CN115873745B

CN115873745B - 一种耐盐碱的解磷菌及其应用

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Publication number: CN115873745B
Application number: CN202210938268.4A
Authority: CN
Inventors: 孙晓丹; 王炜; 衣世杰; 郑风荣; 张朝晖
Original assignee: First Institute of Oceanography MNR
Current assignee: First Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2022-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-08-05
Also published as: CN115873745A

Abstract

本发明公开了一种耐盐碱的解磷菌及其应用。属于解磷微生物技术领域。所述解磷菌为芽孢杆菌DYS211，其已于2022年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24821。本发明的芽孢杆菌DYS211能够耐受pH＝10、10％NaCl的盐碱条件，同时具有较高的解磷能力，培养2天后，解磷量达到258.22mg/L；盐碱条件下接种该菌株后，盐地碱蓬生物量总干重增加3倍，具有较高的应用价值。

Description

一种耐盐碱的解磷菌及其应用

技术领域

本发明涉及解磷微生物技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐碱的解磷菌及其应用。

背景技术

盐碱胁迫下的土壤可利用养分含量低是限制植物生长和生产力的主要因素。磷是仅次于氮的植物代谢、生长和发育所需的第二重要常量营养素。植物中的磷主要从土壤中获取，但可吸收磷仅占总磷含量的0.1％。土壤呈碱性时(pH>7)，磷元素主要以Ca₃(PO₄)₂的无效磷形式存在；盐度则通过土壤水势的降低、植物组织中离子积累的毒性效应以及氧化还原稳态改变导致的氧化应激对植物产生有害影响。一方面，较高的固磷能力导致土壤磷有效性降低。另一方面，随着施肥量的增加，土壤磷积累增多，但是利用率只有10～15％，大部分累积在土壤中转变成无效态。因此，大部分盐碱地区存在总磷含量高、有效磷含量低问题，如何利用原位土壤中难溶性磷是长效提升盐碱土壤有效磷含量的关键。

解磷菌是能够使土壤中无机磷酸盐溶解或有机磷酸盐矿化、促进植物生长的一类微生物，在不溶磷和可溶性磷的转化和生物地球化学循环中发挥着至关重要的作用。目前已报道的解磷细菌主要集中在芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、杆菌属、节杆菌属等，但已有报道中不同菌属、同一菌属不同菌种之间的解磷效果不同，在盐碱地中的应用效果不一。目前筛选出的解磷菌株盐碱耐受力普遍不高，在盐碱土中溶磷效果差，作为微生物菌剂改良盐碱土尚未成功得到全面应用。

综上，筛选既能耐受高盐又能耐受高碱环境的解磷菌、开发稳定高效应用于盐碱土壤的解磷菌生物肥料是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种耐盐碱的解磷菌及其应用。本发明的解磷菌可以增加土壤有效磷含量，改善土壤条件，促进植物生长。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐盐碱的解磷菌，所述解磷菌为芽孢杆菌DYS211，其已于2022年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24821，分类命名为芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus sp.，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

进一步的，所述解磷菌可以在pH＝10、10％NaCl的盐碱环境中生存。

上述的解磷菌在解磷中的应用。

上述的解磷菌在增加土壤有效磷含量、改善土壤条件、促进植物生长方面的应用。

一种耐盐碱菌剂，包括上述的解磷菌。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明的芽孢杆菌DYS211能够耐受pH＝10、10％NaCl的盐碱条件，同时具有较高的解磷能力，培养2天后，解磷量达到258.22mg/L；盐碱条件下接种该菌株后，盐地碱蓬生物量总干重增加3倍，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例2中芽孢杆菌DYS211的无机磷解磷动力学曲线，其中AP代表有效磷；Bacterial absorbance代表细菌吸光度；

图2附图为本发明实施例3中不同NaCl浓度对芽孢杆菌DYS211解无机磷能力的影响，其中AP代表有效磷；Terminal pH代表终点pH值；

图3附图为本发明实施例3中不同pH值对芽孢杆菌DYS211解无机磷能力的影响，其中AP代表有效磷；Terminal pH代表终点pH值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

(1)菌株来源

筛菌样品采样于黄河三角洲滩涂(37°43′12″N,113°12′40″E)鸟粪中，筛选步骤如下：

取5g盐碱土壤于灭菌锥形瓶中，量取45mL灭菌水，加入锥形瓶中，摇床震荡混匀30min。取上清液进行一系列浓度的稀释直至到10^-6。选取浓度为10^-3至10^-5的稀释液0.1mL，在磷酸三钙无机磷和卵磷脂有机磷平板培养基上进行涂布培养。28℃培养2～3d后，利用灭菌接种环挑取菌落周围有明显透明圈的单菌落，分别在无机磷培养基和有机磷培养基平板上划线进行纯化，依次重复操作2～3次，直至平板上长出单菌落菌株。

菌株培养基为LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)，无机磷解磷能力测定使用无机磷培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

(2)菌株鉴定

通过稀释平板涂布法筛选出该菌株，命名为DYS211。利用16SrDNA通用引物序列F27和R1492对筛选得到的菌株进行PCR扩增，完成后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果见SEQ ID NO.1。将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)和嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)的基因序列的同源性在99.5％以上，分离菌株被鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。

GGGGGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACA CCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTTGACCCT；SEQ ID NO.1。

上述菌株于2022年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24821，分类命名为芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus sp.，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2

菌株DYS211生长及解磷能力测定

将菌株DYS211活化后，取菌株种子液(OD₆₀₀约为1)，按1％接种量分别转接至无机磷液体培养基中培养，混合均匀后置于28℃，180r/min摇床培养，连续7d每隔12h吸取发酵液，设置3个重复，取平均值。依次吸取2mg/L磷标准溶液0.00,0.50,1.00,3.00,5.00,10.00,15.00,加入50ml比色管，加蒸馏水至50ml刻度线，然后各加入1ml抗坏血酸，30s后加入2ml钼酸盐溶液，摇匀静置15～20min后，700nm下测定吸光度。得到磷标准曲线。根据计算公式(如下)计算得到菌株发酵液中有效磷的净释放量以判断菌株的解磷能力，并测定菌体细胞在600nm下的吸光度值以判断菌体细胞生长情况，绘制解磷菌的解磷动力学曲线。

以不接菌培养基为空白对照，根据钼蓝比色法测定解磷菌发酵液中的有效磷含量，每株菌进行3次重复。

计算公式如下：

P＝K×(V1÷V2)

其中：P为有效磷含量；K为从标准曲线查得的磷含量(mg/L)；V1为显色时溶液定容的体积(mL)；V2为显色时吸取上清液的体积(mL)。

磷标准曲线如下：

y＝1.8698x+0.0005，R²＝0.9996。x为700nm下的吸光度，y为有效磷含量。

解磷菌对无机磷的解磷能力结果如图1所示。

图1结果表明，菌株DYS211随着时间生长逐渐增强，在前12h增长迅速，之后逐渐减缓增长；解磷量在48h达到峰值为258.22mg/L，之后逐渐降低。

实施例3

菌株DYS211耐盐碱能力测定

以无机磷液体培养基为基础培养基，分别配置不同盐浓度(0％、1％、2.5％、4％、5.5％、7％、8％、9％、10％、20％和30％)、pH(7、8、9、10、11和12)的培养基(每组3个重复)。

将保存的菌种活化后，取菌株种子液(OD₆₀₀约为1)，按1％接种量转接至无机磷液体培养基中，并于28℃180r/min摇床培养，根据实施例2生长曲线确定培养时间，培养时间所选取的依据为菌株的解磷动力学曲线中解磷峰值处，即48h。

培养完成后吸取1mL发酵液于6000rpm/min离心12min，测定发酵液的有效磷含量、发酵液终点pH情况。

结果如图2、图3所示。

菌株DYS211在4％盐浓度范围内解无机磷能力逐渐增强，达到224.86mg/L，后逐渐降低，可在10％盐度范围内达到一般解磷水平；解磷量与终点pH值成反比，说明解磷过程中产生了酸性物质(图2)。

随着pH的增加，菌株DYS211的无机磷解磷能力逐渐降低，最高可耐pH＝10时的胁迫，pH＝7时，菌株DYS211的解磷能力最强，为199.44mg/L(图3)。

实施例4

菌株DYS211影响盐地碱蓬生长测定

盐地碱蓬种子从黄河三角洲滩涂(37°33′17″N,118°56′2″E)上生长的野生植株上收集。

试验采用双因素试验设计，其中一个因子为盐、碱、盐碱混合胁迫处理，对照组(CK1)采用无菌水处理，另一个因子为菌株接种处理，对照组(CK2)采用未接种的LB培养基代替菌株悬液处理，具体的试验设计方案如表1，每个处理设置5个重复。

采取盆栽方法，以播种密度为每盆10颗进行播种，其中每盆土壤质量为300g。无菌水或钠盐溶液每3d定量浇灌1次，以保持土壤湿润且水分恒定为宜。试验在人工气候箱中进行，人工气候箱设置条件：白天：光照时间12h/d，相对湿度70％，白天光强80％，25℃恒温，夜间20℃恒温。

表1双因素试验设计

播种6d后对植株进行第1次钠盐胁迫处理，为防止过高的盐度冲击导致烧苗，盐(NaCl)胁迫以每次150mM为浇灌浓度直至达到目标浓度，碱(物质的量之比：Na₂CO₃:NaHCO₃＝1:1)胁迫以每次50mM为浇灌浓度直至达到目标浓度，盐(NaCl)-碱(物质的量之比：Na₂CO₃:NaHCO₃＝1:1)胁迫以每次150mM-50mM为浇灌浓度直至达到目标浓度；播种21d、45d后分别对植株进行第2次、第3次钠盐胁迫处理，处理方式同第1次钠盐胁迫处理，以每次达到目标浓度为1次钠盐胁迫处理；播种15d后对植株进行第1次菌株稀释悬液处理，其中菌株稀释悬液的制备方式如下：将活化好的种子液(OD₆₀₀约为1)用无菌水以1:9的比例稀释，并向每盆中均匀加入10mL菌株稀释悬液；播种40d后对植株进行第2次菌株稀释悬液处理，接种量为第1次的50％，同时在播种42d后浇灌Hoagland(缺磷)营养液100ml/盆。在处理过程中进行间苗，最终每盆保留4株盐地碱蓬，第60d收获时分别测量盐地碱蓬的株高、基茎、地上生物量(干重)、地下生物量(干重)。

结果见表2。

接种菌株DYS211后，盐地碱蓬在株高、基茎、生物量方面均有显著促生长效果，特别是在盐碱胁迫后，促生效果更显著。比起株高增高、基茎增粗，盐地碱蓬干重总生物量的变化更显著。在300mM、450mM盐浓度处理条件下，接种菌株DYS211的盐地碱蓬总生物量较对照CK2分别增加了1.5倍和3倍；在盐-碱浓度150mM-50mM的条件下，接种菌株DYS211的盐地碱蓬总生物量增加1.5倍；在盐-碱浓度300mM-100mM的条件下，接种菌株DYS211的盐地碱蓬总生物量增加了3倍(表2)。

表2不同处理不同盐碱条件下盐地碱蓬生长情况

注：Y1、Y2、Y3表示盐浓度150mM、300mM、450mM处理，J1、J2、J3表示碱浓度50mM、100mM、150mM处理，Y1-J1、Y2-J2、Y3-J3表示盐-碱浓度150mM-50mM、300mM-100mM、450mM-150mM处理。

本发明提出的耐盐碱解磷菌：芽孢杆菌DYS211较其他耐盐碱解磷菌具有盐碱耐受性高的优点，且作为芽孢杆菌的一种，对不利条件具有特殊抵抗力，存活条件相对较低，在盐地碱蓬试验中也表现出较好的促生效果，具有良好的应用前景。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种耐盐碱的解磷菌，其特征在于，所述解磷菌为芽孢杆菌(Bacillussp.)DYS211，其已于2022年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24821。

2.如权利要求1所述的一种耐盐碱的解磷菌，其特征在于，所述解磷菌可以在pH＝10、10％NaCl的盐碱环境中生存。

3.权利要求1所述的解磷菌在解磷中的应用。

4.权利要求1所述的解磷菌在增加土壤有效磷含量、改善土壤条件、促进植物生长方面的应用。

5.一种耐盐碱菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的解磷菌。