CN112143678A - 一株耐环境胁迫菌株xn-k13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐环境胁迫菌株XN‑K13，所述耐环境胁迫菌株XN‑K13分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN‑K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。本发明提供的耐环境胁迫菌株XN‑K13能够耐缺钾、耐高盐碱、耐重金属、耐干旱环境胁迫，耐环境胁迫菌株XN‑K13还能够提高植物耐环境胁迫的能力，耐环境胁迫菌株XN‑K13对盐胁迫下、镉(Cd)胁迫下、干旱胁迫下的玉米种子和幼苗的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重均具有显著的促进作用。

Description

一株耐环境胁迫菌株XN-K13及其应用

技术领域

本发明属于植物促生菌技术领域，具体涉及的是一种高效耐盐解难溶态钾的耐环境胁迫菌株XN-K13及其应用。

背景技术

化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用，但是随着化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。农药和化肥残留，向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成了极大威胁，要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。因此，开发利用替代化学肥料的新肥源，以适应发展绿色农业和绿色食品的需要已是当务之急。而微生物肥料可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途径，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。

微生物肥料是一类含有微生物活体的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应，其中，制品中活微生物起关键作用。目前，一般将微生物肥料制品分为两大类：一类是狭义的微生物肥料，指通过微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量，导致植物营养状况的改善，进而增加产量；这一类微生物肥料的代表是根瘤菌肥；另一类是广义的微生物肥料，指通过其中微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作物病虫害间接提高作物产量。与化学肥料相比，微生物肥料具有以下优点：不破坏土壤结构；保护生态、不污染环境，对人畜无毒无害；肥效持久；提高作物产量，改善作物品质；成本低廉，经济有效。

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria PGPR)是一类能高密度定殖在植物根际的微生物，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用。作为生物肥料和生物农药的重要资源库，PGPR的研究和应用已经起到了举足轻重的作用，从资源再生利用的角度来研究和开发微生物肥料则对资源综合利用和环境保护更具有现实意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种能耐盐解难溶态钾的菌株XN-K13及其应用，该菌是一种新的植物根际促生菌，可应用于解除环境胁迫，促进植物生长。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株耐环境胁迫菌株XN-K13，分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13在耐环境胁迫环境中的应用。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13在提高植物耐环境胁迫能力中的应用。

优选地，所述环境胁迫为缺钾胁迫环境、高盐碱环境胁迫、重金属环境胁迫和干旱环境胁迫。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13在缺钾胁迫环境中的应用，所述耐环境胁迫菌株XN-K13通过产酸的方式将难溶性钾转化成植物可以吸收利用的速效钾，从而提高植物对钾离子的吸收，解除缺钾环境胁迫。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13在耐盐碱环境胁迫中的应用，所述耐环境胁迫菌株XN-K13耐受盐浓度为≤100g/L氯化钠，耐受7≤pH值≤9.5的生长环境。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13耐受重金属环境胁迫中的应用，所述的重金属为铝、铅、镉、钴或铜中的一种。

上述耐环境胁迫菌株XN-K13耐干旱环境胁迫中的应用，所述耐环境胁迫菌株XN-K13耐受50％PEG-6000的生长环境。

与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

(1)本发明提供的耐环境胁迫菌株XN-K13为首次从广西壮族自治区兴宁药用植物园的植物根际土壤中筛选分离得到的，该菌株具有高盐浓度抗性，检测结果表明该菌是一株能够高效溶解难溶态钾的新的路德维希肠杆菌种，命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13；

(2)本发明提供的耐环境胁迫菌株XN-K13能够耐缺钾、耐高盐碱、耐重金属、耐干旱环境胁迫。

(3)本发明提供的耐环境胁迫菌株XN-K13能够提高植物耐环境胁迫的能力，耐环境胁迫菌株XN-K13对盐胁迫下、镉(Cd)胁迫下、干旱胁迫下的玉米种子和幼苗的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重均具有显著的促进作用。

保藏信息说明

耐环境胁迫菌株XN-K13于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

附图说明

图1为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在LB固态培养基上的菌落形态。

图2为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13的显微镜观察。

图3为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13的扫描电镜图。

图4为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在解钾培养基上的解钾定性分析。

图5为钾标准曲线。

图6为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在不同NaCl浓度下的解钾效率与培养液pH的影响。

图7为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在10g/LNaCl浓度下培养基上清液中钾长石溶解量与pH值的关系。

图8为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13的NaCl浓度和碱性pH的耐受能力；其中A为耐环境胁迫菌株XN-K13的NaCl浓度的耐受能力，B为耐环境胁迫菌株XN-K13的碱性pH的耐受能力。

图9本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在重金属胁迫下的菌落形态。

图10为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13的干旱耐受能力。

图11为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13和对照组对盐胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果对比图，其中0.1M NaCl+XN-K13为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在0.1M NaCl条件下作用结果，0.1M NaCl为盐胁迫下对照组作用结果。

图12为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13和对照组对重金属Cd胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果对比图，其中1M Cd+XN-K13为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在1M Cd条件下作用结果，1M Cd为重金属Cd胁迫下对照组作用结果。

图13为为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13和对照组对20％PEG6000干旱胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果对比图，其中20％PEG6000+XN-K13为本发明耐环境胁迫菌株XN-K13在20％PEG6000干旱条件下作用结果，20％PEG6000为干旱胁迫下对照组作用结果。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下列实施例中，使用的改良的解钾菌选择培养基组成为蔗糖5g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃ 0.1g，钾长石粉1g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH7.0，100mg/L BTB显色剂，115℃灭菌20min。

使用的解钾能力测试培养基组成为蔗糖10g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 1g，NaCl 10g，酵母膏0.5g，钾长石粉10g，去离子水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。

实施例1

耐环境胁迫菌株XN-K13的分离和鉴定

1.1耐环境胁迫菌株XN-K13的分离

耐环境胁迫菌株XN-K13的分离包括取样、富集和初筛，复筛三个步骤，具体如下：

1.1.1取样

从广西药用植物园(E108°19'，N22°51')的土壤中采样，装入干净的采样袋中，做好标记，于4℃冰箱中保存，作为根际土壤样品。

1.1.2富集和初筛

称取1.0g根际土壤样品，置入装有9mL无菌去离子水试管中，充分振荡混匀，37℃，200r/min，振荡培养30min，将其按十步梯度稀释，得到稀释液；为分离耐盐菌添加NaCl质量浓度为10g/L作为盐胁迫，吸取100uL稀释液涂布于含有NaCl质量浓度为10g/L的牛肉膏蛋白胨固态培养基上，37℃培养2天，用灭菌的牙签将牛肉膏蛋白胨培养基上的单菌落点种到改良的解钾菌选择培养基上37℃培养5天，根据解钾圈的大小，从中筛选出解钾能力较强的菌株。

1.1.3复筛

将初筛得到的菌株接种于解钾能力测试培养基中，37℃，200r/min，振荡培养4天，通过四苯硼钠比浊法对其定量，分离得到了一株解钾能力较强的菌株，将其接种于LB固体培养基上多次划线纯化，将纯化好的菌种斜面保藏于冰箱中。

1.2耐环境胁迫菌株XN-K13的鉴定

对上述分离纯化得到的纯培养物进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16SrDNA的扩增和测序，所得结果如下：

1.2.1该菌株在LB固态培养基上形成圆形或近圆形、乳白色、中央微凸起、表面光滑湿润有光泽、边缘较整齐的菌落(图1)。

显微镜镜检显示短杆状、革兰氏阴性细菌(图2)。

扫描电镜观测菌体呈短圆杆状、无鞭毛、无芽孢，菌体大小为(1.0～1.5)um(0.4～0.6)um(图3)。

其他检测项目如表1所示：

表1耐环境胁迫菌株XN-K13的生理生化特征

注：“+”表示阳性反应，存在或有，“-”表示阴性反应，不存在或没有。

1.2.2利用引物F27和R1492进行扩增16S rDNA，引物序列如下

F27:5'-AGAGTTGATCATGGCAG-3'，如SEQ ID NO.1所示；

R1492:5'-TAGGGTTACCTTGTTACGCTT-3'，如SEQ ID NO.2所示

PCR扩增条件为95℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃90s、30个循环，72℃10min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，耐环境胁迫菌株XN-K13菌株的16S rDNA的序列长度为1440bp，经同源性比对，其与Enterobacter ludwigiistrain cjy09(GenBank accession no.MN177186.1)具有99％的高度相似性，结合耐环境胁迫菌株XN-K13菌株形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为Enterobacter ludwigii菌属的一个菌株，命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)XN-K13，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO.M2020145。

实施例2

耐环境胁迫菌株XN-K13解钾的准确定性：

通过改良的解钾菌选择培养基初步评估了路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)XN-K13对难溶态钾的溶解能力：用无菌牙签将1.1.3分离纯化所得菌株点刺于在含有钾长石作为不溶性钾源的改良的解钾菌选择培养基中心，置于37℃培养箱中培养5d，每组处理三次重复，观察出现解钾圈测量菌落直径(d)和解钾圈直径(D)，结果如表2所示，计算解钾圈与菌落直径的比(图4)；从表2和图4可以得出耐环境胁迫菌株XN-K13的解钾圈与菌落直径的比达到4.62，具有较高的溶钾能力。

表2耐环境胁迫菌株XN-K13解钾的定性分析

菌株	解钾圈直径D(mm)	菌落直径d(mm)	解钾圈/菌落直径(D/d)
				XN-K13	23.35±0.04	5.05±0.04	4.62±0.03

实施例3

耐环境胁迫菌株XN-K13解钾的定量分析：

钾标准溶液：准确称取烘干(105℃烘干4-6小时)的分析纯KCl 1.9068g溶于200mL去离子水中，并定容至1L，摇匀即得含钾1000mg/L，吸取上述溶液25mL至250mL容量瓶中定容摇匀后，即为含钾100mg/L的钾标准溶液。

3％四苯硼钠溶液：称取3g四苯硼钠溶于100mL去离子水中，加入10滴0.2mol/L氢氧化钠溶液，使pH调至8-9，静置过夜后，用致密滤纸过滤，贮于棕色瓶中。

0.05mol/L硼砂溶液：称取19.07g硼砂溶于1000mL去离子水中。

甲醛-EDTA溶液：称取2.5g EDTA二钠盐溶于20mL 0.05mol/L硼砂溶液中，加入80ml 37％甲醛，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9。

本实施例采用四苯硼钠比浊法测定溶液中速效钾含量，其原理为样品中的K⁺在微碱性介质中与四苯硼钠(NaTPB)反应，生成溶解度很小的微小颗粒四苯硼钾(KTPB)白色沉淀，用分光光度计检验其浊性，从而得到样品中可溶性钾的含量。若待测液中含有NH⁴⁺，将会生成四苯硼铵白色沉淀，从而干扰钾的测定，其干扰可以在碱性条件下用甲醛掩蔽，甲醛能与NH⁴⁺缩合生成水溶性而且稳定的六亚甲基四铵，若待测液中含有Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺，在碱化时都会生成白色沉淀从而干扰试验，其用EDTA掩蔽。

钾标准曲线的绘制：分别吸取100mg/L的KCl标准溶液0mL、1.5mL、2.5mL、3.5mL、5.0mL、7.5mL、10mL于50mL比色管中，先加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀后，再用移液枪快速准确地加入1mL 3％四苯硼钠溶液，立即振荡摇匀，室温放置30min，摇匀后，用分光光度计在420nm处测定吸光值。以测得吸光值为纵坐标，可溶性钾含量mg/L为横坐标，绘制标准曲线，如图5所示。

样品测试：将改良的解钾菌选择培养基筛选得到的耐环境胁迫菌株XN-K13制成种子液，取4mL接种于解钾能力测试培养基中，200r pm，37℃摇床培养4天，将培养液8000r/min离心15min，上清液作为供试液，吸取5mL供试液于50mL比色管中，加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀后，再用移液枪快速准确地加入1mL 3％四苯硼钠溶液，立即振荡摇匀，去离子水定容至50mL，室温放置30min，摇匀后，用分光光度计在420nm处测定吸光值。与标准曲线对比，得到溶液中可溶性钾的含量。

结果计算：由供试液比浊所得的吸光值，在钾标准曲线(图5)上查出相应的钾含量，再按下式计算发酵液中速效钾的含量，再按公式(2)计算解钾效率：

解钾量(mg/L)＝比浊液的吸收值(mg/L)×稀释倍数；

解钾效率计算方法如下：

解钾效率(％)＝(X₁-X₀)/(M×W×2×10⁴)×100％ (2)

式中：X₁-实验组钾含量(mg/L)；X₀-空白组钾含量(mg/L)；M-钾长石重量(g)；W-钾长石中钾含量(％)，本试验钾长石中K含量为13％。

结果表明，本发明的路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13摇瓶培养的解钾量为176.15(±0.46)mg/L，解钾效率为13.81％，如表3所示：

表3耐环境胁迫菌株XN-K13解钾的定量分析

菌株	平均OD	解钾量(mg/L)	解钾效率(％)	pH值
					XN-K13	1.037	176.15±0.46	13.81	3.94±0.07

实施例4

耐环境胁迫菌株XN-K13在不同盐浓度下解钾能力的测定：

在不同NaCl浓度(10、20、50、100g/L)下对耐环境胁迫菌株XN-K13的解钾能力进行定量分析，结果如表4所示，菌株XN-K13的解钾量含量随着盐浓度的升高而大幅度减弱，在10g/L NaCl浓度下时，其解钾量含量最高，为176.90(±0.73)mg/L。在此培养条件下对菌株解钾效率与培养液pH进行了测定(图6)，耐环境胁迫菌株XN-K13解钾效率随着盐浓度的升高而不断降低，其培养液pH不断升高。在10g/L NaCl浓度条件下时，菌液pH最低，解钾效率最高，对10g/L NaCl浓度下培养液上清液中的钾长石溶解量和pH值之间作相关性分析(图7)，得到回归方程y＝-47.168x+359.75，相关性系数R²＝0.8789，皮尔逊系数r＝-0.935(P<0.0001)，说明钾长石溶解量与pH值在P<0.0001水平上呈极显著负相关关系，这可能是因为耐环境胁迫菌株XN-K13产生的一些酸类物质与难溶钾长石中的阳离子进行了螯合作用，将难溶性钾长石转化成可溶的速效钾。

表4不同盐浓度下耐环境胁迫菌株XN-K13解钾定量分析

盐浓度NaCl(g/L)	10	20	50	100
					解钾量含量(mg/L)	176.90±0.73	119.66±0.06	32.80±0.02	17.74±0.67

实施例5

耐环境胁迫菌株XN-K13的耐盐碱能力：

耐盐能力：将耐环境胁迫菌株XN-K13，即路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13分别接种到含有0、20、50、70、100、120、150、200g/L NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作为空白对照，37℃，200r/min摇床培养48h后，测定培养液在600nm处的吸光值(OD₆₀₀)。

耐碱能力：将路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13菌株分别接种到pH为7、8、9、9.5、10、11的含20g/L质量浓度NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作为空白对照，37℃，200rpm培养48h后，测定培养液在600nm处的吸光值(OD₆₀₀)。

结果如图8所示，耐环境胁迫菌株XN-K13具有较广泛的耐盐能力，至少可耐受100g/L NaCl，最适生长的盐浓度为20g/L；在20g/L盐浓度条件下，其至少可耐受9.5的碱性pH，最适宜的生长碱性pH为9，该结果显示路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13在20g/L NaCl浓度下具有一定的耐碱能力。

实施例6

耐环境胁迫菌株XN-K13的耐重金属能力：

将耐环境胁迫菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中放置于恒温培养箱中37℃培养24h活化菌株，将不同浓度梯度且不同的重金属溶液各自加入到冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基中，混匀，倒平板待冷却凝固后，用接种环将各菌株单菌落在平板上划线培养，置于恒温培养箱37℃倒置培养24h，观察含有各种重金属和浓度梯度的培养基表明两株菌株的生长情况，结果如图9所示，并记录菌株的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration,MIC)，结果如表5所示。MIC是指在体外试验中，各种重金属能抑制培养基中细菌生长的最低浓度，MIC值越大，重金属对菌体的毒性越小，菌体的重金属耐受能力越强。

结果显示，5种重金属对耐环境胁迫菌株XN-K13的毒性顺序依次为：Co>Al>Cu>Cd>Pd，对5种重金属的MIC值结果(表5)分析表明，耐环境胁迫菌株XN-K13具有普遍较高的重金属耐受性能，尤其是Cd抗性胁迫培养下表现较高的耐受能力。

表5耐环境胁迫菌株XN-K13对重金属的MIC值(mmol/L)

名称	Al<sup>3+</sup>	Pd<sup>2+</sup>	Cd<sup>2+</sup>	Co<sup>2+</sup>	Cu<sup>2+</sup>
						MIC	1.0	2.25	2.0	0.75	1.75

实施例7

耐环境胁迫菌株XN-K13的耐干旱能力：

将耐环境胁迫菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中放置于振荡培养箱中37℃培养24h活化菌株，分别取1mL接种于100mL含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％PEG-6000的牛肉膏蛋白胨液体培养基中于37℃，200r/min振荡培养箱中培养48h后，在600nm处测定OD值，根据菌株在不同质量浓度PEG 6000的牛肉膏蛋白胨培养基中OD600的大小进行耐旱性分析

结果如图10所示，耐环境胁迫菌株XN-K13有一定的耐旱性，至少可耐受50％的PEG-6000。

实施例8

耐环境胁迫菌株XN-K13对盐胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果：

菌液制备：将耐环境胁迫菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上37℃培养24h，取2mL菌液接种于含有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养24h，在4℃下10000r/min离心10min来收集细菌细胞，之后在0.1M无菌NaCl溶液中洗涤3次，最后悬浮于0.1M无菌NaCl溶液中，直至菌液浓度达到10⁸CFU/mL。

种子处理：随机挑选发育时间相同、表面健康、颗粒饱满、重量相似的玉米种子60粒，先用无菌水反复冲洗以去除表面灰尘，随后用75％乙醇溶液浸泡2min，之后置于1％次氯酸钠溶液浸泡5min，用无菌水冲洗7次，晾干，分别置于相应菌悬液中，对照(CK)为0.1M无菌NaCl溶液，于28℃下恒温浸种24h，晾干后，分别置于铺有灭菌纸的直径9cm平皿中，每皿10粒，每个处理共3皿，分别无菌注入相应菌悬液5mL 0.1M无菌NaCl作为对照，置于28℃恒温电热培养箱中做萌发试验，每隔一天补充相应菌悬液或无菌0.1M NaCl溶液1mL，以确保种子正常萌发，不定期观察种子的萌发和幼苗生长情况，在第3天时测定种子发芽势，第7天时测发芽率、胚芽长、胚根长、下胚轴长、须根数、幼苗及根干重。发芽势是指发芽初期在规定日期内的正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率，发芽率是指发芽终期在规定日期内的全部正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率。

表6耐环境胁迫菌株XN-K13对玉米的种子萌发和幼苗生长的作用

如表6和图11所示，在0.1M NaCl浓度条件下，路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13对玉米种子有显著的促进作用，与空白对照相比，在菌液浓度为10⁸CFU/mL时，路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13对玉米的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重分别提高了24.29％、57.38％、57.25％、86.75％、72.12％、52.17％、88.53％。

实施例9

耐环境胁迫菌株XN-K13对重金属Cd胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果：

菌液制备：将耐环境胁迫菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上37℃培养24h，取2mL菌液接种于含有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养24h，在4℃下10000r/min离心10min来收集细菌细胞，之后在1mM无菌CdCl₂溶液中洗涤3次，最后悬浮于1mM无菌CdCl₂溶液中，直至菌液浓度达到10⁸CFU/mL。

种子处理：随机挑选发育时间相同、表面健康、颗粒饱满、重量相似的玉米种子60粒，先用无菌水反复冲洗以去除表面灰尘，随后用75％乙醇溶液浸泡2min，之后置于1％次氯酸钠溶液浸泡5min，用无菌水冲洗7次，晾干，分别置于相应菌悬液中，对照(CK)为1mM无菌CdCl₂溶液，于28℃下恒温浸种24h，晾干后，分别置于铺有灭菌纸的直径9cm平皿中，每皿10粒，每个处理共3皿，分别无菌注入相应菌悬液5mL，1mM无菌CdCl₂作为对照，置于28℃恒温电热培养箱中做萌发试验，每隔一天补充相应菌悬液或无菌CdCl₂溶液1mL，以确保种子正常萌发，不定期观察种子的萌发和幼苗生长情况，在第3天时测定种子发芽势，第7天时测发芽率、胚芽长、胚根长、下胚轴长、须根数、幼苗及根干重。发芽势是指发芽初期在规定日期内的正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率，发芽率是指发芽终期在规定日期内的全部正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率。

表7耐环境胁迫菌株XN-K13对Cd胁迫下玉米的种子萌发和幼苗生长的作用

如表7和图12所示，在1mM Cd浓度条件下，路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13对玉米种子有显著的促进作用，与空白对照相比，在菌液浓度为10⁸CFU/mL时，路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13对玉米的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重分别提高了13.21％、20.00％、88.89％、113.16％、180.00％、233.33％、67.38％。

实施例10

耐环境胁迫菌株XN-K13对干旱胁迫下玉米种子和幼苗的促生效果：

菌液制备：将耐环境胁迫菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上37℃培养24h，取2mL菌液接种于含有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养24h，在4℃下10000r/min离心10min来收集细菌细胞，之后在无菌20％PEG6000溶液中洗涤3次，最后悬浮于无菌20％PEG6000溶液中，直至菌液浓度达到10⁸CFU/mL。

种子处理：随机挑选发育时间相同、表面健康、颗粒饱满、重量相似的玉米种子60粒，先用无菌水反复冲洗以去除表面灰尘，随后用75％乙醇溶液浸泡2min，之后置于1％次氯酸钠溶液浸泡5min，用无菌水冲洗7次，晾干，分别置于相应菌悬液中，对照(CK)为无菌20％PEG6000溶液，于28℃下恒温浸种24h，晾干后，分别置于铺有灭菌纸的直径9cm平皿中，每皿10粒，每个处理共3皿，分别无菌注入相应菌悬液5mL，20％PEG6000作为对照，置于28℃恒温电热培养箱中做萌发试验，每隔一天补充相应菌悬液或无菌20％PEG6000溶液1mL，以确保种子正常萌发，不定期观察种子的萌发和幼苗生长情况，在第3天时测定种子发芽势，第7天时测发芽率、胚芽长、胚根长、下胚轴长、须根数、幼苗及根干重。发芽势是指发芽初期在规定日期内的正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率，发芽率是指发芽终期在规定日期内的全部正常发芽种子粒数占供试种子粒数的百分率。

表8耐环境胁迫菌株XN-K13对干旱胁迫下玉米的种子萌发和幼苗生长的作用

如表8和图12所示，在20％PEG6000条件下，路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13对玉米种子有显著的促进作用，与空白对照相比，在菌液浓度为10⁸CFU/mL时，路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13对玉米的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重分别提高了23.81％、66.67％、96.08％、114.00％、94.74％、37.26％、19.79％。

从实施例8、实施例9和实施例10可以看出，本申请耐环境胁迫菌株XN-K13能提高玉米种子和幼苗耐环境胁迫的能力。

综上所述，本发明路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13由于其能产生酸类物质，螯合难溶态钾矿化物中的阳离子，将钾长石中的钾转化成可溶性的速效钾，高效溶解难溶钾，释放速效钾，以增加土壤中速效钾含量，可以解除植物缺钾胁迫，促进植物生长。其还能溶解并利用培养基中的磷酸钙，高效溶解难溶磷，释放可溶性磷，促进植物生长，协助改良土壤。且具有较强的盐碱、重金属和干旱耐受能力。本发明菌株增加土壤中速效钾的含量能够解除植物缺钾的环境胁迫，从而实现促进植物生长的目的，其原因在于，钾是作物营养的三大要素之一，不仅参与渗透、细胞膜电位和pH的调节，还参与活化植物重要代谢过程中的酶从而促进合成植物生长所需的蛋白质、参与植物的光合作用，同时钾元素会直接影响作物的抗倒伏强度，增强植物的耐寒和耐旱性；在农业生产中，作为肥料三要素之一的钾元素，在长期施用单一氮肥的土壤中，也是最短缺的元素之一，一般土壤中都含有丰富的钾源，但它们大多以植物难以直接吸收利用的难溶态钾形式存在，特别是在高盐、低营养、强缓冲能力的盐碱地，速效钾含量更低，土壤解钾微生物能够溶解难溶态钾，释放速效钾，满足植物对钾元素的需求，起到节约钾肥，改良土壤的作用。

本发明路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13能够耐多种环境胁迫，促进植物生长，其处理的种子萌发率、须根数、芽长、胚根长、下胚轴长、幼苗干重、根干重均具有显著的促进作用，可能是由于菌液产生的一些代谢产物在玉米种子的萌发和幼苗生长过程中起到了诱导和刺激作用，从而直接或间接的起到促进作用，可应用于玉米促生制剂或微生物肥料的制备。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 一株耐环境胁迫菌株XN-K13及其应用

<130> JC

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agagttgatc atggcag 17

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tagggttacc ttgttacgct t 21

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> Enterobacter ludwigil

<400> 3

ggctgcggca gctacacatg caagtcgaac ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac 60

gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg 120

aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt 180

gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga 240

cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 360

ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcggggag gaaggtgttg 420

tggttaataa ccacagcaat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 540

cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattcg 600

aaactggcag gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 720

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 960

agagaacttt ccagagatgg attggtgcct tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080

ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata aactggagga 1140

aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa gtgcgtcgta 1260

gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtagatc 1320

agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380

tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgctaccact ttgatcaggg 1440

Claims (7)

1.一株耐环境胁迫菌株XN-K13，其特征在于，所述耐环境胁迫菌株XN-K13分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

2.根据权利要求1所述耐环境胁迫菌株XN-K13在耐环境胁迫环境中的应用。

3.根据权利要求1所述耐环境胁迫菌株XN-K13在提高植物耐环境胁迫能力中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述环境胁迫为缺钾胁迫环境、高盐碱环境胁迫、重金属环境胁迫和干旱环境胁迫。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述耐环境胁迫菌株XN-K13耐受盐浓度为≤100g/L氯化钠，耐受7≤pH值≤9.5的生长环境。

6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的重金属为铝、铅、镉、钴或铜中的一种。

7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述耐环境胁迫菌株XN-K13耐受50％PEG-6000的干旱生长环境。

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