CN110904004B - 一株产海藻糖水解酶的细菌及其选育方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产海藻糖水解酶的细菌C1及其选育方法和应用，该产海藻糖水解酶菌C1，经鉴定为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No.17444。本发明首次筛选到一株可产生海藻糖酶的神户肠杆菌C1，可以有效地大量生产海藻糖水解酶，以5％终浓度的海藻糖为底物测得该菌株全细胞酶活可达到31.18U/mL。该酶的最适温度和pH分别为35℃和pH5.0，在pH偏酸性条件下该酶仍表现出较高酶活和稳定性，在工业和医学领域具有较好的应用价值。

Description

一株产海藻糖水解酶的细菌及其选育方法和应用
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，涉及一株产海藻糖水解酶的细菌及其选育方法和应用。
背景技术
海藻糖酶(trehalase)又称海藻糖水解酶，能将海藻糖水解为两分子葡萄糖；Bourquelot等人最早于黑曲霉中发现了海藻糖酶的存在。后来，科研人员在细菌、真菌、昆虫和植物等不同生物体中发现了海藻糖酶，包括人体的肠粘膜、肾脏、肝脏和血浆等组织中也有海藻糖酶的报道。通过对获得的海藻糖酶进行分类，发现根据来源它主要分为三类：细菌，植物和动物，真菌；其中，在细菌中海藻糖酶的种类较多样化，而在昆虫中海藻糖酶主要分为可溶式和与膜结合两种形式，在真菌中由于反应的最适pH值不一样，可分为酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶。有研究表明，除毕赤酵母是利用海藻糖磷酸化酶来催化分解海藻糖外，所有真菌对海藻糖的分解都是通过海藻糖酶实现的，并且海藻糖是其专一的底物。据报道，缺乏海藻糖酶的患者在食用含有大量海藻糖的蘑菇后引起腹泻，而肾源海藻糖酶的功能和作用机制目前还不清楚。另外也有研究表明，尿海藻糖酶活性升高与近端肾小管损害和某些种类的肾疾病有关。
海藻糖酶在工业和医学领域具有重要应用价值。如需应用到生产中，要求海藻糖酶有较高的催化活性、良好的pH稳定性和热稳定性等性质，然而目前海藻糖酶产生菌种和酶品种仍然相对报道较少，主要集中于玫瑰微球菌Micrococcus roses、硫矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus、嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius、节杆菌Arthrobacter sp.、抗辐射奇异球菌Deinococcus radiodurans等菌株，而关于肠杆菌Enterobacter属来源的海藻糖酶则尚未见任何文献报道，同时，目前有关海藻糖酶酶学特性研究依然不多。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株产海藻糖水解酶的细菌C1，经鉴定为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)，本发明的神户肠杆菌C1可以有效地大量生产海藻糖水解酶，该酶在pH偏酸性条件下该酶仍表现出较高酶活和稳定性，在工业和医学领域具有较好的应用价值。
本发明首次筛选获得一株产海藻糖酶的神户肠杆菌(Enterobacter kobei)，具有良好的产酶性能和酶学特性，可以为后续使用基因工程改造和工业应用研究奠定基础。
本发明还提供了一株产海藻糖水解酶的细菌C1的分离筛选和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述产海藻糖水解酶的细菌C1，经鉴定为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No. 17444；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株C1来源于太湖边选取肥沃的土壤，经分离筛选获得的一株细，菌株在固体LB培养基平板上划线接种，长出菌落呈圆形、凸起的菌落，表面光滑湿润，易挑取。革兰氏染色为红色，在光学显微镜下观察，细胞多呈胞直杆状，有时短链状。该菌株为短粗的革兰阴性杆状细菌，无荚膜，无芽孢，有周身鞭毛，运动较活泼，可利用柠檬酸和丙二酸作为唯一的碳源和能源。
本发明所述的产海藻糖水解酶的细菌C1的筛选方法，包括如下步骤：
采集土样后立即在富集培养基中进行菌种快速繁殖；初筛，取经富集培养的菌液，在具有海藻糖作为唯一碳氮源的筛选培养基中分离能够利用底物的菌株；复筛，挑单菌落于液体发酵培养基中，培养结束后取样进行酶活测定。
产海藻糖水解酶的细菌C1的鉴定方法：
以神户肠杆菌(Enterobacter kobei)基因组DNA为模板，利用16S rDNA扩增引物P1、P2进行PCR扩增获得其16S rDNA序列(SEQ NO.1)，通过在NCBI 网站应用BLAST软件与数据库中的已有序列进行相似性分析，从结果中选取合适的序列作为参比，采用DNAMAN软件对比对结果进行整理，采用ClustalX软件进行序列完全比对，借助Mega软件构建系统进化树，最终结果显示该菌株的 16S rDNA序列与Enterobacter属(MF428922.1、HQ242714.1等)的相关序列存在99％以上同源性，同时与Endophyte属(AY842146.1)的相关菌株序列同源性在98％左右，最终将其归为Enterobacter属菌株。结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)。
其中PCR扩增引物为：
P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
P2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
本发明所述的产海藻糖水解酶的细菌C1生产的含海藻糖水解酶的发酵液。
本发明所述的含海藻糖水解酶的发酵液的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
将菌株C1接种到LB液体培养基中进行摇瓶发酵，30～39℃，100-300rpm 培养8～14h，得到种子液，种子液按体积比2％-5％的接种量接种到发酵TB培养基，30-39℃，100-300rpm培养1-3d。
进一步地，所述海藻糖水解酶酶酶学性质如下：
(1)最适温度35℃，最适pH5.0，并且温度和pH稳定性都具有明显优势，在pH4-6范围内，温浴35℃处理1h后，酶活力保留大于85％；
(2)Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、K+、Sn2+、Ba2+、Li+、Na+、Co2+和 Fe2+对酶活力有抑制作用；其中，Mn2+、Sn2+、Li+和Fe2+抑制效果尤为明显，而 Ni2+对酶活力则未表现出显著的抑制或促进作用；
(3)Triton X-114对酶活力具有促进作用；Tween 20、Tween 80、Triton X-100、DMSO、SDS、DTT和PMSF对酶活力有抑制作用。其中，SDS的抑制作用最为显著，使相对酶活降低至22％，EDTA则对酶活力无显著影响。
本发明所述的产海藻糖水解酶的细菌C1在工业和医学领域中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明分离筛选到一株神户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1，并首次发现该神户肠杆菌C1产海藻糖水解酶，该酶的酶学性质为：最适温度35℃，最适pH5.0，并且温度和pH稳定性都具有明显优势，在pH偏酸性条件下该酶仍表现出较高酶活和稳定性，在工业和医学领域具有较好的应用价值。
本发明户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1可以高效生产在较低pH下具备良好的活性的海藻糖水解酶，本发明优化了相应发酵条件，发酵酶活力达到 31.18U/mL，并且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是平板上神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的菌株形态图；
图2是光学显微镜所观察的神户肠杆菌(Enterobacter kobei)形态图；
图3是电镜观察的神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的菌株形态图；
图4是基于神户肠杆菌(Enterobacter kobei)16S rDNA序列分析的系统进化树图；
图5是神户肠杆菌(Enterobacter kobei)海藻糖酶的最适温度及温度稳定性示意图；
图6是神户肠杆菌(Enterobacter kobei)海藻糖酶的最适pH及pH稳定性示意图。
具体实施方式
本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不具有限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。
标准酶活的检测方法如下：
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的还原糖葡萄糖的含量：取 2mL EP管，实验组依次加入150μL酶液(即发酵液)，150μL质量分数10％的可溶性的海藻糖为底物。对照组依次加入150μL酶液，150μL pH 6.5的磷酸缓冲液；37℃反应15min，实验组和对照组各加入300μL的DNS试剂；沸水浴 5min终止反应，取出置于冰水混合物中冰浴2min；取200μL混合液在540nm 测定其吸光度值。
DNS试剂的配制方法为：准确称取244.4g酒石酸钾钠于500mL去离子水中，45℃加热溶解。向溶液中加入21g NaOH，然后加入DNS 6.3g，溶解后按顺序分别加入5mL苯酚和5g亚硫酸氢钠，待溶液冷却后定容至1L。将配制好的DNS溶液于棕色瓶中避光贮存，放置一周后可以使用。
50mmol/L磷酸缓冲液的配制方法为：分别配制200mmol/L的NaH2PO4和 Na2HPO4缓冲液，然后将两者按一定比例配制成50mmol/L，pH 6.5的PBS缓冲液。
10％海藻糖溶液的配制方法为：以上述50mmol/L的PBS缓冲液为溶液，称量海藻糖，溶解后即为10％海藻糖溶液，作为酶活测定底物待用。
酶活计算方法如下：
酶活(1U)定义：在上述实验条件下，1mL的酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，测定均重复3次。
实施例1
1、神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的富集筛选过程
采集太湖边的肥沃土样，采集土样时，先用小铲子铲去表层土，采集土壤表层以下5～10cm处的土壤，取样约50g密封好，记录时间、地点、环境情况。取5g新鲜土样溶于45g无菌水中，取上清液放入含富集培养基的三角瓶中，摇瓶培养24h。取1mL经富集培养的菌液并移入到预先准备好的含有9mL无菌生理盐水的试管中，在漩涡震荡器上震荡摇匀制成10-1浓度的样品悬浮液；按此方法依次继续操作，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同浓度的样品悬浮液。各取0.1mL的样品悬浮液涂布于初筛培养基平板中，每一浓度各取2块，选取其中菌落分散。
复筛环节，将菌落接种于液体培养基，37℃，220rpm摇床培养36h后进行发酵液酶活测定，测得酶活为31.18U/mL。表明从该菌落中的分离获得的菌株具有较高的海藻糖水解酶产生潜力，将该菌株继续分离纯化，并将纯化的菌株命名为C1。
富集培养基的组成为(g/L)：蛋白胨5；酵母膏1.5；葡萄糖150； MgSO4·7H2O 0.5；K2HPO4 0.5。
初筛培养基的组成为(g/L)：海藻糖15；KCl 1；KH2PO4 1；MgSO4·7H2O 0.5； CaCO31；在培养基中加入琼脂20；pH 7.0。
液体培养基的组成为(g/L)：海藻糖15；KCl 1；KH2PO4 1；MgSO4·7H2O 0.5； CaCO31；pH 7.0。
2、神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的形态及生理学特性鉴定
对菌株C1的固体平板、光学显微镜和电镜形态进行了观察与鉴定。结果发现，结果显示该菌株在固体LB培养基平板上划线接种，长出菌落呈圆形、凸起的菌落，表面光滑湿润，易挑取(图1)。革兰氏染色为红色，在光学显微镜下观察，细胞多呈胞直杆状，有时短链状(图2)。该菌株为短粗的革兰阴性杆状细菌，无荚膜，无芽孢，有周身鞭毛，运动较活泼，可利用柠檬酸和丙二酸作为唯一的碳源和能源。
3、神户肠杆菌(Enterobacter kobei)的分子生物学鉴定
将菌株C1在液体培养基中培养至对数生长期收集菌体，液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.2。提取菌株的基因组DNA作为PCR模板，选择16SrDNA扩增引物P1(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、 P2(GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，按表1 的配方于200μL PCR 管内配置50μL PCR反应体系。混匀溶液后，稍微离心使溶液完全处于PCR管底部，并将PCR管放入PCR仪。
表1 PCR反应体系
成分 用量
Premix Taq 25μL
基因组 2μL
上游引物P1 1μL
下游引物P2 1μL
ddH<sub>2</sub>O 21μL
PCR扩增条件：94℃预变性10min，95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，重复30次，72℃终延伸10min。扩增完成后利用凝胶电泳检测PCR扩增结果。以1×TBE缓冲液，10×Loading buffer染色，使用5000DL DNA Maker为标准Maker，150V电压下运行30min。使用凝胶成像仪观察，在1500bp处有明亮条带。PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，使用Thermo NanoDrop 2000测定所提基因组的浓度，测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。
该菌株C1的16S rDNA序列长度为1398bp，在NCBI数据库中进行序列 Blast比对，并通过Mega软件构建系统发育树确定其种属。系统发育树如图4，最终结果显示该菌株的16S rDNA序列与Enterobacter属(MF428922.1、 HQ242714.1等)的相关序列存在99％以上同源性，同时与Endophyte属 (AY842146.1)的相关菌株序列同源性在98％左右，最终将其归为Enterobacter 属菌株。结合形态特征(图3)和生理生化特性，将其鉴定为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)，命名为神户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17444。
实施例2
神户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1海藻糖酶的性质研究
将菌株C1接种到LB液体培养基中进行摇瓶发酵，35℃，220rpm培养12h，得到种子液，从种子培养基中将种子液按体积比3％的接种量接种到发酵TB培养基，35℃，220rpm培养2d获得含海藻糖酶的发酵液。
发酵TB培养基组分为：甘油8g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏20g/L、CaCO3 1g/L、K2HPO42g/L、KH2PO4 1g/L、pH 7。
实施例3
(1)标准酶活检测方法如下：
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的还原糖葡萄糖的含量：取 2mL EP管，实验组依次加入150μL酶液，150μL 10％的可溶性海藻糖为底物(水溶液)。对照组依次加入150μL稀释后的酶液，150μL pH 6.5的PBS缓冲液；37℃反应15min，实验组和对照组各加入300μL的DNS试剂；沸水浴5min终止反应，取出置于冰水混合物中冰浴2min；取200μL混合液在540nm测定其吸光度值。酶活(Unit)定义：在上述实验条件下，每min产生1μmoL葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
对该神户肠杆菌所产海藻糖酶发酵液进行酶活测定，酶活可达到 31.18U/mL。
(2)最适反应温度和温度稳定性研究方法如下：
最适反应温度：以50mM PBS缓冲液(pH 6.5)将酶液即实施例2制备发酵液等体积混合，在pH 6.5条件下，分别在30、35、40、45、50、55℃等温度下测定角海藻糖水解酶酶活，以最高酶活的反应温度作为最适反应温度。
温度稳定性：将酶液在不同温度(30、35、40、45、50、55℃)中热处理 30min后置冰上冷却，按照标准酶活测定方法在37℃测定角蛋白酶剩余酶活，以未经处理酶液的酶活作为对照。
研究发现该海藻糖酶的最适温度为35℃，在35～45℃范围内相对酶活可达到70％以上；在30～40℃范围内热稳定性都较高，残余酶活可保持在95％以上，但随着温度的升高，达到40℃及以上时热稳定性逐步下降(图5)。
(3)最适反应pH和pH稳定性研究方法如下：
最适反应pH：配制Britton-Robinson缓冲液，Britton-Robinson缓冲溶液是由磷酸、硼酸和醋酸混合成，向其中加入不同量的氢氧化钠可以组成pH范围很宽的缓冲溶液体系，pH 1.8～11.9。BR缓冲溶液的配制流程为：在100mL磷酸、硼酸和醋酸三种酸(浓度均为0.04mol/L)的混合液中，向其中加入不同体积的氢氧化钠(浓度为0.2mol/L)可以组成pH范围很宽的缓冲溶液。10％海藻糖底物溶液由上述缓冲液配制而成，酶液由上述缓冲液进行适度稀释。在37℃条件下，在不同缓冲液体系下(pH4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9)按照标准酶活测定方法进行酶活检测，以最高酶活的反应pH作为最适反应pH。
pH稳定性：将酶液置于不同pH缓冲液环境中并于冰上放置1h，然后在标准条件下进行酶活检测，以未经处理酶液的酶活作为对照。
考察该肠杆菌海藻糖酶的最适反应pH和pH稳定性，结果显示该海藻糖酶的最适pH为5.0，在pH 4～6范围内相对酶活可达到85％以上；海藻糖酶在酸性环境下稳定性较好，在pH 4～5范围内均能保持超过90％剩余酶活(图6)。
(4)金属离子和化学试剂对海藻糖酶活性的影响
金属离子的影响：首先配制200mM各金属离子母液，然后分别以1mM的终浓度加入到海藻糖水解酶液(即实施例2发酵液)活检测反应体系中处理30 min，然后再进行标准酶活检测反应(温度37℃、pH6.5)。以不加任何金属离子的反应作为对照。
化学试剂的影响：吐温、曲拉通、二甲基亚砜(DMSO)等先配制质量分数 10％的溶液，然后以1％终浓度加入到酶液中处理30min后进行标准酶活检测反应。十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)等先配制成200mM母液，然后按照1mM终浓度加入到酶液中处理30min后进行标准酶活检测反应，以上反应均以不加任何化学试剂的反应作为对照。
金属离子对酶活影响研究结果表明，与不添加任何金属离子的对照样品相比，大部分金属离子如Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、K+、Sn2+、Ba2+、Li+、 Na+、Co2+和Fe2+对酶活力都有抑制作用，Mn2+、Sn2+、Li+和Fe2+抑制效果尤为明显，而Ni2+对酶活力则未表现出显著的抑制或促进作用(表2 )。
化学试剂考察结果显示，与不添加任何化学试剂的对照样品相比，Triton X-114对酶活力具有明显促进作用，可使酶活力提升约36％，而Tween 20、Tween 80、Triton X-100、DMSO、SDS、DTT和PMSF对酶活力有抑制作用，其中， SDS的抑制作用最为显著，使相对酶活降低至22％，EDTA则对酶活力无显著影响(表3 )。
表2 终浓度1mM金属离子对神户肠杆菌海藻糖水解酶活性的影响
金属离子 相对酶活(％) 金属离子 相对酶活(％)
对照 100.00±2.67 K<sup>+</sup> 89.40±2.22
Mg<sup>2+</sup> 94.67±0.77 Sn<sup>2+</sup> 42.93±1.99
Ca<sup>2+</sup> 86.56±2.05 Ba<sup>2+</sup> 71.70±0.49
Zn<sup>2+</sup> 90.10±3.24 Li<sup>+</sup> 37.17±2.68
Mn<sup>2+</sup> 42.34±4.06 Na<sup>+</sup> 80.91±2.98
Cu<sup>2+</sup> 91.92±2.94 Co<sup>2+</sup> 58.47±0.67
Ni<sup>2+</sup> 100.67±2.23 Fe<sup>2+</sup> 41.85±3.03
表3 化学试剂对神户肠杆菌海藻糖酶活性的影响
Figure BDA0002304221920000081
上述实验表明，本发明所首次筛选获得的产海藻糖酶的神户肠杆菌C1可以有效地大量生产海藻糖水解酶，以海藻糖为底物测得该菌株全细胞酶活可达到31.18U/mL。该酶的最适温度和pH分别为35℃和pH5.0，在pH偏酸性条件下该酶仍表现出较高酶活和稳定性，Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、K+、Sn2+、Ba2+、 Li+、Na+、Co2+和Fe2+对酶活力具有一定抑制作用，而Ni2+对酶活则无显著影响； Triton X-114对酶活力具有明显促进作用；SDS表现出显著的抑制作用，EDTA 则对酶活力无明显影响；该酶在工业和医学领域具有较好的应用价值。
实施例4
神户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1海藻糖酶的性质研究
将菌株C1接种到LB液体培养基中进行摇瓶发酵，30℃，300rpm培养8h，从种子培养基中按体积比2％的接种量接种到发酵TB培养基，30℃，300rpm培养1d获得含海藻糖酶的发酵液。
实施例5
神户肠杆菌(Enterobacter kobei)C1海藻糖酶的性质研究
将菌株C1接种到LB液体培养基中进行摇瓶发酵，39℃，100rpm培养14h，从种子培养基中按体积比5％的接种量接种到发酵TB培养基，39℃，100rpm培养3d获得含海藻糖酶的发酵液。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江苏博扬生物制品有限公司
江南大学
<120> 一株产海藻糖水解酶的细菌及其选育方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 神户肠杆菌(Enterobacter kobei)
<400> 1
catgcaagtc gaacggtagc acagagagct tgctctcggg tgacgagtgg cggacgggtg 60
agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac 120
cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc 180
agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc 240
tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa 360
ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggt gttgtggtta ataaccgcag 420
caattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 480
cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca 540
agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca ttcgaaactg gcaggctaga 600
gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga 660
ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg 720
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt 780
gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac atccagagaa cttagcagag 960
atgctttggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt 1080
tcggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140
aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag 1200
aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct 1260
gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag 1380
taggtagctt aaccttcggg agggcgctta 1410

Claims (6)

1.一株产海藻糖水解酶的细菌C1，经鉴定为神户肠杆菌（Enterobacter kobei），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No. 17444。
2.一种利用权利要求1所述的产海藻糖水解酶的细菌C1生产的含海藻糖水解酶的发酵液。
3.一种权利要求2所述的含海藻糖水解酶的发酵液的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
将菌株C1接种到LB液体培养基中进行摇瓶发酵，30~39 ℃，100-300rpm培养8~14 h，得到种子液，种子液按体积比2%-5%的接种量接种到发酵TB培养基，30-39℃，100-300rpm培养1-3 d。
4.一种利用权利要求1所述的产海藻糖水解酶的细菌C1生产的海藻糖水解酶。
5.根据权利要求4所述的海藻糖水解酶，其特征在于，所述海藻糖水解酶酶学性质如下：
（1）最适温度35℃，最适pH5.0，并且温度和pH稳定性都具有明显优势，
在pH4-6范围内处理1h后，酶活力保留大于85％；
（2）Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、K+、Sn2+、Ba2+、Li+、Na+、Co2+和Fe2+对酶活力有抑制作用；
（3）Triton X-114对酶活力具有促进作用；Tween 20、Tween 80、Triton X-100、DMSO、SDS、DTT和PMSF对酶活力有抑制作用。
6.一种权利要求1所述的产海藻糖水解酶的细菌C1在工业和医学领域中的应用。
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