CN110692631A - 一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂及其制备方法，其步骤为菌种活化，种子液培养，固体发酵，孢子分离，固体培养基粉碎和制剂制备，得到哈茨木霉颗粒剂或可湿性粉剂。本发明在固体发酵培养基中加入中药药渣，发酵结束后将发酵产物干燥分离，得到哈茨木霉孢子粉，再将发酵培养基干燥后粉碎，加载体与孢子粉混合制成固体制剂，该固体制剂对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。

Description

一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂及其制备方法。

背景技术

哈茨木霉菌作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其中由镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此使用哈茨木霉进行生物防治根腐病处理，环保安全有效，可进行长期防治。

目前国外已有10余个商品化的木霉制剂问世，多为木霉孢子制剂，但木霉菌在植物病害防治中仍然存在很多问题，施用后在土壤中受温度、湿度、pH等因素影响，定殖能力不够理想，难以充分发挥药效，并且木霉菌对植物的促生增产作用不够显著。

针对以上不足，国内外进行了多项研究，专利CN201811550295.4公开了一种哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用，能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进葡萄生长和提高作物产量。专利CN200810154241.6公开了一种用中草药药渣发酵生防木霉的生产工艺，使用中药厂制药过程中的中药药渣作为培养基成分的一部分进行发酵生产生防木霉，以上两个专利均没有说明其得到的生防木霉活力如何，在生产上效果如何，对相关植物疾病的防治及促进增产作用不明显。

发明内容

基于以上现有技术，本发明的目的在于提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂及其制备方法，制备的固体制剂对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。

本发明所用的菌种哈茨木霉菌M-17，保藏编号：CCTCC NO：M2018538，拉丁文名称为Trichoderma harzianum M-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年8 月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明采用的技术方案为：一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂，其有效成分为哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质质量比为1:10～50。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述的木霉孢子制剂的剂型为颗粒剂或可湿性粉剂。

一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，待菌丝长满培养基得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物，对发酵结束的进行孢子计数；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制5～20％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量5～10％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤一中PDA培养基制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤二中种子培养基为蔗糖15～20g/L，酵母粉 3～6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2～1.5g/L，KH₂PO₄ 3.5～4.5g/L，NaNO₃ 6.5～7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，25～30min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床25～28℃培养3～6d，摇床转速180～220rpm。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤三中固体发酵培养基为中药药渣粉30～70％、马铃薯全粉10～20％、玉米粉10～30％、木屑0～15％，马铃薯皮5～7％，加水量为以上组分质量的70～80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121～125℃，维持45～60min，冷却后接入10～15％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养3～6d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.2～0.5vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，发酵结束后进行孢子计数，孢子数为2～8×10⁸个/克。

其中中药渣粉为中药煎煮后剩余药渣烘干粉碎过60目，按质量组成为甘草药渣粉0～100％、板蓝根药渣粉0～100％、葡萄酒皮渣0～60％。

其中孢子计数测定方法为：取0.5g固体发酵物，用含0.1％v/v甘油的无菌水稀释100 倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下统计孢子数。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤六颗粒剂和可湿性粉剂的制备步骤为：

A、哈茨木霉颗粒剂制备工艺为：

将哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质按质量比为1:100～500混合，加入浓度为0.1～1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1～3％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10～90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得木霉孢子颗粒剂；

B、哈茨木霉可湿性粉剂制备工艺为：

将上述收集孢子后的含中药药渣的固体培养基80℃以下烘干，用低温气流粉碎机粉碎，和哈茨木霉孢子混合，加入分散剂、润湿剂，混匀后制成可湿性粉剂。其中分散剂为十二烷基苯磺酸钠、NO、NNO、MF、木质素磺酸钠中的一种或几种的组合，分散剂重量为可湿性粉剂预期总重量的2～10％；润湿剂为茶枯、皂角、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种的组合，润湿剂重量为可湿性粉剂预期总重量的0.5～3％；载体为硅藻土、白炭黑、膨润土、轻质碳酸钙、凹凸棒土、高岭土中的一种或几种的组合，载体重量为可湿性粉剂预期总重量的10～90％。

有益效果

本发明的有益效果及创新点如下：

1、固体制剂发酵制备时，在固体培养基中添加部分中药渣可以作为微生物生长所必需碳源的补充并能降低培养基的生产成本，发酵后提高了哈茨木霉产孢量并且对镰刀菌的拮抗作用明显提高；

2、相比其他发酵培养基中使用的农副产品如黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆、淀粉、糊精等，本研究加入中药渣进行哈茨木霉发酵制剂的制备，是该专利的创新之一，变废为宝，减少了中药渣的环境污染，配方独特，环保安全高效；

3、制备的固体制剂，无论是颗粒剂还是可湿性粉剂都使用固体培养基残渣作为载体，进行了废渣再利用，减少了环境污染，同时中药渣发酵后的有益物质又提高了产品的防效；

4、本发明制备的制剂为活孢子制剂，生产过程孢子处理温度不超过50℃，用于马铃薯根腐病防治时使用方便，效果显著；

5、颗粒剂和可湿性粉剂的制备方法首次用于哈茨木霉，取得了理想效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

PDA培养基制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

实施例1

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养7d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖15g/L，酵母粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L， NaNO₃ 6.5g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，25min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床28℃培养3d，摇床转速180rpm；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药药渣粉50％、马铃薯全粉20％、玉米粉20％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121℃，维持60min。发酵结束后进行孢子计数，孢子数为2×10⁸个/克；

其中中药药渣粉为100％甘草药渣粉。

灭菌冷却后接入10％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养3d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.5vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制20％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量10％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂，可制成颗粒剂和可湿性粉剂，本实施例制作颗粒剂，步骤为

将哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质按质量比为1:100混合，加入浓度为0.1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得木霉孢子颗粒剂；

实施例2

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，26℃培养7d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖18g/L，酵母粉4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3g/L，KH₂PO₄ 3.8g/L， NaNO₃ 6.7g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，28min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床27℃培养4d，摇床转速180rpm；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药药渣粉70％、马铃薯全粉10％、玉米粉10％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，124℃，维持60min；发酵结束后进行孢子计数，孢子数为4×10⁸个/克；

其中中药药渣粉为50％甘草药渣粉和50％板蓝根药渣粉。

灭菌冷却后接入11％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养4d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.3vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制15％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量8％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂，可制成颗粒剂和可湿性粉剂，本实施例制作颗粒剂，步骤为

将哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质按质量比为1:300混合，加入浓度为0.5％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的2％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的50％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得木霉孢子颗粒剂；

实施例3

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，27℃培养6d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.4g/L，KH₂PO₄ 4.0g/L， NaNO₃ 6.8g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，28min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床26℃培养5d，摇床转速200rpm；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药药渣粉30％、马铃薯全粉20％、玉米粉30％、木屑15％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的70％；灭菌条件为蒸汽灭菌，125℃，维持45min；发酵结束后进行孢子计数，孢子数为8×10⁸个/克；

其中中药药渣粉为100％板蓝根药渣粉。

灭菌冷却后接入12％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养5d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.3vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制10％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量6％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂，可制成颗粒剂和可湿性粉剂，本实施例制作颗粒剂，步骤为

将哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质按质量比为1:500混合，加入浓度为1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的3％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得木霉孢子颗粒剂；

实施例4

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，28℃培养5d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.4g/L，KH₂PO₄ 4.4g/L， NaNO₃ 7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，30min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床25℃培养5d，摇床转速200rpm；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药药渣粉70％、马铃薯全粉10％、玉米粉10％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121℃，维持60min；发酵结束后进行孢子计数，孢子数为7×10⁸个/克；

其中中药药渣粉为70％甘草药渣粉和30％葡萄酒皮渣。

灭菌冷却后接入14％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养6d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.3vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制8％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量8％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂，可制成颗粒剂和可湿性粉剂，本实施例制作可湿性粉剂，步骤为

将上述收集孢子后的含中药药渣粉的固体培养基80℃以下烘干，用低温气流粉碎机粉碎，和哈茨木霉孢子混合，加入分散剂、润湿剂，混匀后制成可湿性粉剂。其中分散剂为十二烷基苯磺酸钠分散剂重量为可湿性粉剂预期总重量的10％；润湿剂、十二烷基硫酸钠，润湿剂重量为可湿性粉剂预期总重量的3％；载体为硅藻土、白炭黑、膨润土、轻质碳酸钙、凹凸棒土、高岭土中的一种或几种的组合，载体重量为可湿性粉剂预期总重量的50％。

实施例5

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养5d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖20g/L，酵母粉6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 4.5g/L， NaNO₃ 7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，30min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床25℃培养6d，摇床转速220rpm；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药药渣粉63％、马铃薯全粉10％、玉米粉20％、马铃薯皮7％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，123℃，维持60min；发酵结束后进行孢子计数，孢子数为6×10⁸个/克；

其中中药药渣粉为30％甘草药渣粉、10％板蓝根药渣粉和60％葡萄酒皮渣。

灭菌冷却后接入15％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养3d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.2vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束，得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制5％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量5％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂，可制成颗粒剂和可湿性粉剂，本实施例制作可湿性粉剂，步骤为

将上述收集孢子后的含中药药渣粉的固体培养基80℃以下烘干，用低温气流粉碎机粉碎，和哈茨木霉孢子混合，加入分散剂、润湿剂，混匀后制成可湿性粉剂。其中分散剂为NO、磺酸钠中的一种或几种的组合，分散剂重量为可湿性粉剂预期总重量的5％；润湿剂为烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种的组合，润湿剂重量为可湿性粉剂预期总重量的1％；载体为硅藻土载体重量为可湿性粉剂预期总重量的30％。

对上述实施例1至5中制得的哈茨木霉菌制成的固体制剂颗粒剂或可湿性粉剂，其有效活菌计数≥1亿/克，进行大田应用，使用方法为1kg菌剂加7kg水混合均匀后进行拌种；每亩大田施用1kg菌剂和100kg土的均匀混合物。

收获时调查各处理马铃薯薯块干腐病的发病级数，计算病情指数和防效。

干腐病病薯分级标准：0级：薯块上无病斑；1级：病斑小，病部面积整个薯块面积5％以下；3级：病斑较小，病部面积占整个薯块面积5～10％；5级：病斑较小或个别较大，病部面积占整个薯块面积11～25％；7级：病斑大小均有分布，病部面积占整个薯块面积26～50％；9级：病斑大小均有分布，病部相连面积占整个薯块面积的50％以上。

病情指数＝Σ(各级病薯数×相对级数值)×100/(调查总薯数×9)

相对防效(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％

试验结果如表3所示：

表1各实施例对马铃薯镰刀菌根腐病防效和产量的测定结果

由表1可知，施用本发明得到的哈茨木霉微生物菌剂可不同程度降低马铃薯镰刀菌根腐病发病，对马铃薯镰刀菌根腐病具有一定的防治效果，同时可增加马铃薯产量和提高商品薯率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂，其特征在于，其有效成分为哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质。

2.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂，其特征在于，所述哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质质量比为1:10～50。

3.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂，其特征在于，所述的木霉孢子制剂的剂型为颗粒剂或可湿性粉剂。

4.一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；

步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；

步骤三、固体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的固体发酵培养基中，待菌丝长满培养基得到含哈茨木霉孢子的固体发酵物；

步骤四、孢子分离：将固体发酵物自然风干，含水量控制5～20％，过100目收集哈茨木霉孢子；

步骤五、固体培养基粉碎：收集完哈茨木霉孢子的固体培养基进一步烘干，烘干温度不超过80℃，烘干至水分含量5～10％，烘干后进行粉碎，过60目筛备用；

步骤六、制剂制备：将哈茨木霉孢子和培养基粉碎基质按比例混合，加入其它载体制备哈茨木霉固体制剂。

5.根据权利要求4所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，其特征在于，步骤一中PDA培养基制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

6.根据权利要求4所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，其特征在于，步骤二中种子培养基为蔗糖15～20g/L，酵母粉3～6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2～1.5g/L，KH₂PO₄ 3.5～4.5g/L，NaNO₃ 6.5～7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，25～30min；接种量为；培养条件为黑暗条件下在摇床25～28℃培养3～6d，摇床转速180～220rpm。

7.根据权利要求4所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，其特征在于，步骤三中固体发酵培养基为中药渣粉30～70％、马铃薯全粉10～20％、玉米粉10～30％、木屑0～15％，马铃薯皮5～7％，加水量为以上组分质量的70～80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121～125℃，维持45～60min，冷却后接入10～15％的种子液，于25℃下静止培养3d，翻拌一次后继续培养3～6d，培养过程每天通风四次，每次30min，通风量0.2～0.5vvm，相对湿度控制55～80％，待菌丝长满培养基后固体发酵结束。

其中中药渣粉为中药煎煮后剩余药渣烘干粉碎过60目，按质量组成为甘草药渣粉0～100％、板蓝根药渣粉0～100％、葡萄酒皮渣0～60％。

8.根据权利要求4所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉固体制剂的制备方法，其特征在于，步骤六颗粒剂和可湿性粉剂的制备步骤为：

A、哈茨木霉颗粒剂制备工艺为：

将哈茨木霉孢子和含中药药渣的固体培养基粉碎基质按质量比为1:100～500混合，加入浓度为0.1～1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1～3％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10～90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得木霉孢子颗粒剂；

B、哈茨木霉可湿性粉剂制备工艺为：

将上述收集孢子后的含中药药渣的固体培养基80℃以下烘干，用低温气流粉碎机粉碎，和哈茨木霉孢子混合，加入分散剂、润湿剂，混匀后制成可湿性粉剂。其中分散剂为十二烷基苯磺酸钠、NO、NNO、MF、木质素磺酸钠中的一种或几种的组合，分散剂重量为可湿性粉剂预期总重量的2～10％；润湿剂为茶枯、皂角、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种的组合，润湿剂重量为可湿性粉剂预期总重量的0.5～3％；载体为硅藻土、白炭黑、膨润土、轻质碳酸钙、凹凸棒土、高岭土中的一种或几种的组合，载体重量为可湿性粉剂预期总重量的10～90％。