心登记入册，保藏编号为CGMCC No.8484。

本发明提供了一种生物杀菌剂，其中有效活性成分由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N103-1组成。

本发明所述的生物杀菌剂，其中短小芽孢杆菌N103-1分泌的代谢产物中包括蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素三种抗菌相关物质。

本发明所述的生物杀菌剂，是水剂。其特征在于：各组成及重量百分含量如下：活性成分50％-99％；助剂0.5％-10％；防腐剂0.1-0.5％。其中活性成分由短小芽孢杆菌N103-1组成；助剂选自NNO、氮酮、噻酮中的一种或多种；防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或多种。

本发明所述的水剂，各组成及重量百分含量如下：5亿短小芽孢杆菌N103-1：98.8％；NNO：1.0％；山梨酸钾：0.2％。

本发明所述的水剂在草莓苗移栽或定植时，1∶50-500倍稀释液均匀喷施植物叶面，用于防治草莓炭疽病。

本发明的优点在于：开发出一株对人畜安全、具有较好应用前景的生防菌株-短小芽孢杆菌N103-1，丰富生防资源。该生防菌剂可以用来防治草莓炭疽病，减少生产中化学药剂的使用量，降低用药成本；同时改善生态环境、减少化学药剂在草莓中的残留量。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是短小芽孢杆菌N103-1对病原细菌的抑制作用

图2是短小芽孢杆菌N103-1对病原真菌的抑制作用。

图3是短小芽孢杆菌N103-1产生蛋白酶。

图4是短小芽孢杆菌N103-1产生纤维素酶。

图5是短小芽孢杆菌N103-1产生嗜铁素。

图中A：短小芽孢杆菌N103-1；B：草莓炭疽病菌；C：番茄枯萎病菌；D：水稻纹枯病菌；E：甘蓝黑斑病菌；F：梨火疫病菌；G：水稻细菌性条斑病菌；H：番茄青枯病菌。

具体实施方式：

实施例1、

短小芽孢杆菌N103-1对3种病原细菌的抑制作用

A、供试病原细菌

病原细菌包括梨火疫病菌、水稻细菌性条斑病菌和番茄青枯病菌，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用LB培养液(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL)28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁸cfu/mL，备用。

B、试验方法： 

将江苏省农业科学院筛选获得的短小芽孢杆菌N103-1在LB培养基上进行活化，然后移入50mL LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至5×10⁸cfu/mL，备用。

吸取短小芽孢杆菌N103-1菌液5μL，点接在LB平板中央，28℃培养48h后用病原细菌稀释液喷雾，28℃培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设清水对照。

C、试验结果： 

试验结果见图1。短小芽孢杆菌N103-1菌液对对供试的3种病原细菌均有一定的抑制作用，对梨火疫病菌的的抑菌圈直径最大，为28mm；对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径为22mm；对番茄青枯病菌的抑菌圈直径最小，为15mm。

如图1所示。

实施例2

短小芽孢杆菌N103-1对4种植物病原真菌的抑制作用

A、供试病原真菌：

病原真菌包括草莓炭疽病菌、番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌和甘蓝黑斑病菌，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用PDA培养基(200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂和1000mL蒸馏水，pH 5.6-6.6)28℃培养5d，备用。

B、试验方法： 

短小芽孢杆菌N103-1菌液制备同实施例1。

将病原真菌菌饼(直径为6mm)置于空白PDA平板一侧，距平板边缘30mm。平板另一侧，距平板边缘30mm，点接短小芽孢杆菌N103-1菌液5μL。28℃恒温培养，设清水对照，待对照平板病原菌菌落长满时调查各处理病原菌生长直径，计算抑制率。每处理重复3次，取平均值。

病原真菌抑制率＝[(对照病原菌生长直径-处理病原菌生长直径)/对照病原菌生长直径]×100％。

C、试验结果： 

试验结果见表1和图2。结果表明：短小芽孢杆菌N103-1菌液对供试的4种病原真菌有明显的抑制作用，抑制率均大于30％。

表1短小芽孢杆菌N103-1对供试病原真菌的抑制作用

如图2所示。

实施例3

短小芽孢杆菌N103-1代谢分泌物-抗菌相关物质的产生

供试材料：蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉100g，琼脂20g，定容至1000mL。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，定容至1000mL，pH 7.0。嗜铁素检测培养基：CAS 60.5mg，10mL三价铁溶液(1mmol·L^-1FeCl₃·6H₂O)，HDTMA 72.9mg，琼脂20g，定容至1000mL，pH7.0。

短小芽孢杆菌N103-1菌液制备同实施例1。在各检测培养基平板中央点接短小芽孢杆菌N103-1菌液5μL，每处理重复3次。28℃恒温培养3-7d，观察。

蛋白酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌蛋白酶。

纤维素酶检测：观察菌落周围有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌纤维素酶。

嗜铁素检测：28℃恒温培养7-10d后观察有无黄色晕圈产生。若产生黄色晕圈，说明该拮抗菌可分泌嗜铁素。

试验结果表明：短小芽孢杆菌N103-1能分泌蛋白酶，利用检测平板中的蛋白质，在菌落周围形成透明圈(图3)；短小芽孢杆菌N103-1能分泌纤维素酶，在测试平板上能将纤维素分解为可溶性物质，形成透明圈(图4)；短小芽孢杆菌N103-1能分泌嗜铁素，与检测平板中的Fe³⁺结合，在菌落周围形成桔黄色晕圈(图5)。

在短小芽孢杆菌的大家族中，不同短小芽孢杆菌分泌的代谢产物(蛋白酶、几丁质酶、嗜铁素、纤维素酶等)也不相同。本专利中提到的短小芽孢杆菌N103-1不能分泌几丁质酶；能分泌蛋白酶，纤维素酶；也能分泌嗜铁素。这是该菌株的特殊性质，所以要求相关权利保护。

如图3、图4和图5所示。

实施例4

5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂的获得 

A、菌种准备及活化。

LB培养基(同实施例1)按常规方法加琼脂后灭菌，做成斜面。接种短小芽孢杆菌N103-1，28℃培养2d。

B、液体发酵。 

一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入500mL LB培养液(同实施例1)，共移2瓶。在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

二级发酵：培养基配方：玉米淀粉2.0％，大豆粉1.0％，玉米浆0.4％，鱼粉2.0％，NaCl 0.1%，CaCO₃ 0.3％。灭菌前pH 7.0。2吨发酵罐中投料1吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述一级发酵菌种液1000mL。液体发酵温度30℃，搅拌转速250rpm。通气量1∶2。发酵周期为24小时。

三级发酵：培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵温度30℃，搅拌转速300rpm。通气量1∶1.5。发酵周期为42小时左右，放罐。

C、水剂配置。 

发酵液放入储罐中，加入NNO 1.0％、山梨酸钾：0.2％，搅拌均匀。测得发酵液pH值为6.5，活菌数为5×10⁸cfu/mL。灌装，即成5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂。

实施例5

5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂对草莓炭疽病的盆栽防效测定

试验地点：在江苏省农业科学院植物保护研究所温室内进行。

试验品种：红颜(感病品种，由江苏省农业科学院园艺研究所提供)。

试验药剂：5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂由实施例4提供。对照药剂为50％多菌灵，购自江苏辉丰农化股份有限公司，是生产上防治草莓炭疽病的常用化学药剂，按商品田间推荐剂量使用。

试验方法：

草莓炭疽病菌孢子液的制备如下：将草莓炭疽病菌接种于PDA培养基平板，28℃培养5d，用无菌水洗下平板中的孢子，过滤菌丝，摇匀。显微镜下用血球计数板计数，用无菌水调至孢子浓度为10⁶个/mL。

将“红颜”草莓苗根部蘸炭疽病菌孢子液1min，移栽于100g无菌土的盆钵中，每钵1株草莓苗。次日用20mL 5亿短小芽孢杆菌原液、50倍和500倍稀释液喷雾叶片表面，7-10d后再喷施一次。每处理30盆，常规管理。对照药剂为50％多菌灵，设清水对照。20d后调查病情，计算防效。

病株率＝(发病株数/调查总株数)×100％；

防效＝[(对照区病株率一处理区病株率)/对照区病株率]×100％。

试验结果见表2。5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂原液对草莓炭疽病盆栽防效为73.87％，明显高于化学药剂50％多菌灵的防效，而5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂500倍稀释液的盆栽防效为60.92％，与50％多菌灵的防效相当。试验结果表明：5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂可有效防治草莓炭疽病。

表2 5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂对草莓炭疽病盆栽防效测定

实施例6

5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂对草莓炭疽病的田间防效测定

试验地点：苏州市吴中区东山镇双湾村设施草莓大棚内进行，前茬为水稻，土壤质地为壤土，肥力中等，2013年该区域草莓炭疽病发生严重。

试验品种：红颜。

试验药剂：同实施例5。

试验方法：

2014年9月16日移栽，株行距为20cm×40cm，常规水肥管理，试验前及试验期间未用过任何其它杀菌剂。试验设5个处理，分别为：①5亿短小芽孢杆菌(菌含量为5×10⁸cfu/mL)水剂原液；②5亿短小芽孢杆菌50倍稀释液(菌含量为10⁷cfu/mL)；③5亿短小芽孢杆菌500倍稀释液(菌含量为10⁶cfu/mL)；④50％多菌灵WP 1500倍液；⑤清水对照。每个处理3次重复，共15个小区，随机排列，每小区栽200株草莓苗，且每小区周围设有保护行。试验前挑选健壮无病、生长状况基本一致的草莓苗各600株，每间隔7天喷施一次药剂，然后移栽到未作任何药剂消毒处理，平整的试验田内。草莓炭疽病病情调查方法同实施例5。

试验结果见表3。对照病田中草莓炭疽病的病情指数为87.53，5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂原液和50倍稀释液对草莓炭疽病田间防效分别为76.52％和68.49％，500倍稀释液对草莓炭疽病田间防效为53.75％，而化学药剂多菌灵的防效为50.63％，生防菌剂N103-1的防效明显高于常规化学药剂，这与实施例5盆栽防效测定结果一致。试验结果表明：生防菌剂N103-1水剂能有效防治草莓炭疽病。

表3 5亿短小芽孢杆菌N103-1水剂对草莓炭疽病田间防效测定

Claims (4)

1.一种生防菌剂及其应用，其特征在于：所述生防菌剂中有效活性成分由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N103-1组成；所述短小芽孢杆菌N103-1分泌的代谢产物中包括蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素三种抗菌相关物质；所述生防菌剂为水剂；所述生防菌剂可用于防治草莓炭疽病。

2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌N103-1水剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：活性成分50％-99％；助剂0.5％-10％；防腐剂0.1-0.5％。其中活性成分由短小芽孢杆菌N103-1组成；助剂选自NNO、氮酮、噻酮中的一种或多种；防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌N103-1水剂，各组成及重量百分含量如下：5亿短小芽孢杆菌N103-1：98.8％；NNO：1.0％；山梨酸钾：0.2％。

4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌N103-1水剂，在草莓苗移栽或定植时，1∶50-500倍稀释液均匀喷施植物叶面，用于防治草莓炭疽病。