CN103667134A

CN103667134A - 一株防治十字花科根肿病的多粘类芽孢杆菌n3-4及其应用

Info

Publication number: CN103667134A
Application number: CN201310660199.6A
Authority: CN
Inventors: 刘邮洲; 梁雪杰; 乔俊卿; 杜艳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103667134B

Abstract

本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4组成。其特征在于：该生防菌剂是水剂或可湿性粉剂。水剂其组成与重量百分含量为：5亿多粘类芽孢杆菌水剂：94.4％；NNO：0.5％、十二烷基苯磺酸钠：5％、苯甲酸钠：0.1％。可湿性粉剂其组成与重量百分含量为：50亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂：40％；NNO：7％；聚乙二醇：3％；十二烷基苯磺酸钠：5％；轻质碳酸钙：45％。应用时，将上述水剂灌根或可湿性粉剂根部撒施，用于防治十字花科根肿病。其优点是：通过引进对人畜安全、对十字花科蔬菜根肿病具有较强抑制作用的多粘类芽孢杆菌N3-4，达到利用生防菌剂防治十字花科根肿病；减少化学药剂用药量、降低用药成本；同时改善生态环境、减少了化学药剂在十字花科蔬菜中残留量的目的。

Description

一株防治十字花科根肿病的多粘类芽孢杆菌N3-4及其应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株多粘类芽孢杆菌N3-4及其在防治十字花科根肿病中的应用。

背景技术

十字花科根肿病俗称根癌病，是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一种世界性土传病害，寄主范围很广，可危害大白菜、小白菜、甘蓝、萝卜、荠菜、花椰菜、芥菜和油菜等100多种栽培的和野生的十字花科植物。近年来我国十字花科根肿病的发生面积逐年扩大，严重程度逐年加重。在我国，根肿病常年危害面积约320-400万hm²，占十字花科作物种植面积的1／3以上，大流行年份发生与危害面积可达900万hm²，平均产量损失达20％-30％，严重田块直接产量损失达60％以上。根肿病休眠孢子在无感病寄主植物的土壤中存活可达20年之久。

由于引起根肿病的病原菌一芸薹根肿菌是专性寄生，传染性强、传播速度快、传播途径多，所以根肿病防治较为困难。近年来各国学者非常重视该病并进行了大量研究，主要防控措施有抗病育种、农业防治和化学防治。目前十字花科蔬菜抗根肿病品种较少；农业防治主要是通过施用石灰调节土壤pH来降低根肿病发病率，虽有一定的防治效果，但成本高，且长期使用石灰对土壤结构、生理生化性状都会造成不良影响，因此不可长期使用；化学药剂防治用量大，同时长期大量使用化学农药增加了十字花科蔬菜(尤其是食根部蔬菜，如萝卜、芜菁、榨菜等)有毒物质的积累和残留，给人类健康带来隐患。

解决这个问题的根本途径之一是运用生物防治方法防治十字花科根肿病。生物防治对人畜安全、环境兼容性好、病原菌不易产生抗药性，因而越来越引起人们的重视，并已初见成效。已文献报道的根肿病生防微生物主要有：根殖真菌(Narisawa等，2000年，Plant Pathology)、木霉(Cheah等，2000年，New Zealand Plant Protection)、链霉菌(王靖等，2011年，中国油料作物学报；Joo等，2004，Korean Journal of Microbiology and Biotechnology)和枯草芽孢杆菌等(熊国如等，2009年，云南农业大学学报)。目前已申请专利的根肿病生防微生物有：链霉菌(专利申请号：201310049744.8；201310272882.2)、解淀粉芽孢杆菌(专利申请号：201110284741.3；201210254827.6)、甲基营养型芽孢杆菌(专利申请号：201010561580.3；201010561580.3)、成团泛菌(专利申请号：201210241051.4)等。

江苏省农业科学院从北京市、山西省、江苏省、浙江省以及湖北省下属县市等地采集土样，分离纯化获得367个细菌分离物。筛选后获得一株能很好防治十字花科根肿病的生防菌——多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4。经中国科学院微生物研究所检测鉴定，根据细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列、gyrB基因序列、ropB基因序列等实验数据综合分析，菌株N3-4鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。同时多粘类芽孢杆菌N3-4已于2013年8月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记入册，保藏编号为CGMCC No.8084，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

多粘类芽孢杆菌是一类具有许多优良性能的生防菌，如：生长速度快：适应环境能力强：能在土壤和植物表面定殖，形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质；产生植物激素促生作用等。据文献报道，多粘类芽孢杆菌能防治西瓜枯萎病(宋顺华等，2011年，植物保护学报)、番茄早疫病(马桂珍等，2010年，中国蔬菜)、棉花黄萎病(王笑颖等，2011年，湖北农业科学)、大豆根腐病(王光华等，2004年，安徽农业科学)等真菌病害。目前，多粘类芽孢杆菌防治植物病害申报专利的有：防治水稻纹枯病和稻曲病(专利申请号：200810019537.7)，防治植物青枯病(专利申请号：200910153984.6)，防治烟草黑胫病(专利申请号：201210348067.5)等病害。目前，多粘类芽孢杆菌用于防治十字花科根肿病国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株防治十字花科根肿病的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4，该菌株已于2013年8月28日在中国微生物菌种保藏中心登记入册，保藏编号为CGMCC No.8084。

本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4组成。

本发明所述的生防菌剂，其中多粘类芽孢杆菌N3-4分泌的代谢产物中包括蛋白酶和纤维素酶两种抗菌相关物质。

本发明所述的生防菌剂，它是水剂或可湿性粉剂。

本发明所述的水剂或可湿性粉剂，其特征在于：其组成与重量百分含量如下：活性成分10％-99％；助剂0.5-20％；粘合剂2-20％；表面活性剂0.5％-20％；防腐剂0.1％-0.5％；填充剂10％-90％；其中活性成分由多粘类芽孢杆菌N3-4组成；其中助剂选自NNO、氮酮、噻酮中的一种或多种；粘合剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇中的一种或多种；表面活性剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、茶枯粉、皂角粉中的一种或多种；防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或多种；填充剂选自轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、绢云母粉、白碳黑中的一种或多种。

本发明所述的水剂，其组成与重量百分含量为：5亿多粘类芽孢杆菌水剂：94.4％；NNO：0.5％、十二烷基苯磺酸钠：5％、苯甲酸钠：0.1％。

本发明所述的可湿性粉剂，其组成与重量百分含量为：50亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂：40％；NNO：7％；聚乙二醇：3％；十二烷基苯磺酸钠：5％；轻质碳酸钙：45％。

本发明所述的水剂灌根或可湿性粉剂根部撒施，可有效防治十字花科根肿病。

本发明的优点在于：通过引进对人畜安全、对十字花科根肿病具有较强抑制作用的多粘类芽孢杆菌N3-4，达到利用一种生防菌剂防治十字花科根肿病；减少化学药剂用药量、降低用药成本；同时改善生态环境、减少了化学药剂在蔬菜中的残留量的目的。

附图说明

下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。

图1是多粘类芽孢杆菌N3-4对病原细菌的抑制作用

图2是多粘类芽孢杆菌N3-4对病原真菌的抑制作用。

图3是多粘类芽孢杆菌N3-4产生蛋白酶。

图4是多粘类芽孢杆菌N3-4产生纤维素酶。

图中A：多粘类芽孢杆菌N3-4；B：番茄青枯病菌；C：水稻细菌性条斑病菌；D：梨火疫病菌；E：番茄枯萎病菌；F：水稻纹枯病菌；G：番茄灰霉病菌；H：油菜菌核病菌；I：甘蓝黑斑病菌

具体实施方式：

实施例1、

多粘类芽孢杆菌N3-4对多种病原细菌和病原真菌的抑制作用

由于芸薹根肿菌无法室内培养，因此根肿病生防菌的筛选主要采用以多种病原细菌和病原真菌作为指示菌，获得较好的生防细菌后，再去评价该生防细菌对根肿病菌的拮抗效果和生防能力

A、供试病原细菌和病原真菌：

病原细菌包括番茄青枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和梨火疫病菌，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用LB培养液(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl10g，蒸馏水1000mL)28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁶cfu／mL，备用。

病原真菌包括番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌和甘蓝黑斑病菌，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用PDA培养基(200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂和1000mL蒸馏水，pH5.6～6.6)28℃培养5d，备用。

B、试验方法：

将江苏省农业科学院筛选获得的多粘类芽孢杆菌N3-4在LB培养基上进行活化，然后移入50mL LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

取多粘类芽孢杆菌N3-4菌液5μL点接在LB平板中央，28℃培养48h后用各病原细菌稀释液喷雾后，28℃培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3皿，取平均值。设清水对照。

将病原真菌菌饼(直径为6mm)置于空白PDA平板一侧，距平板边缘30mm。平板另一侧，距平板边缘30mm，点接多粘类芽孢杆菌N3-4菌液5μL。28℃恒温培养，待对照平板菌落长满时测量调查病原菌菌落直径，并计算抑制率。每处理重复3皿，取平均值。设清水对照。

病原真菌抑制率=[(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)／对照病原菌菌落直径]×100％。

C、试验结果：

试验结果见表1、图1-2。试验结果表明多粘类芽孢杆菌N3-4菌液对供试病原细菌和病原真菌均具有较强的抑制作用。

表1 多粘类芽孢杆菌N3-4对供试病原细菌和病原真菌的抑制作用

如图1和图2所示。

实施例2

多粘类芽孢杆菌N3-4对根肿病菌休眠孢子萌发的抑制作用

试验材料：甘蓝根肿病根，采自湖北省宜昌市长阳县火烧坪镇，放置冰箱-20℃保存备用。多粘类芽孢杆菌N3-4，在LB平板上活化后，接种至50mL LB培养液中，在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

采用地衣红染色法测定多粘类芽孢杆菌N3-4对甘蓝根肿病病原菌休眠孢子萌发的抑制情况。从-20℃冰箱中取出甘蓝根肿病根，25℃放置2d，采集的休眠孢子液用无菌水稀释至浓度约为10⁵个／mL。将多粘类芽孢杆菌N3-4菌液、根肿病菌休眠孢子悬浮液以1：1的比例加入灭菌的三角瓶中，以无菌水代替N3-4菌液为对照，24℃黑暗培养。培养5d后在普通光学显微镜下观察，着色的是未萌发的休眠孢子，未着色的是萌发的休眠孢子。计算多粘类芽孢杆菌N3-4对休眠孢子萌发的抑制率。设3次重复，取平均值。

休眠孢子萌发率=(孢子萌发数／调查孢子总数)×100％

休眠孢子萌发抑制率=[(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)／对照孢子萌发率]×100％

试验结果见表2。多粘类芽孢杆菌N3-4能有效抑制根肿病菌休眠孢子的萌发，其原液、100倍稀释液、1000倍稀释液对甘蓝根肿病菌休眠孢子萌发抑制率分别为60.85％、40.58％和16.05％。

表2 多粘类芽孢杆菌N3-4对根肿病菌休眠孢子萌发的抑制作用

实施例3

多粘类芽孢杆菌N3-4代谢分泌物-抗菌相关物质的产生

供试材料：蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉100g，琼脂20g，定容至1000mL。几丁质酶检测培养基：胶状几丁质15g，MgSO4·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，K₂HPO₄0.7g，KH₂PO₄0.3g，琼脂20g，定容至1000mL，pH7.0～7.2。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，NaCl5g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，定容至1000mL，pH7.0。嗜铁素检测培养基：CAS60.5mg，10mL三价铁溶液(1mmol·L^-1FeCl₃.6H₂O)，HDTMA72.9mg，琼脂20g，定容至1000mL，pH7.0。

将江苏省农业科学院筛选获得的多粘类芽孢杆菌N3-4在LB培养基上进行活化，然后移入50mL LB培养液中，在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。在各检测培养基平板中央点接多粘类芽孢杆菌N3-4菌液5μL，每处理重复3皿。28℃恒温培养3-7d，观察。

几丁质酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌几丁质酶。

蛋白酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌蛋白酶。

纤维素酶检测：观察菌落周围有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌纤维素酶。

嗜铁素检测：28℃恒温培养7-10d后观察有无黄色晕圈产生。若产生黄色晕圈，说明该拮抗菌可分泌嗜铁素。

试验结果表明：多粘类芽孢杆菌N3-4不能分泌几丁质酶和嗜铁素；能分泌蛋白酶(图3)；能分泌纤维素酶，在测试平板上能将纤维素分解为可溶性物质，从而形成透明圈(图4)。

如图3和图4所示。

实施例4

5亿多粘类芽孢杆菌N3-4水剂的配制

A、菌种准备及活化。

LB培养基(同实施例1)按常规方法加琼脂后灭菌，做成斜面，28℃培养2d后无污染，接种多粘类芽孢杆菌N3-4，培养温度：28℃；培养时间：2d。

B、液体发酵。

一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入500mL LB培养液(同实施例1)中，共移2瓶。在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

二级发酵：培养基配方：玉米淀粉3.0％，大豆粉0.5％，玉米浆0.4％，鱼粉1.0％，NaCl0.1％，CaCO₃0.3％。灭菌前pH7.0。2吨发酵罐中投料1吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述一级发酵菌种液1000mL。液体发酵温度30℃，搅拌转速250rpm。通气量1：1.5。发酵周期为24小时。

三级发酵：培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵温度30℃，搅拌转速300rpm。通气量1：1.5。发酵周期为36小时左右，发酵液中90％菌体形成芽孢时放罐。

C、水剂配置。

发酵液放入储罐中，加入NNO0.5％、十二烷基苯磺酸钠5％、苯甲酸钠0.1％，搅拌均匀。测得发酵液pH值为5.6，活芽孢数为5×10⁸cfu／mL。灌装，即成5亿多粘类芽孢杆菌N3-4水剂。

实施例5

20亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂的配制

A、菌种准备及活化。同实施例3。

B、液体发酵。同实施例3。

C、制备活菌原粉。

将发酵液放入沉降池中，利用等电点沉降3天后，经碟片式离心机离心去水，留菌浆。菌浆中按体积加入10％(w／v)的轻质碳酸钙(细目325目)，用喷雾干燥方法将菌浆喷干成多粘类芽孢杆菌N3-4的芽孢原粉。喷雾干燥时进口温度175℃，出口风温72℃，获得50亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂。

D、制备可湿性粉剂

助剂选择NNO；粘合剂为聚乙二醇；表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠；填充剂为轻质碳酸钙。

将各组分按照下列重量百分比备料：

50亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂：40％；NNO：7％；聚乙二醇：3％；十二烷基苯磺酸钠：5％；轻质碳酸钙：45％。

制备过程：将50亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂等按上述比例置于混合器中，混合均匀后，经气流粉碎机粉碎至325目过筛，包装，即成20亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂。

实施例6

5亿多粘类芽孢杆菌N3-4水剂对甘蓝根肿病防效的小区试验

试验时间：2013年5月15日在江苏省农业科学院内进行。

试验品种：抗病品种-苏甘26和感病品种-启夏，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。

供试病土：取自宜昌市长阳县火烧坪镇，生理小种4号。

试验药剂和对比药剂：5亿多粘类芽孢杆菌N3-4水剂由实施例4提供。对照药剂为生产上防治甘蓝根肿病的常用化学药剂50％多菌灵(由江苏辉丰农化股份有限公司)，按其田间推荐剂量使用。

田间试验方法：试验甘蓝品种分别为苏甘26号和启夏。用无菌基质进行穴盘育苗，生长30d后移植，进行小区试验，每个小区面积为3m×3m。将无菌土和根肿病病土按照1：1混合后，均匀覆盖于各实验小区表层5-7cm厚。每个小区种植100株甘蓝苗。用多粘类芽孢杆菌N3-4水剂及稀释液灌根，每棵番茄苗灌根20mL，共灌根3次，分别在移植时、移植后10d和移植后20d。设置清水和常用药剂对照。移植30d后调查小区内甘蓝根肿病发生情况，计算防效。甘蓝根肿病病级判断标准如下：

0级：根部无肿瘤；

1级：侧根有小肿瘤；

3级：主根肿大，其直径小于2倍茎基部；

5级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；

7级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4倍；

9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑。

病情指数=[(各级发病数×各级代表值)／(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)=[(对照的病情指数-防治的病情指数)／对照的病情指数]×100％

试验结果见表3。抗病品种-苏甘26清水处理发生根肿病的病情指数是27.46。多粘类芽孢杆菌N3-4 水剂原液、100倍稀释液和1000倍稀释液对甘蓝根肿病的防效分别为74.47％、60.16％和25.93％，常规化学药剂多菌灵的防效不理想，仅为21.78％。感病品种-启夏清水处理发生根肿病的病情指数是52.23，多粘类芽孢杆菌N3-4水剂原液、100倍稀释和1000倍稀释对甘蓝根肿病的防效分别为80.24％、64.69％和21.27％，50％多菌灵的防效为16.37％。结果表明：无论是抗病品种还是感病品种，多粘类芽孢杆菌N3-4水剂均能有效防治甘蓝根肿病。

表3 多粘类芽孢杆菌N3-4水剂对甘蓝根肿病的小区防效测定

实施例7

20亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂对甘蓝根肿病的田间防治试验

试验时间：2013年8月中旬在湖北省宜昌市长阳县火烧坪镇的甘蓝地中进行。

试验品种：京丰一号。

试验药剂和对照药剂：20亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂由实施例5提供。50％多菌灵由江苏辉丰农化股份有限公司提供，按其田间推荐剂量使用。

田间药效试验：甘蓝苗移栽时(8月中旬)，根部土壤撒施20亿多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂，按20kg／亩、10kg／亩、5kg／亩三个剂量处理。移栽后每隔10-15d根部撒施一次，整个生长期共需要用药3-4次。试验设置清水和常用药剂对照。移植30-50d后调查根肿病发生情况，计算防效。每个处理的试验面积为1亩，重复三次，取平均值。

病情分级标准和防治效果计算：同实施例6。

试验结果见表4。多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂20kg／亩、10kg／亩、5kg／亩三个剂量处理的平均防效分别为76.01％、59.73％和37.86％，明显高于对照化学药剂多菌灵的平均防效。

表4多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂对甘蓝根肿病田间防治效果

Claims

1.一种生防菌剂的用途，其特征在于：所述生防菌剂中有效活性成分由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polynyxa)N3-4组成；所述多粘类芽孢杆菌N3-4分泌的代谢产物中包括蛋白酶和纤维素酶两种抗菌相关物质；所述生防菌剂为水剂或可湿性粉剂；所述生防菌剂可用于防治十字花科根肿病。

2.一种防治十字花科根肿病的水剂或可湿性粉剂，其特征在于：各组成及其重量百分含量如下：活性成分10％-99％；助剂0.5％-20％；粘合剂2％-20％；表面活性剂0.5％-20％；防腐剂0.1％-0.5％；填充剂10％-90％。其中活性成分为多粘类芽孢杆菌N3-4；其中助剂选自NNO、氮酮、噻酮中的一种或多种；粘合剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇中的一种或多种；表面活性剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、茶枯粉、皂角粉中的一种或多种；防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或多种；填充剂选自轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、绢云母粉、白碳黑中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌N3-4水剂，其特征在于：各组成及其重量百分含量为：多粘类芽孢杆菌N3-4菌含量：5×10⁸cfu／mL；NNO：0.5％；十二烷基苯磺酸钠：5％；苯甲酸钠：0.1％；水余量；pH6.0-7.0。

4.根据权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌N3-4可湿性粉剂，其特征在于：各组成及其重量百分含量为：多粘类芽孢杆菌N3-4活菌原粉：40％；NNO：7％；聚乙二醇：3％；十二烷基苯磺酸钠：5％；轻质碳酸钙：45％。