CN107574132B

CN107574132B - 一种降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌

Info

Publication number: CN107574132B
Application number: CN201710728321.7A
Authority: CN
Inventors: 张炳火; 李汉全
Original assignee: Jiujiang University
Current assignee: Jiujiang University
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2037-08-23
Also published as: CN107574132A

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为芽孢杆菌JXJ b05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.14050，该菌对磷酸钙和植酸钙等不溶性磷具有较好的溶解活性，并能够降解有机磷农药氧乐果，使之形成可溶性磷酸根，从而降低农药浓度，可以应用于增加土壤可溶性有效磷肥，修复有机磷农药对土壤的污染。

Description

一种降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌。

背景技术

磷素是植物正常生长发育不可缺少的必需元素。土壤中95％以上的磷元素为植物难以直接吸收利用的不溶性磷，我国约74％的农田耕地土壤缺磷，施用有机和化学磷肥是土壤磷的主要来源。然而土壤矿物质对磷元素具有很强的反应性，往往容易形成难溶性无效磷酸盐，导致施入的磷肥当季利用率只有5％～25％。磷肥主要来自磷矿粉，但磷矿粉是不可再生资源，将在50～100年内耗完，因此，如何增加土壤中可溶性磷元素含量，提高磷肥利用效率，是农业亟需解决的问题。

在过去几十年，我国农业以使用大量化肥和有机磷农药为特征，导致土壤污染严重，特别是农药残留量高，严重影响农作物的品质和现代生态农业的发展。微生物对许多有毒物质都具有很强的降解能力，它们能够将有毒物质降解为无毒物质，甚至降解为对植物生长有益的营养成分。因此，在土壤中施加相关微生物，可以有效消除农药等对土壤的污染，改善土壤质量，提高农作物的品质，促进生态农业的发展。

同时，目前微生物肥料普遍存在存活期短、质量不稳定、肥料生产加工过程中微生物容易死亡等缺点。

发明内容

本发明的目的是在于针对现代生态农业可持续发展的需要，提供一种能够降解不溶性有机磷和无机磷为可溶性磷的芽孢杆菌JXJ b05，该菌能够将有机磷农药氧乐果降解为无毒的正磷酸盐，作为植物可吸收的有效磷。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为芽孢杆菌JXJ b05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.14050，保藏日期为2017年04月20日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

更特别的是，一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，用于将难溶性磷转化为可溶性磷酸盐，促进植物对磷吸收的应用。比如用于溶解磷酸钙或植酸钙。

本发明还提供了一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，其特征是：用于降解有机磷农药为无毒的可溶性磷酸盐，降低土壤农药残留，从而修复土壤方面的应用。例如用于降解有机磷农药氧乐果。

本发明涉及的细菌JXJ b05，经16S rRNA基因序列(1344bp)分析和同源性比较，确定其为芽孢杆菌属的微生物，命名为芽孢杆菌JXJb05，其16S rRNA基因序列在GenBank 中的登录号是MF464546。菌株JXJ b05细胞大小为1-1.5×1.5-4μm，芽孢一般为偏生至端生，在培养基(葡萄糖0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，酵母浸膏粉0.4％，琼脂1.8％，pH7.4) 上生长良好，并产生大量荚膜。

本发明涉及的菌株JXJ b05对难溶性有机磷和无机磷均具有较好的降解作用。按照中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的解磷培养基配方和检测方法，该菌在实验室摇瓶培养条件下(28℃、160rpm)，在植酸钙和磷酸钙培养基中培养1～5d，最高可溶性有效磷浓度比不接菌的对照组分别高296.50mg·L^-1和195.98mg·L^-1，同时培养液的pH值分别下降到5.60和4.67左右，这说明产生有机酸是该菌解磷的机制之一。

本发明涉及的菌株JXJ b05对有机磷农药氧乐果具有一定的耐受性，在含1％(v/v) 的40％氧乐果乳油培养基中(葡萄糖0.4％，酵母浸膏粉0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，水1000 mL，pH7.4)能够存活生长，在含有0.1％～0.4％(v/v)的40％氧乐果乳油培养基中，其生物量与不加氧乐果的对照组没有显著差异。

该菌对有机磷农药氧乐果具有显著的降解作用。用0.2％(v/v)的40％氧乐果乳油代替中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的解磷培养基配方中的磷源，在28℃、160rpm的条件下培养，可溶性有效磷浓度随培养时间的延长而显著增加，7d后接菌株JXJb05的试验组可溶性磷比不接菌的对照组高4mg·L^-1。

菌株JXJb05能够分泌多种磷酸酶，即使有充足的可溶性有效磷，该菌也能分泌磷酸酶，将该菌接入含可溶性磷的细菌培养基中(葡萄糖0.4％，酵母浸膏粉0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，K₂HPO₄0.1％，水1000mL，pH7.4)，28℃、160rpm培养2d后酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶的酶活分别为5.0U、2.2U和1.5U(以1mL培养液12h催化苯磷酸二钠产生0.1mg苯酚为1个磷酸酶的酶活性单位)。

本发明的芽孢杆菌可将难溶性有机磷和无机磷转化为可溶性磷酸盐，适用于微生物肥料，可降解有机磷农药，可有效降低农田有机磷农药残留，改良和修复农田土壤。

附图说明

图1菌株JXJb05在磷酸钙和植酸钙固体培养基平板上形成的解磷圈。

图2菌株JXJb05的荚膜负染色观察。

图3菌株JXJb05在含不同浓度的40％氧乐果乳油的培养基中的生长情况。**表示与未加40％氧乐果乳油的对照组相比，菌体OD值在P<0.01的水平上差异显著。

图4菌株JXJb05接种含量为0.2％(v/v)的40％氧乐果乳油培养基培养液中可溶性有效磷浓度的变化。**表示与前一次样品相比，氧乐果培养液中可溶性磷含量在P<0.01 的水平上差异显著。

图5在可溶性磷源充足的情况下菌株JXJb05的磷酸酶活性。

具体实施方式

1解磷芽孢杆菌的筛选

固体平板筛选：将采自江西省武宁县花生地的土壤，置于电热干燥箱中100℃加热处理1h，然后用无菌水进行梯度稀释，取适当梯度稀释液在细菌培养基(葡萄糖0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，酵母浸膏粉0.4％，琼脂1.8％，pH为7.4，水1000mL)中涂布，并置于 28℃培养箱中培养1-2d后，取单菌落进行划线进一步纯化，将纯化的菌株采用“十字”法接种在中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的解磷固体培养基上(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，NaCl0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·4H₂O 0.036g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，磷酸钙或植酸钙10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，并置于28℃培养箱中培养 2-7d后，观察解磷圈的有无和大小，选择解磷圈明显的菌株JXJb05(图1)进行后续研究。

2菌株JXJ b05的鉴定

用菌落形态观察、细胞简单染色、芽孢染色和16S rRNA基因序列(1344bp)分析等方法，对菌株JXJb05进行鉴定发现，该菌为革兰氏阳性、杆状细菌，细胞大小为1-1.5×1.5-4 μm，在实施方案1中的细菌培养基中产生大量荚膜(图2)，并形成芽孢；经16S rRNA 基因序列分析和同源性比较，得知其与芽孢杆菌Bacillus aryabhattai B8W22相似性达到98.63％，但B.aryabhattai菌体直径为0.8～1.0μm，芽孢中生，因此，可以确定该菌不是B.aryabhattai的成员；菌株JXJb05的16S rRNA基因序列与巨大芽孢杆菌(B.megaterium) 相似性为98.47％，与其它芽孢杆菌的相似性均低于98％。基于以上数据，将菌株JXJb05 鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)的成员，命名为芽孢杆菌JXJb05，该菌种的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号是MF464546。该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.14050，保藏日期为2017年04月20日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

3菌株JXJ b05的液体解磷活性

将菌株JXJb05接入细菌液体培养基(葡萄糖0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，酵母浸膏粉0.4％，pH为7.4，水1000mL)中，28℃、160rpm条件下培养2d，再将培养液按照1％ (v/v，对照组不接菌)的接种量接入液体解磷培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·4H₂O 0.036g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，磷酸钙或植酸钙10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)中，28℃、160rpm条件下培养，每24h取样一次，样品在4500rpm条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以蒸馏水代替样品作为参比调零。结果发现，未接菌的磷酸钙培养基对照组可溶性磷含量始终很低(0.03～2.05mg/L)，而接菌的试验组可溶性磷含量迅速增加，5d后比对照组高197.07mg·L^-1，比对照组高195.98mg·L^-1(表1)；植酸钙培养基对照组的可溶性磷虽然随培养的延长而有所增加，但幅度很小(25.79～34.08 mg/L)，而接菌的试验组可溶性磷含量随培养时间的延长迅速增加，4d后即达到326.93 mg/L，比对照组高296.50mg/L(表1)，这说明该菌在生长过程中，具有较强的降解难溶性有机磷为可溶性磷的活性。我国农业部行业标准NY/T 1847-2010中要求，菌株解磷的能力需要达到：在含有难溶性磷培养液中，接种菌株与未接种相比，可溶性磷的含量增加70 mg/L(无机磷，如磷酸钙)或5mg/L(有机磷，如植酸钙)，因此，菌株JXJb05的溶磷能力完全符合我国农业部的要求。另外植酸钙和磷酸钙培养基的培养液pH值分别下降到 5.63和4.67左右(表2)。

表1解磷培养基接入菌株JXJb05后可溶性磷元素含量(mg/L)随培养时间的变化

	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天
						磷酸钙对照组	0.03	1.02	0.89	2.05	1.09
磷酸钙试验组	0.51	21.22	25.04	106.27	197.07
						植酸钙对照组	25.79	28.62	31.74	30.43	34.08
植酸钙试验组	214.35	251.70	286.25	326.93	320.36

表2解磷培养基接入菌株JXJb05后培养液pH值随培养时间的变化

	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天
						磷酸钙对照组	7.01	5.62	5.46	4.80	4.64
磷酸钙试验组	7.67	7.63	7.67	7.67	7.61
						植酸钙对照组	6.98	6.84	6.81	6.89	6.92
植酸钙试验组	5.80	5.71	5.78	5.61	5.63

4菌株JXJ b05对有机磷农药的耐受性

在无菌液体培养基(葡萄糖0.4％，酵母浸膏粉0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，水1000mL，pH7.4)中分别加入不同体积的40％氧乐果乳油，于28℃、160rpm条件下培养，4d后于 4500r/min离心20min，菌体沉淀以无菌水洗涤3次，再用无菌水重悬成等体积的菌悬液，于600nm下测菌悬液的吸光度，根据吸光度判断细菌生长状况。试验结果表明，在2％(v/v)的40％氧乐果乳油培养基中，细菌营养细胞死亡，在1％～0.5％(v/v)的40％氧乐果乳油培养基中细菌生长受到显著抑制(P<0.01)，在0.1％～0.4％(v/v)的40％氧乐果乳油培养基中细菌生长未受到显著(P>0.05)影响(图3)。

5菌株JXJ b05对有机磷农药氧乐果的降解作用

用0.2％(v/v)的40％氧乐果乳油代替中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的解磷培养基配方中的磷源，在28℃、160rpm的条件下培养，每48h取样一次，样品在4500rpm 条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准NY/T 1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以不接菌的空白培养基作参比调零，结果发现，随着培养时间的延长，氧乐果培养基中可溶性磷元素的含量显著(P<0.01)增加，7d后可溶性磷元素达到4.33mg·L^-1 (图4)，这说明菌株JXJb05对氧乐果有显著的降解作用。

6菌株JXJ b05磷酸酶活性

在细菌培养基(葡萄糖0.4％，酵母浸膏粉0.4％，麦芽浸膏粉0.5％，水1000mL，pH7.4) 中加入0.1％的K₂HPO₄，接入菌株JXJb05培养2d后，采用苯磷酸二钠法测定培养液的酸性、中性和碱性磷酸酶的活性：取1mL培养液、0.2mL甲苯、4.5mL苯磷酸二钠水溶液(0.676％)、4.5mL相应缓冲液(酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液，中性磷酸酶用的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10.0的硼酸缓冲液)，混合均匀并密封，于37℃恒温箱中反应12h；对照组以等体积的蒸馏水代替苯磷酸二钠溶液，反应条件相同；取反应液1 mL，依次加入5mL硼酸缓冲液(pH9.0)、2.5％的铁氰化钾3mL和0.5％的4-氨基安替比林3mL，然后加蒸馏水定容至50mL，摇匀，30min后以对照组作为参比调零，于570 nm处测吸光度，根据苯酚的标准曲线计算待测样品中的酚含量。以1mL培养液12h催化苯磷酸二钠产生0.1mg苯酚为1个磷酸酶酶活性单位(1U)。结果表明，菌株JXJb05 在可溶性有效磷充足的条件下依然表现较好的磷酸酶活性(图5)，这表明该菌的磷酸酶是组成型的酶，不需要底物诱导。

序列表

<110> 九江学院

<120> 可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1344

<212> DNA

<213> Bacillus

<400> 1

ggaggtgatc cagccgcata tttttcctcc tgagcccgcg gtgcattagc tagttggtga 60

ggtaacggct caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 120

ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 180

cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg 240

ttgttaggga agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa 300

agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 360

aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgag agcccacggc 420

tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt 480

ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt 540

ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 600

ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct 660

gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg 720

aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 780

accttaccag gtcttgacat cctctgacaa ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg 840

acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 900

cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg 960

actgccggtg acaaaccggg ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1020

cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag 1080

ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct 1140

ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gcttcgtaca 1200

caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggagta accgtaagga 1260

gctagccgcc taaggtggga cagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg 1320

gaaggtgcgg ctggatcacc tcct 1344

Claims

1.一种可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为芽孢杆菌JXJb05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.14050，保藏日期为2017年04月20日。

2.如权利要求1所述的可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于：其16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，其特征是：用于将难溶性磷转化为可溶性磷酸盐，促进植物对磷吸收的应用，所述难溶性磷为磷酸钙或植酸钙，所述有机磷农药为氧乐果。

4.如权利要求1所述的可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，其特征是：用于降解有机磷农药为无毒的可溶性磷酸盐，降低土壤农药残留，从而修复土壤方面的应用，所述有机磷农药为氧乐果，所述难溶性磷为磷酸钙或植酸钙。

5.如权利要求4所述的可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，其特征是：用0.2％v/v的40％氧乐果乳油代替中国农业部行业标准NY/T1847-2010的解磷培养基配方中的磷源，在28℃、160rpm的条件下培养，每48h取样一次，样品在4500rpm条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准NY/T1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以不接菌的空白培养基作参比调零，测试氧乐果培养基中可溶性磷元素的含量。

6.如权利要求3所述的可降解难溶性磷和有机磷农药的芽孢杆菌的应用，其特征是：将芽孢杆菌JXJb05接入植酸钙培养基或磷酸钙培养基中，28℃、160rpm条件下培养，每24h取样一次，样品在4500rpm条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准NY/T1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以不接菌的空白培养基作参比调零，检测植酸钙培养基或磷酸钙培养基中可溶性有效磷浓度。