CN115786168B - 一种高效耐盐碱解磷菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及磷微生物肥料技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐碱胁迫的解磷菌及其应用。其中，所述解磷菌的分类命名为微小杆菌(Exiguobacteriumsp.)，命名为DYS212，保藏日期为2022年4月29日，保藏号为CGMCCNo.24822，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的解磷菌能够耐受pH＝10.0，10％NaCl的盐碱条件，同时具有较高的解磷功能，尤其适用于盐碱地土壤改良或盐碱地生物改良。

Description

一种高效耐盐碱解磷菌及其应用

技术领域

本发明涉及解磷微生物肥料技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐碱胁迫的解磷菌及其应用。

背景技术

磷是仅次于氮的植物代谢、生长和发育所需的第二重要常量营养素，土壤呈碱性时(pH>7)，磷元素主要以Ca₃(PO₄)₂的无效磷形式存在。植物中的磷主要从土壤中获取，但我国大部分盐碱地区存在总磷含量高、有效磷含量低问题，可吸收磷仅占总磷含量的0.1％。一方面，较高的固磷能力导致土壤磷有效性降低。另一方面，随着我国施肥量的增加，土壤磷积累增多，但是利用率只有10-15％，大部分累积在土壤中转变成无效态，盐碱胁迫下的土壤可利用养分含量低是限制植物生长和生产力的主要因素。因此，如何利用原位土壤中难溶性磷是长效提升盐碱土壤有效磷含量的关键。

解磷菌是能够使土壤中无机磷酸盐溶解或有机磷酸盐矿化、促进植物生长的一类微生物，在不溶磷和可溶性磷的转化和生物地球化学循环中发挥着至关重要的作用。目前已报道的解磷细菌主要集中在芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、杆菌属、节杆菌属等几个属中，且已有报道中不同菌属、同一菌属不同菌种之间的解磷效果不同，在盐碱地中的应用效果不一。目前筛选出的解磷菌株盐碱耐受力普遍不高，在盐碱土中溶磷效果差，因此，解磷菌株作为微生物菌剂改良盐碱土尚未成功得到全面应用。

因此，通过筛选选出能耐受高盐碱环境胁迫的解磷菌对于开发稳定高效应用于盐碱土壤的解磷菌生物肥料具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了一种耐盐碱且具有高效解磷作用的微小杆菌及其应用，在盐碱条件下种植盐地碱蓬，并接种该菌株，盐地碱蓬种子发芽率大大提高，因此本发明具有良好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效耐盐碱的解磷菌，所述解磷菌的分类命名为微小杆菌(Exiguobacteriumsp.)，命名为DYS212，保藏日期为2022年4月29日，保藏号为CGMCC No.24822，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

根据权利要求1所述的高效耐盐碱解磷菌，该菌株16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。

具体地，还包括所述高效耐盐碱解磷菌在制备耐盐碱解磷剂中的应用。

具体地，还包括所述高效耐盐碱解磷菌在制备盐碱地土壤改良剂中的应用。

具体地，所述菌株能在pH7.0-10.0的碱性环境和/或0-5.0％的NaCl环境下发挥解磷作用。

具体地，所述微小杆菌在土壤改良或盐碱地生物改良中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的耐盐碱解磷菌：微小杆菌较其他菌株具有更强的解磷能力，盐碱耐受性较高，通过在盐碱地区接种该微小杆菌，土壤有效磷含量改善，在盐地碱蓬实验中也表现出较好的促发芽效果，可提高植物繁育率，以达到改善生态环境的效果，具有良好的应用前景。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种高效耐盐碱解磷菌及其应用，通过在盐碱地区接种该微小杆菌，土壤有效磷含量改善，植物繁育率增强，有效改善生态环境。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例中微小杆菌无机磷解磷动力学曲线，注：AP：有效磷；Bacterial absorbance：细菌吸光度；

图2附图为本发明实施例中不同NaCl浓度对微小杆菌解无机磷能力的影响，注：AP：有效磷；Terminal pH：终点pH值；

图3附图为本发明实施例中不同pH值对微小杆菌解磷能力的影响，注：AP：有效磷；TerminalpH：终点pH值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种高效耐盐碱的解磷菌，其特征在于，所述解磷菌的分类命名为微小杆菌(Exiguobacterium sp.)，命名为DYS212，保藏日期为2022年4月29日，保藏号为CGMCC No.24822，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

筛菌样品采样于黄河三角洲滩涂(37°43′12″N,113°12′40″E)鸟粪中，盐地碱蓬种子从黄河三角洲滩涂(37°33′17″N,118°56′2″E)上生长的野生植株上收集，通过稀释平板涂布法筛选出该菌株。

进一步地，利用16SrDNA通用引物序列F27和R1492对筛选得到的菌株进行PCR扩增，完成后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明该菌株与Exiguobacteriumsp.MH3、Exiguobacterium enclense、Exiguobacterium indicum的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株被鉴定为微小杆菌(Exiguobacterium sp.)。

进一步地，所述通用引物F27和R1492的序列分别为(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)。

实施例1：解磷菌菌株分离

本发明中的解磷菌菌株采用稀释平板涂布法从黄河三角洲滩涂鸟粪中分离得到，菌株培养使用LB培养基，无机磷解磷能力测定使用无机磷培养基。LB培养基组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。无机磷培养基由青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供。

实施例2：菌株鉴定

利用16SrDNA通用引物序列F27和R1492对筛选得到的菌株进行PCR扩增，完成后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，该菌株16SrDNA碱基如下所示：

CCTGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGCAGGAAACTGACGGAACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAAGGAACCTGCCTCAAGGATTGGGATAACTCCGAGAAATCGGAGCTAATACCGGATAGTTCATCGGACCGCATGGTCCGTTGATGAAAGGCGCTCCGGCGTCACCTTGAGATGGCCTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACACGTACGAGAGGAAATGCTCGTACCTTGACGGTACCTTACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGAAGGCTTGAGTACAGAAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGGTTTCCGCCCCTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAACTCTTGACATCCCATTGACCGCTTGAGAGATCAAGTTTTCCCTTCGGGGACAATGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGGTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAGACCGAGAGGTGGAGCCAATCCCATAAAGCCGTTCCCAGTTCGGATTGCAGGTTGCAAATCGCCTGCATGAAGTGGGAATGGATAGTAATCGCAGGTCAGCATAATAAGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACAACAAGAGAAAAAGCAACACCCGAAACCGGGAGGTGACCGCAAGGAGACAACCTTCGAAGGTTGGGAAAAT，如SEQ ID NO.1所示。

将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明该菌株与Exiguobacteriumsp.MH3、Exiguobacterium enclense、Exiguobacterium indicum的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株被鉴定为微小杆菌(Exiguobacterium sp.)。

实施例3：菌株生长及解磷能力测定

将菌株活化后，取各菌株种子液(OD₆₀₀约为1)，按1％接种量分别转接至无机磷液体培养基、有机磷液体培养基中培养，混合均匀后置于28℃，180r/min摇床培养，连续7d每隔12h吸取发酵液，每个菌株设置3个重复，取平均值。以不接菌培养基为空白对照，根据钼蓝比色法测定解磷菌发酵液中的可溶性磷含量，每株菌进行4次重复。以发酵液为空白对照调零，根据计算公式(如下)计算得到菌株发酵液中有效磷的净释放量以判断相应菌株的解磷能力，并测定菌体细胞在600nm下的吸光度值以判断菌体细胞生长情况，以菌株的生长时间为横坐标，细菌吸光度、有效磷含量为纵坐标绘制解磷菌的解磷动力学曲线，结果见图1。

菌株的计算公式如下：

P＝K×(V1÷V2)

其中：P为有效磷含量；K为从标准曲线查得的磷含量(mg/L)；V1为显色时溶液定容的体积(mL)；V2为显色时吸取上清液的体积(mL)。

由图1可知，该菌株随着时间生长逐渐增强，在前12h增长迅速，之后逐渐减缓增长；解磷量在48h达到峰值为160.59mg/L，之后逐渐降低。

实施例4：菌株耐盐碱能力测定

以无机磷液体培养基为基础培养基，将保存的菌种活化后，取各菌株种子液(OD₆₀₀约为1)，按1％接种量转接至液体培养基中，根据生长曲线确定培养时间，培养时间所选取的依据为各个菌株的解磷动力学曲线中解磷峰值处，分别配置不同盐浓度(0％、1％、2.5％、4％、5.5％、7％、8％、9％、10％、20％和30％)、pH(7、8、9、10、11和12)的培养基(每组3个重复)，并于28℃，180r/min摇床培养，培养完成后吸取1mL发酵液于6000r/min离心12min，测定发酵液的有效磷含量、发酵液终点pH情况。以NaCl浓度为横坐标，有效磷浓度、终点pH值为纵坐标绘制不同NaCl浓度对微小杆菌解无机磷能力的影响曲线，结果见图2。以pH值为横坐标，有效磷浓度、终点pH值为纵坐标绘制不同pH对微小杆菌解无机磷能力的影响曲线，结果见图3。

由图2可知，该菌株在2.5％盐浓度范围内解无机磷的能力逐渐增强，最高达410.73mg/L，后逐渐降低，在10％盐度范围内达到一般解磷水平；解磷量与终点pH值成反比，说明解磷过程中产生了酸性物质。

由图3可知，随着pH的增加，菌株的无机磷解磷能力逐渐降低，最高可耐pH＝10时的胁迫，pH＝7时，菌株的解磷能力最强，为406.09mg/L。

实施例5：菌株影响盐地碱蓬发芽率测定

挑选籽粒饱满、均匀一致的盐地碱蓬种子，用75％的乙醇消毒1min，无菌水洗涤3次后用10％次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤5次后风干。将消毒后的盐地碱蓬种子分别浸泡在不同菌株的种子液(OD₆₀₀约为1)中处理3h，以未接菌的培养基作为对照浸泡处理3h，之后用无菌水冲洗5次，吸水纸吸干表面水分备用。

向灭菌平板中分别加入10mL不同浓度的处理溶液，在平板底部平铺单层灭菌滤纸，每个平板均匀放置经过不同预处理的盐地碱蓬种子30粒，用封口膜密封，以保持各处理浓度不变。

本试验采用双因素试验设计，其中一个因子为盐、碱、盐碱混合胁迫处理，对照组(CK1)采用无菌水处理，另一个因子为菌株接种处理，对照组(CK2)采用未接种的LB培养基代替菌株悬液处理，每个处理设置3个重复，具体的试验设计方案如表1。试验在人工气候箱中进行，人工气候箱设置条件：白天：光照时间12h/d，相对湿度70％，白天光强80％，25℃恒温，夜间20℃恒温，结果见表2。

表1双因素试验设计

试验以种子胚根突破种皮1mm为发芽标准，每日定时观察，并记录每天的发芽数量，第4d计算发芽势，共计观察5d。按照以下公式计算种子的发芽率、抑制率(相对盐害率)、菌株接种的促生率、发芽势、发芽指数等。

种子发芽率(G)＝实际发芽数/种子总数×100％；

抑制率＝(对照组发芽率-处理组发芽率)/对照组发芽率×100％；

促生率＝(处理组发芽率-对照组发芽率)/对照组发芽率×100％；

发芽势＝4d内供试种子的发芽数/供试种子数×100％；

发芽指数GI＝∑Gt/Dt，式中，Gt为时间t日的萌发数，Dt为相应的萌发天数。

当未接种解磷菌时，在Y3、J3、Y3-J3混合胁迫条件下，5d内盐地碱蓬种子的发芽率降低，种子的盐害抑制率高于其他对照组。通过该解磷菌接种3h浸种处理，在不同的盐碱胁迫处理下，与对照组相比，种子的发芽势、发芽率、发芽指数存在一定程度的提高。在盐浓度450mM处理条件下，菌株对盐地碱蓬种子的促生率达到4.17％；在碱浓度150mM处理条件下，微小杆菌对盐地碱蓬种子的促生率达到5.26％；而在盐-碱浓度450mM-150mM的条件下，菌株对盐地碱蓬种子的促生率为4.23％。总体上，在高盐碱条件下，该微小杆菌对盐地碱蓬发芽率的促生作用更明显。

表2不同处理不同盐碱条件下盐地碱蓬生长情况

注：Y1、Y2、Y3表示盐浓度150mM、300mM、450mM处理，J1、J2、J3表示碱浓度50mM、100mM、150mM处理，Y1-J1、Y2-J2、Y3-J3表示盐-碱浓度150mM-50mM、300mM-100mM、450mM-150mM处理。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种耐盐碱的解磷菌，其特征在于，所述解磷菌的分类命名为微小杆菌(Exiguobacterium sp.)，命名为DYS212，保藏日期为2022年4月29日，保藏号为CGMCCNo.24822，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述菌株16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的耐盐碱解磷菌在制备耐盐碱解磷剂中的应用。

3.权利要求1所述的耐盐碱解磷菌在制备盐碱地土壤改良剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述盐碱地土壤改良剂在pH7.0-10.0的碱性环境和/或0-5.0％的NaCl环境下发挥解磷作用。

5.权利要求3中的盐碱地土壤改良剂在土壤改良或盐碱地生物改良中的应用。