CN107646873A - 一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用，将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别接种至LB培养基中进行培养后，转接发酵培养基，进行发酵培养，然后离心，得到菌泥；将两种混合后，将混合菌泥添加到保护剂、表面活性剂和载体中制成悬浮液，加水混匀，进行高温喷雾干燥，得到防治细菌性植物病害的微生物菌粉。优点是：以微生物菌剂为原料，成本低廉，无化学农药污染，在使用过程中微生物可迅速在植株表面形成一层防护层，并且对植物病害部位进行治理和修护，对细菌性病害具有防治效果。

Description

一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于生物农药领域，涉及一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用，特别涉及一种无公害、无残留、无污染，用于多种蔬菜、瓜果的细菌性病害防治的微生物菌剂和应用。
背景技术
细菌病害主要特点是——非专性寄生菌，与寄主细胞接触后通常是先将细胞或组织致死，然后再从坏死的细胞或组织中吸取养分，因此导致的症状是组织坏死、腐烂和枯萎，少数能引起肿瘤这是分泌激素所致。初期受害组织表面常为水渍或油渍状、半透明，潮湿条件下有的病部有黄褐色或乳白色胶粘、似水珠状的菌脓；腐烂型往往有臭味。这是细菌病害的重要标志。
细菌性病害是不同于真菌性病害的另一类植物病害，在设施农业中发生极为普遍。细菌性病害大多属土传病害，在防治时需严格实行土传病害的综合防治措施。植物植株一旦感染细菌性病害，多是整株感染，且病情发展迅速，会很快死亡。在茄科植物上通常发生的有：番茄青枯病、番茄溃疡病、番茄软腐病、番茄疮痂病、辣(甜)椒青枯病、辣(甜)椒软腐病、辣(甜)椒疮痂病、番茄角斑病、黄瓜的细菌性果斑病等是设施农业上瓜果类作物上比较常见的一类病害；在农作物上通常发生的有水稻的白叶枯、水稻细菌性条斑病等也是影响水稻产量的重要病害。
由青枯雷尔氏菌引起的茄科作物青枯病，是世界性病害之一，该病多扎结果期开始发病，发病初期白天萎蔫，夜晚恢复，2-3天后不再恢复，植株枯萎死亡，但仍保持绿色；发病植株茎基部维管束变褐，用手挤压，有乳白色粘液渗出。随着气温转暖等因素，青枯病发病越来越普遍，尤以番茄、辣椒、马铃薯等茄科作物受害严重。
番茄溃疡病也是比较常见的细菌病害，多为整株染病，发病初期植株下部叶片向上纵卷，凋萎下垂，部分植株出现萎蔫现象，发病后其，病叶叶缘枯黄，叶脉简变黄，全叶变褐枯萎，但不脱落；时常导致茎部出现狭长条斑，后期病斑开裂，伴有大量气生根，茎秆髓部中空腐烂，散发臭味，严重时植株枯死。番茄溃疡病是一种毁灭性病害，自上世纪八十年代中期在北京发现后，已相继在内蒙、山西、河北、黑龙江、吉林、辽宁等地发生灾害，严重时，会导致番茄减产25-75％。我国已经将番茄溃疡病列为检疫对象以防止和控制病害发生蔓延。瓜果类的细菌性角斑病也是设施农业种植作物发病较严重的病害之一，该病菌为假单胞菌，在棚内或露地黄瓜整个生长期间均可发生。主要危害叶片，也危害茎蔓和果实。叶片受害时，叶正面病斑淡褐色，背面受叶脉限制呈多角形，表面可见乳白色菌脓；果实上的菌斑可向内扩展，蔓延至种子。在设施农业和非设施种植黄瓜的地方发病都较严重，发病率在30-50％之间，严重时可达100％。
目前，细菌性病害防治主要是化学农药防治，如农用链霉素、可杀得、甲霜铜以及DTM。这些农药的长期使用使得细菌性病害已经对其产生了很强的抗药性，再用这类药品进行防治，即使加大用药量，效果仍然很差，已经难以控制病菌危害与发展。细菌性病害多为土传病，具有宿主范围广、抗逆性强、难以防治的特点。化学农药的大量使用，会污染水、土壤，破坏土壤结构，影响生态环境，直接危害非目的微生物，导致土壤微生物失衡，同时严重危害到人畜的健康。这些因素也使得化学农药的使用受到严重的限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂和应用，以微生物菌剂为原料，成本低廉，无化学农药污染，在使用过程中微生物可迅速在植株表面形成一层防护层，并且对植物病害部位进行治理和修护。
本发明的技术解决方案是：
一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其制备方法包括：
1)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌利用接种环挑取菌落分别接种至LB培养基中进行培养，培养温度为32℃，在往复式振荡器中振荡速度为120rpm，培养24h后，转接发酵培养基，进行发酵，接种量为发酵总体积的1-3％；
2)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别在28℃-35℃下发酵培养24-36h；然后分别在转鼓式离心机上8000rpm-10000rpm离心10分钟，得到枯草芽孢杆菌菌泥、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌泥；
3)将枯草芽孢杆菌菌泥和蜡状芽孢杆菌菌泥按照质量比(1-1.5):(1.5-2.5)混合后得到混合菌泥，将混合菌泥按照0.1％-1.0％添加量添加到保护剂、表面活性剂和载体中制成悬浮液，所述保护剂为甘油、阿拉伯胶、味精和脱脂奶粉，所述载体为可溶性淀粉、麦芽糊精中的一种或两种，所述表面活性剂溶液为无患子液、吐温20、吐温80、皂素中的至少一种，加水制成固含物30-40％的液体，进行高温喷雾干燥，温度为160℃-190℃，进料流速为2-4L/min，得到防治细菌性植物病害的微生物菌粉。
进一步的，发酵培养时，根据芽孢率情况，在芽孢率≥95％时，结束发酵。
进一步的，加入的保护剂、载体和表面活性剂按照重量百分含量组成如下：甘油1％-3％，阿拉伯胶0.5％-2％，味精0.1％-1.5％，脱脂奶粉10％-20％，载体66％-88％，0.1-0.6％表面活性剂。
进一步的，发酵培养基的组成为：红糖15-35g/L、硫酸铵5-15g/L、硫酸锰0.001-0.005g/L、磷酸二氢钾1.0-5.0g/L、乙酸钠1.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.1-0.3g/L。
进一步的，加入的保护剂、载体和表面活性剂按照重量百分含量组成如下：甘油1.5％、阿拉伯胶2％、味精0.5％、脱脂奶粉15％，表面活性剂0.1％，可溶性淀粉80.9％。
进一步的，所述表面活性剂为无患子液。
一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂的应用，在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:10000-3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液10％-20％的红糖和0.5％-1％复合肥进行扩繁，常温下扩繁12h-24h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
进一步的，在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:100-1:1000进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
进一步的，在使用时，按照微生物菌粉和水质量比3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液15％的红糖和0.75％复合肥进行扩繁，常温下扩繁18h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
进一步的，在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:500进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
本发明的有益效果：
针对细菌性植物病害的微生物菌剂，由枯草芽孢杆菌和胶质冻样芽孢杆菌经发酵、包被、干燥制成；所得微生物菌剂可以有效防治物细菌性病害，如青枯病、溃疡病、黄瓜细菌性果斑病、角斑病、番茄烂髓病，无化学农药污染，有利于蔬菜类、瓜果类无公害生产，提升了农作物产品的品质。
使用的枯草芽孢杆菌和胶质冻样芽孢杆菌在平板拮抗实验中显示对番茄溃疡病、黄瓜角斑病、番茄细菌性烂髓病原菌有着较好的抑制作用；温室试验表明，该菌剂对番茄青枯病、番茄烂髓病、黄瓜细菌性条斑病均有显著防治效果；设施大棚试验表明，该微生物菌剂对番茄青枯病、番茄烂髓、黄瓜细菌性条斑病有较好的防控效果，防控效率在75％以上。
该枯草芽孢杆菌和胶质冻样芽孢杆菌复合微生物菌剂为菌粉在使用时，用户可搭配简单的红糖和复合肥进行扩繁，少量的产品可以得到大量的菌液，使用成本低，同时菌剂在加工过程中加入的表面活性剂又可使得微生物在使用过程中快速分布、延伸形成一层防护膜，起到强化效果的作用。除此之外，该菌剂还可以扩繁后或按照比例稀释后灌根，也可在移苗时对幼苗进行浸根，均可实现对细菌性病害的防治效果。该生物防治措施已经成为细菌性病害的核心，也是最有前途的方法。
附图说明
图1是微生物菌剂对番茄细菌性烂髓病原菌的拮抗效果，抑菌圈大小为3.5cm-4.5cm；图2是微生物制剂对黄瓜角斑病原菌的拮抗效果，抑菌圈大小为2.5-2.8cm；
图3是微生物菌剂对番茄青枯病病原菌的拮抗效果，抑菌圈大小为1.6-1.8cm；
图4是微生物菌剂对番茄溃疡病病原菌的拮抗效果，抑菌圈大小为2.0-2.4cm。
具体实施方式
实施例1
1)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌利用接种环挑取菌落分别接种至LB培养基中进行培养，培养温度为32℃，在往复式振荡器中振荡速度为120rpm，培养24h后，转接发酵培养基，进行发酵，接种量为发酵总体积的2％；
2)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别在28℃发酵培养36h时，芽孢率＞95％，结束发酵；而后分别在转鼓式离心机上8000rpm离心10分钟，得到枯草芽孢杆菌菌泥、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌泥；
3)称取保护剂、载体和表面活性剂重量如下：甘油1g、阿拉伯胶1.7g、味精0.1g、脱脂奶粉20g，麦芽糊精77g，0.2g吐温80；
将0.2g枯草芽孢杆菌和0.5蜡状芽孢杆菌混合后，加入保护剂、表面活性剂和载体中，加水制成固含物30％(w/w)的液体，进行高温喷雾干燥，温度为160℃，流速为2L/min，得到防治细菌性植物病害的的微生物菌粉，菌粉活菌数为1010cfu/g；
其中LB培养基配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖5g/L；
发酵培养基配方：红糖15g/L，硫酸铵15g/L，硫酸锰0.003g/L，磷酸二氢钾5.0g/L，乙酸钠1.0g/L，柠檬酸铵0.1g/L。
实施例2
1)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌利用接种环挑取菌落分别接种至LB培养基中进行培养，培养温度为32℃，在往复式振荡器中振荡速度为120rpm，培养24h后，转接发酵培养基，进行发酵，接种量为发酵总体积的3％；
2)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别在35℃发酵培养30h时，芽孢率＞95％，结束发酵；而后分别在转鼓式离心机上9000rpm离心10分钟，得到枯草芽孢杆菌菌泥、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌泥；
3)称取保护剂、载体和表面活性剂重量如下：甘油3g、阿拉伯胶0.5g、味精1.5g、脱脂奶粉10g，可溶性淀粉84.4g，无患子液0.6g；
将0.03g枯草芽孢杆菌和0.07蜡状芽孢杆菌混合后，加入保护剂、表面活性剂和载体中，加水制成固含物35％的液体，进行高温喷雾干燥，温度为190℃，流速为4L/min，得到防治细菌性植物病害的的微生物菌粉，菌粉活菌数为1011cfu/g；
其中LB培养基配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖5g/L；
发酵培养基配方：红糖35g/L，硫酸铵5g/L，硫酸锰0.001g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，乙酸钠9.0g/L，柠檬酸铵0.3g/L。
实施例3
1)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别接种至LB培养基中培养，培养温度为32℃，振荡速度为120rpm(往复式振荡器)；培养24h后，1％接种量，转接发酵培养基，进行发酵；
2)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别在30℃发酵培养24h时，芽孢率为95％，结束发酵；而后分别在转鼓式离心机上10000rpm离心10分钟，得到枯草芽孢杆菌菌泥、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌泥；
3)称取保护剂、载体和表面活性剂重量如下：甘油1.5g、阿拉伯胶2g、味精0.5g、脱脂奶粉15g，可溶性淀粉80.9g，无患子液0.1g；
将0.5g枯草芽孢杆菌和0.5蜡状芽孢杆菌混合后，加入保护剂、表面活性剂和载体中，加水制成固含物40％的液体，进行高温喷雾干燥，温度为170℃，流速为2.5L/min，得到防治细菌性植物病害的的微生物菌粉，菌粉活菌数为5.0×1010cfu/g；
其中LB培养基配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖5g/L；
发酵培养基配方：红糖20g/L，硫酸铵10g/L，硫酸锰0.005g/L，磷酸二氢钾4.2g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸铵0.2g/L。
使用方法：
(1)在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:10000-3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液10％-20％的红糖和0.5％-1％复合肥进行扩繁，常温下扩繁12h-24h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。其中按照微生物菌粉和水质量比3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液15％的红糖和0.75％复合肥进行扩繁，常温下扩繁18h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌，效果更好。
(2)在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:100-1:1000进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。其中按照微生物菌粉和水质量比1:500进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌，效果更好。
本发明微生物菌剂稀释后平板拮抗试验：
(1)菌株来源：供试菌株选择北纳生物提供番茄细菌性烂髓菌株BNCC 134263(Pseudomonascorrugata)、番茄溃疡菌株ACCC 01233(Clavibacter michiganense，购买于中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心)、黄瓜角斑病病菌ACCC 03518Pseudomonas、北纳生物提供的青枯假单胞菌BNCC 336903(Pseudomonassolanacearum)。
(2)平板拮抗试验
将以上4种菌在LB液体培养基中进行培养，培养条件为32℃，120rpm培养24h。菌液稀释10倍后，分别涂布在已经打孔的LB固体培养基上，打孔方式为牛津杯打孔。最后将本发明实施例3所述微生物菌粉溶解稀释十倍后，利用移液枪吸取100μ菌液至圆孔内，培养24h后，测量透明圈直径和拍照，拮抗效果如图1所示。
LB固体培养基配方：氯化钠10g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,葡萄糖5g/L，琼脂20g/L。
(3)温室试验
温室实验中，将苗期的番茄、黄瓜，利用本发明实施例3的微生物菌粉稀释1000倍后，灌根使用，7天后，将病原菌稀释浓度为1×107cfu/mL灌根使用。
(4)温室大棚试验
田间试验共设三个处理：
A、本发明实施例3的微生物菌粉，稀释1000倍；
B、化学药剂(70％农用链霉素sp1000倍液+25％叶枯宁400倍液)；
C、空白对照。
选取三块小块面积区域作为实验用地，每个小块面积为25m2，小块面积区域之间设置三行隔离区，A、B、C三个处理按完全随机区组排列，重复4次，全试验共12个小块区域。
试验前按试验方案分好小区，开好隔离沟，A、B处理每亩使用量为1000mL，A处理使用109cfu/mL的微生物菌剂。分别统计各种病害的病害严重度，并计算防效。
(5)试验结果：
(a)本发明所述菌剂拮抗病原菌试验结果：本申请的微生物菌粉，对细菌性烂髓、溃疡、角斑和青枯病菌都显示较好的平板抑制效果。
(b)温室实验表明，本发明所述微生物菌剂在温室内对细菌性烂髓、溃疡角斑及青枯病的防效在80％以上，对病原菌起到了很好的控制作用。
(c)田间试验表明，菌剂在温室内对番茄细菌性烂髓、溃疡、黄瓜角斑及青枯病都有较好的抗病效果。
表1微生物菌剂对番茄烂髓的温室防治效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 9.8 87.4
农用链霉素 19.1 71.6
空白对照 76.8 -
表2微生物菌剂对番茄溃疡病的温室防治效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 19.7 75.4
农用链霉素 38.3 53.1
空白对照 83.1 -
表3微生物菌剂对黄瓜角斑病温室防控效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 17.2 89.6
农用链霉素 21.5 61.6
空白对照 88.9 -
表4微生物菌剂对田间烂髓病的防控效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 22.5 80.5
农用链霉素 26.4 74.2
空白对照 78.9 -
表5微生物菌剂对田间番茄溃疡病的防控效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 23.6 75.7
农用链霉素 36.8 67.3
空白对照 88.1 -
表6微生物菌剂对田间番茄青枯病的防控效果
药剂名称 病害严重度(％) 防治效果(％)
微生物菌剂 16.4 88.9
农用链霉素 21.8 79.1
空白对照 78.3 -
使用的生物菌粉在平板拮抗实验中显示对番茄溃疡病、黄瓜角斑病、番茄细菌性烂髓病原菌有着较好的抑制作用；温室试验表明，该菌剂对番茄青枯病、番茄烂髓病、黄瓜细菌性条斑病均有显著防治效果；设施大棚试验表明，该微生物菌剂对番茄青枯病、番茄烂髓、黄瓜细菌性条斑病有较好的防控效果，防效率在75％以上。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：
制备方法包括：
1)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌利用接种环挑取菌落分别接种至LB培养基中进行培养，培养温度为32℃，在往复式振荡器中振荡速度为120rpm，培养24h后，转接发酵培养基，进行发酵，接种量为发酵总体积的1-3％；
2)将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌分别在28℃-35℃下发酵培养24-36h；然后分别在转鼓式离心机上8000rpm-10000rpm离心10分钟，得到枯草芽孢杆菌菌泥、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌泥；
3)将枯草芽孢杆菌菌泥和蜡状芽孢杆菌菌泥按照质量比(1-1.5):(1.5-2.5)混合后得到混合菌泥，将混合菌泥按照0.1％-1.0％添加量添加到保护剂、表面活性剂和载体中制成悬浮液，所述保护剂为甘油、阿拉伯胶、味精和脱脂奶粉，所述载体为可溶性淀粉、麦芽糊精中的一种或两种，所述表面活性剂溶液为无患子液、吐温20、吐温80、皂素中的至少一种，加水制成固含物30-40％的液体，进行高温喷雾干燥，温度为160℃-190℃，进料流速为2L/min-4L/min，得到防治细菌性植物病害的微生物菌粉。
2.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：发酵培养时，根据芽孢率情况，在芽孢率≥95％时，结束发酵。
3.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：
加入的保护剂、载体和表面活性剂按照重量百分含量组成如下：甘油1％-3％，阿拉伯胶0.5％-2％，味精0.1％-1.5％，脱脂奶粉10％-20％，载体66％-88％，0.1-0.6％表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：发酵培养基的组成为：
红糖15-35g/L、硫酸铵5-15g/L、硫酸锰0.001-0.005g/L、磷酸二氢钾1.0-5.0g/L、乙酸钠1.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.1-0.3g/L。
5.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：
加入的保护剂、载体和表面活性剂按照重量百分含量组成如下：甘油1.5％、阿拉伯胶2％、味精0.5％、脱脂奶粉15％，表面活性剂0.1％，可溶性淀粉80.9％。
6.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂，其特征是：所述表面活性剂为无患子液。
7.如权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂的应用，其特征是：在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:10000-3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液10％-20％的红糖和0.5％-1％复合肥进行扩繁，常温下扩繁12h-24h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
8.如权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂的应用，其特征是：在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:100-1:1000进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
9.根据权利要求7所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂的应用，其特征是：在使用时，按照微生物菌粉和水质量比3:10000加入水中得到菌液，加入占菌液15％的红糖和0.75％复合肥进行扩繁，常温下扩繁18h后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
10.根据权利要求1所述的防治细菌性植物病害的微生物菌剂的应用，其特征是：在使用时，按照微生物菌粉和水质量比1:500进行稀释后，进行叶面喷施、浸根或根部浇灌。
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