CN107857627A - 抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种抗番茄青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺,所述肥料的原材料包括以下成分:胶质芽孢杆菌15~20份、哈茨木霉菌15~20份、细黄链霉菌15~20份、壳寡糖10~35份、植物油泥10~15份、草木灰10~15份,采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺,将三种益生菌结合在一起,同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离,最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对番茄诱导抗性达到对此病的防治,具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。
Description
技术领域
本发明属于肥料加工技术领域,具体涉及一种抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺。
背景技术
番茄,即西红柿(学名:Lycopersiconesculentum Mill.),是茄科番茄属一年生或多年生草本植物,体高0.6-2米,全体生粘质腺毛,有强烈气味,茎易倒伏,叶羽状复叶或羽状深裂,花序总梗长2-5厘米,常3-7朵花,花萼辐状,花冠辐状,浆果扁球状或近球状,肉质而多汁液,种子黄色,花果期夏秋季,番茄是我国家常蔬菜的一种,日常种植量很大。番茄青枯病是由细菌引起的,是细菌性维管束组织病害。叶片表现为,初始顶部新叶萎蔫下垂,后下部叶片发展产生凋萎,接下来才是中部叶片产生凋萎,发病后叶片色泽较淡,呈青枯状。发病初始期植株叶片白天出现萎蔫,傍晚后恢复正常,后很快扩展至整株萎蔫,并不再恢复而死亡;茎表现为,初期为水渍状斑点扩大后呈褐色,病茎下部表皮粗糙,常产生不定根,剖开病茎,维管束变褐色,横切后用于挤压可见乳白色粘液渗出。茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)是引起番茄青枯病的主要病菌,现在,植物青枯病已经成为世界范围内的传播广泛、危害严重的重大病害之一。目前,针对番茄青枯病的防治手段主要是提高番茄的抗性,实现耕作控制、药剂防治和生物防治等,但由于青枯菌长期存活性和寄主范围多样性,导致至今尚无有效的化学农药和其他防治办法,因此青枯病被称为植物的“癌症”。
化学药剂防治青枯病虽然能起到一定的作用,但是长期大量施用化学药剂容易造成环境污染和番茄的药剂残留,严重影响人体健康。生物防治由于其对环境、生态和人畜的安全性而受到了国内外研究者的广泛关注,其主要是通过施用拮抗菌、有机肥或生物有机肥等措施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性,从而抑制土传病害的发生。
壳寡糖是由甲壳素脱乙酰基后经过酶解而得到的低聚糖,可作为植物生长调节剂,增强植物对虫害的防御能力,已有研究表明壳寡糖对番茄花叶病毒病有诱抗效果。
防治番茄青枯病具有一定的历史,如专利申请号 201610767916.9一种预防西红柿青枯病的生物有机肥及其制备方法,采用芽孢杆菌类和霉菌及荧光假单胞菌类添加至有机肥料中,制成生物有机肥来预防番茄青枯病;再如申请号201210004589.3 一种番茄青枯病拮抗菌及其应用公开的16srRNA具有SEQ ID No.1 基因序列的蜡状芽孢杆菌,菌株较为单一;又如申请号 200910183360.9防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料,公开了一株解淀粉芽孢杆菌生产的抗番茄青枯病的生物有机肥料,亦存在菌株单一的问题。以上专利除将拮抗菌添加至肥料当中复配外,并无添加壳寡糖这一能提高番茄抵抗力的有益成分,并且未经粘涂等生产处理,不能达到长效抗病的效果,本发明则能很好地解决这一问题。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对番茄诱导抗性达到对此病的防治,具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。
发明内容
本发明的目的在于提供抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺。
本发明的目的是通过如下措施来达到的:
a)胶状芽孢杆菌菌体制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为蛋白胨1%,牛肉膏0.3%,氯化钠0.5%,pH7.5,121℃灭菌30min, 接入购买菌种,摇床100~150r/min培养24h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为牛肉膏0.4%、酵母浸出粉0.9%、氯化钠 0.3%,pH7.5,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至36℃时,接入5%菌种液,转速100~150r/min培养24~26h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得胶状芽孢杆菌菌体;
b)哈茨木霉菌制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为无琼脂PDA培养基,25℃接入购买菌种,摇床100~150r/min培养 144h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为蔗糖2%、硝酸铵0.5%、磷酸钠0.2%、硫酸镁0.1%,pH9.0,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至25℃时,接入5%菌种,转速100~150r/min 培养144~192h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得哈茨木霉菌菌体;
c)细黄链霉菌制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为无琼脂PDA培养基,30℃接入购买菌种,摇床100~150r/min培养 144h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为葡萄糖1%、淀粉2%、黄豆饼粉1.5%、碳酸钙0.3%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵0.5%、豆油0.5%,pH自然,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至30℃时,接入5%菌种,转速100~150r/min培养144~192h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得细黄链霉菌菌体;
d)配料:称取胶质芽孢杆菌15~20份,哈茨木霉菌15~20 份,细黄链霉菌15~20份,混匀备用;
e)复合菌制粒:使用高速旋转制粒机对混匀的配料进行治粒,加入湿润剂,转速35Hz搅拌制粒,过6目尼龙网后进行沸腾干燥, 45℃干燥至水分为5~8%,获得复合菌颗粒;
f)第一层粘涂:将复合菌颗粒加入回转式颗粒包膜机,转速 10~15r/min,通入50℃热风预热10~15min,用高压喷枪喷入 20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将植物油泥10~15份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入 20~30%酒精溶液,反复操作3~5次,获得包泥颗粒;
g)第二次粘涂:将包泥颗粒中未粘结的植物油泥移除,通入热风预热10~15min,用高压喷枪喷入20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将草木灰10~15份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入20~30%酒精溶液,反复操作 3~5次,获得包灰颗粒;
h)第三次粘涂:将包灰颗粒中未粘结的草木灰移除,通入热风预热10~15min,用高压喷枪喷入20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将壳寡糖10~35份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入20~30%酒精溶液,反复操作3~ 5次,获得包壳寡糖颗粒,50℃烘干至终水分为5~10%,将产品卸出。
优选的,植物油泥包括但不限于豆油泥、油菜籽油泥、花生油泥、棕榈油泥,油泥干燥后粉碎至100~200目。
优选的,草木灰目数100~200目,钾含量≥7%。
本发明的有益效果为:首先,选用对番茄青枯病有拮抗作用的三种菌为原料;第二,制粒后,采用低温45℃烘干,能最大程度保留菌的活力;第三,经过第一次粘涂,将活菌与碱性草木灰形成隔离,同时植物油泥将菌与空气和水进行了隔绝,能够长时间保证菌的较高存活率,且植物油腻在水环境中,溶解缓慢,可以达到缓释的效果,从而使复合菌作用时间更长;第四,草木灰外粘涂壳寡糖,能够达到先溶解壳寡糖诱导作物产生抵抗力,后溶出草木灰将土壤改变成碱性环境,碱性环境不利于茄科雷尔氏菌的生长,但利于本发明三种有益微生物的生长。
与现有技术相比,本发明原料使用更合理,环保高效,生产工艺简单易行,利于放大生产,添加的微生物及壳寡糖具有抗病作用,能增强植物抗逆能力,提高产品质量和产量,同时还具有使用方便的优点。
附图说明
图1是本发明的主要技术路线;
图2是本发明实验例1第一季发病情况;
图3是本发明实验例1第二季发病情况;
图4是本发明实验例1第三季发病情况。
具体实施方式
实施例1:
a)制备胶状芽孢杆菌菌体:菌种购自北纳生物,菌种编号 BNCC173119,制备菌种培养基50kg,配方为蛋白胨0.5kg,牛肉膏0.15kg,氯化钠0.25kg,pH7.5,121℃灭菌30min,接入购买菌种,摇床150r/min培养24h,获得菌种液;制备扩增培养基1t,配方为牛肉膏40kg、酵母浸出粉9kg、氯化钠3kg,pH7.5,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至36℃时,接入50kg 菌种液,转速120r/min培养26h,转出发酵液4000r/min离心 30min,获得胶状芽孢杆菌菌体128.7kg。
b)制备哈茨木霉菌菌体:购自菌种购自上海交通大学木霉菌菌种保藏管理中心,制备菌种培养基,配制无琼脂PDA培养基 50kg,25℃时接入购买菌种,摇床120r/min培养144h,获得菌种液;制备扩增培养基1t,配方为蔗糖20kg、硝酸铵5kg、磷酸钠2kg、硫酸镁1kg,pH9.0,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至25℃时,接入50kg菌种液,转速120r/min培养 190h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得哈茨木霉菌菌体 109.6kg。
c)细黄链霉菌制备:中国工业微生物菌种保藏管理中心,购买菌种,制备菌种培养基,配方为无琼脂PDA培养基50kg,30℃接入购买菌种,摇床150r/min培养144h,获得菌种液;制备扩增培养基1t,配方为葡萄糖10kg、淀粉20kg、黄豆饼粉15kg、碳酸钙3kg、磷酸氢二钾0.5kg、硫酸铵5kg、豆油5kg,pH自然,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至30℃时,接入 50kg菌种液,转速150r/min培养192h,转出发酵液4000r/min 离心30min,获得细黄链霉菌菌体87.3kg。
d)配料:称取胶质芽孢杆菌128.7kg,哈茨木霉菌109.6kg,细黄链霉菌87.3kg,混匀备用。
e)复合菌粉制粒:使用高速旋转制粒机对混匀的配料进行制粒,加入湿润剂,转速35Hz搅拌制粒,过6目尼龙网后进行沸腾干燥,45℃干燥至水分为6%,获得复合菌颗粒121.5kg。
f)第一层粘涂:将复合菌颗粒加入回转式颗粒包膜机,转速 10r/min,通入50℃热风预热15min,用高压喷枪喷入20%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风3min,将植物油泥60kg均匀地加入包膜机中,转动10min后再用高压喷枪喷入30%酒精溶液少量,反复操作5次,获得包泥颗粒177.3kg。
g)第二次粘涂:将包泥颗粒中未粘结的植物油泥移除,通入热风预热15min,用高压喷枪喷入30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风3min,将草木灰60kg均匀地加入包膜机中,转动 10min后再用高压喷枪喷入30%酒精溶液少量,反复操作5次,获得包灰颗粒214.1kg。
h)第三次粘涂:将包灰颗粒中未粘结的草木灰移除,通入热风预热15min,用高压喷枪喷入30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风3min,将壳寡糖120kg均匀地加入包膜机中,转动 10min后再用高压喷枪喷入30%酒精溶液少量,反复操作5次,获得包壳寡糖颗粒,50℃烘干至终水分为6%,将产品卸出,共 315.9kg。
实验例1:番茄青枯病盆栽防病试验
使用实施例1的方法所生产的复合微生物菌剂进行盆栽防病试验,试验步骤如下:
实验番茄品种于当地购买“农博粉霸15号”,青枯病病原菌茄科雷尔氏菌购自北纳生物编号BNCC221120,实验土壤取自烟台市莱山镇友谊村大田,为易发生番茄青枯病的土壤,质地砂壤, pH=5.3,有机质7.3g/kg,全氮(N)0.762g/kg,全磷 (P2O5)0.577g/kg,全钾(K2O)15.3g/kg。试验共设置3个处理,分别为:T1:使用金正大多抗微生物菌剂进行灌根,施用量为 3ml/m2;T2:使用本发明菌剂进行撒施,施用量为5g/m2;T3:不使用菌剂,作为对照。设计3季试验,每季试验进行3个处理,每个处理30株,每季前施用番茄双硫基硝态氮硫酸钾复合肥。
第一季高发病土壤试验:番茄苗生长3周后,通过向健康土壤中注入病菌法,使得土壤病原菌数达到107以上,使番茄苗处于高浓度病原菌的环境中,其余为常规自然条件(温度25~35℃,湿度60~80%)。第二季高发病自然条件试验:第一季盆栽结束后,各处理盆栽土分开储存放置15天,保持湿度以维持病原菌数。第三季番茄正常条件生长试验:第二季盆栽结束后,各处理盆栽土同样分开存储放置15天,保持湿度。观察番茄苗生长情况,统计发病率,当对处理T3发病率达到80%时结束试验。发病等级如下: 0级:叶面无萎蔫;1级:植株20%以下叶面出现萎蔫;2级:植株20~30%的叶面出现萎蔫;3级:植株30%~60%的叶面出现萎蔫;4级:植株60%以上的叶面萎蔫或死亡。
病情指数=∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100%
本试验于2015~2016年在烟台丰成农业科技有限公司完成,当番茄生长2个月,株高约10cm时,进行盆栽移植,每3天记录一次,结果如下:
第一季盆栽,移栽第5周左右出现病例,发病前期,发病过程较缓慢,后发病率快速上升,由结果知T1和T2都较对照组发病率更低,都未到达45%,且发明菌剂较金正大菌剂发病率减少 10%;第二季盆栽,移植第2天开始出现病例,对照组成指数增长, T1和T2组发病率增长平缓,且发明菌剂较正大菌剂发病率低;第三季盆栽第2周出现病例,对照组病情指数增长迅速,而T1和 T2组病情指数增长平缓,且发明菌剂较金正大菌剂由较明显的低发病率。可见,本发明菌剂能有效防治番茄青枯病。
实验例2:番茄青枯病防治田间试验
使用实施例1的方法所生产的复合微生物菌剂进行田间试验,自2016年4月至2016年9月于烟台市福山区小河子村进行田间试验,供试试验田为近年来青枯病发病率较严重的地块,且经过有机肥施撒,实验番茄品种为农博粉霸1316。试验设置2个处理,分别为:T1:使用本发明菌剂进行撒施,施用量为5kg/667m2; T2:不使用菌剂,作为对照组。每个处理重复4次,小区面积100m2。
于种植30d、60d、90d、120d观察发病情况,病级:0级为叶面无症状;1级为植株上1/4以下叶面表现萎蔫状;二级为1/4~ 1/2叶面表现萎蔫状;3级为植株1/2以上叶面表现萎蔫症状;4 级为全株萎蔫死亡。
发病率=(发病株数/调查株数)×100%
病情指数=∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100%
防控效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数× 100%
表1不同处理番茄青枯病发病情况比较
栽培60天以后,发病率明显不同,未施菌剂的对照组,发病率为菌剂组发病率的5倍,且随时间推移,对照组发病率越来越高,最终达到一半植株发病,而施用发明菌剂组发病率最高为12.91%,且其各时期的病情指数也较对照组明显较低,说明病情不严重,防治效果皆在80%以上,可见本发明菌剂能显著防治番茄青枯病。
Claims (3)
1.抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺,其特征如下:
a)胶状芽孢杆菌菌体制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为蛋白胨1%,牛肉膏0.3%,氯化钠0.5%,pH7.5,121℃灭菌30min,接入购买菌种,摇床100~150r/min培养24h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为牛肉膏0.4%、酵母浸出粉0.9%、氯化钠0.3%,pH7.5,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至36℃时,接入5%菌种液,转速100~150r/min培养24~26h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得胶状芽孢杆菌菌体;
b)哈茨木霉菌制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为无琼脂PDA培养基,25℃接入购买菌种,摇床100~150r/min培养144h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为蔗糖2%、硝酸铵0.5%、磷酸钠0.2%、硫酸镁0.1%,pH9.0,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至25℃时,接入5%菌种,转速100~150r/min培养144~192h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得哈茨木霉菌菌体;
c)细黄链霉菌制备:购买菌种,制备菌种培养基,配方为无琼脂PDA培养基,30℃接入购买菌种,摇床100~150r/min培养144h,此为菌种液;制备扩增培养基,配方为葡萄糖1%、淀粉2%、黄豆饼粉1.5%、碳酸钙0.3%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵0.5%、豆油0.5%,pH自然,转入发酵罐进行高温灭菌,灭菌后待温度降低至30℃时,接入5%菌种,转速100~150r/min培养144~192h,转出发酵液4000r/min离心30min,获得细黄链霉菌菌体;
d)配料:称取胶质芽孢杆菌15~20份,哈茨木霉菌15~20份,细黄链霉菌15~20份,混匀备用;
e)复合菌制粒:使用高速旋转制粒机对混匀的配料进行治粒,加入湿润剂,转速35Hz搅拌制粒,过6目尼龙网后进行沸腾干燥,45℃干燥至水分为5~8%,获得复合菌颗粒;
f)第一层粘涂:将复合菌颗粒加入回转式颗粒包膜机,转速10~15r/min,通入50℃热风预热10~15min,用高压喷枪喷入20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将植物油泥10~15份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入20~30%酒精溶液,反复操作3~5次,获得包泥颗粒;
g)第二次粘涂:将包泥颗粒中未粘结的植物油泥移除,通入热风预热10~15min,用高压喷枪喷入20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将草木灰10~15份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入20~30%酒精溶液,反复操作3~5次,获得包灰颗粒;
h)第三次粘涂:将包灰颗粒中未粘结的草木灰移除,通入热风预热10~15min,用高压喷枪喷入20~30%酒精溶液至颗粒微微粘结,通入50℃热风2~3min,将壳寡糖10~35份均匀地加入包膜机中,转动5~10min后再加入20~30%酒精溶液,反复操作3~5次,获得包壳寡糖颗粒,50℃烘干至终水分为5~10%,将产品卸出。
2.权利要求1所述的抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺,其特征在于,所述植物油泥包括但不限于豆油泥、油菜籽油泥、花生油泥、棕榈油泥,油泥干燥后粉碎至100~200目。
3.权利要求1所述的抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺,其特征在于,所述草木灰目数100~200目,钾含量≥7%。
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CN111454098A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-07-28 | 沃博特生物科技有限公司 | 一种双膜控释肥包膜方法 |
CN112493240A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-16 | 广西安农聚智科技有限公司 | 一种用于西红柿青枯病的防治剂及其制备方法 |
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2017
- 2017-05-14 CN CN201710337305.5A patent/CN107857627A/zh not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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