CN117814265B - 一种微生物发酵银杏外种皮的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种微生物发酵银杏外种皮的方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。本本发明筛选复配两株功能微生物菌株组成发酵菌剂，两者等比例混合后，协同配合，可实现银杏外种皮的高效发酵，其中，黑曲霉菌可以高效分泌纤维素酶、果胶酶等多种活性酶，在对于银杏外种皮的发酵过程中，可以高效分解细胞壁等成分，促进银杏外种皮活性成分的溶出；而巨大芽孢杆菌，其可以利用银杏外种皮的银杏多糖、蛋白质、鞣质等物质，减少杂质成分，同时在发酵过程其可以分泌酚类、黄酮类以及吲哚乙酸等物质，对于强致病烟草青枯病菌‑青枯劳尔氏菌有良好的抑制作用，同时可以促进烟草生长，提升烟叶品质。

Description

一种微生物发酵银杏外种皮的方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵银杏外种皮的方法及其应用。

背景技术

银杏科银杏属落叶乔木银杏Ginkgo bilobaL.素有“活化石”的美誉，银杏果由肉质的外种皮、骨质的中种皮、膜质的内种皮和种仁组成。工业生产中取其种仁作为药品、保健品、饮料、化妆品等的开发原料，外种皮多被废弃。

银杏外种皮味甘、性温，具有益气补虚的作用。银杏外种皮是银杏仁外的多汁表皮，其含有银杏酚酸、多糖、黄酮、内酯、矿物元素等多种成分，与银杏叶和种核的成分类似，具有抗肿瘤转移、抑菌、杀菌、抗氧化等作用，开发前景良好。目前对银杏外种皮的研究鲜有报道，银杏外种皮占整个种子质量的70%左右，每年有大量的银杏外种皮遭到废弃，这不仅造成了银杏资源的巨大浪费，而且造成了环境的严重污染。

银杏外种皮提取物(GBEE)主要含有银杏酚酸、银杏黄酮、银杏内酯和银杏多糖等化学成分。目前，国内外关于银杏外种皮活性成分的提取和利用的研究已有一些报道，但大多集中在干燥外种皮中活性成分的提取，对新鲜者的研究较少。且所提取的活性成分提取率不高，纯度低，功效单一且不稳定，很难对大量的银杏外种皮资源进行有效的利用。因此，如何开发一种高效的资源化利用银杏外种皮的方法，提升功效性是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供一种微生物发酵利用银杏外种皮制备银杏酚酸的方法，利用新鲜银杏外种皮为原料，通过复合菌株的高效预处理，促进有效物质的溶出，减少杂质，提升提取液活性物质含量，所得提取液不仅具有高效的抑菌活性，其经过发酵产生的活性成分，同时可以发挥促生作用。

为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种微生物发酵银杏外种皮的方法，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡3-4h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和1-3%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品。

优选的，步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比1:1混合后，得到微生物菌液。

更优选的，所述巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的保藏编号为CGMCCNo.27125，保藏于中国普通微生物保藏管理中心。

本发明巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）分离自临沂市临沂大学农业种植实验园番茄种植土壤中。

分离方法：采用5点取样法，取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样10g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养3h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于25-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的烟草青枯病菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液（将供试菌株接种于LB培养基中25-30℃振荡培养48h得到发酵液 ），以加入100μLLB为对照。25-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为巨大芽孢杆菌。

生物学特性：LB培养48h后的菌落形态为不规则形，直径2mm左右，显微黄色，表面有突起或褶皱，产生椭圆形芽孢。

所述黑曲霉菌（Aspergillus niger）购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏编号为CGMCC No.3.15663，原始保藏日期为2016年5月13日。所述黑曲霉菌可通过公开商业途径进行购买，无需进行另外保藏。

更优选的，步骤（2）所述LB琼脂培养基的组成为：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂18g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0；所述扩繁液体培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。

更优选的，步骤（2）发酵温度为25-30℃，发酵时间为40-50h。

优选的，步骤（3）固体和乙醇的质量为1:（10-15）。

一种微生物发酵银杏外种皮的方法的应用，应用方法所制备的产品应用于烟草青枯病的防治以及促进烟叶生长。

在烟叶生产中杀菌剂等农药的盲目使用，不仅污染环境，而且导致病原菌的抗药性增强。当前农产品绿色无公害生产已成为时代主题，绿色防控理念已深入人心。在此背景下，以植物诱导抗性、植物源杀菌剂、拮抗菌等为主的生物防治成为烟草农业生产健康持续发展的重要保证。

利用银杏外种皮制备生物农药，可以免除环境污染，变废为宝。而目前对于银杏外种皮种有效成分的提取，多集中在对于银杏干种皮中有效成分的提取，提取率较差，同时为了获得纯度较高的有效物质，还需要反复提纯和精制，这样繁杂的工艺过程，虽然得到了纯度较高的种皮提取物，但功能单一，成本较高，在实际农业种植中，很难得到有效的推广和利用，更无法实现大量银杏种皮资源的回收和有效再利用。因此需要重新开发一种高效利用银杏外种皮的方法。

有益效果：本发明筛选复配两株功能微生物菌株组成发酵菌剂，两者等比例混合后，协同配合，可实现银杏外种皮的高效发酵；其中，黑曲霉菌可以高效分泌纤维素酶、果胶酶等多种活性酶，在对于银杏外种皮的发酵过程中，可以高效分解细胞壁等成分，促进银杏外种皮活性成分的溶出；而从土壤中分离的巨大芽孢杆菌，其可以利用黑曲霉作用下高效溶出的银杏外种皮的银杏多糖、蛋白质、鞣质等物质，减少杂质成分，同时在发酵过程其可以分泌酚类、黄酮类以及吲哚乙酸等物质，对于强致病烟草青枯病菌-青枯劳尔氏菌有良好的抑制作用，同时可以促进烟草生长，提升烟叶品质。

附图说明

图1为不同菌液对烟草青枯病菌的抑菌效果图；

图2为不同菌液对烟草青枯病菌的拮抗活性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种微生物发酵银杏外种皮的方法，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡3h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和1%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品。

步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比1:1混合后，得到微生物菌液。

所述巨大芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27125，保藏于中国普通微生物保藏管理中心。

本实施例巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）分离自临沂市临沂大学农业种植实验园番茄种植土壤中。

分离方法：采用5点取样法，取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样10g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养3h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于25-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的烟草青枯病菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液（将供试菌株接种于LB培养基中25-30℃振荡培养48h得到发酵液），以加入100μLLB为对照。25-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。

生物学特性：LB培养48h后的菌落形态为不规则形，直径2mm左右，显微黄色，表面有突起或褶皱，产生椭圆形芽孢。

所述黑曲霉菌购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏编号为CGMCCNo.3.15663，原始保藏日期为2016年5月13日。所述黑曲霉菌可通过公开商业途径进行购买，无需进行另外保藏。

步骤（2）所述LB琼脂培养基的组成为：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂18g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0；所述扩繁液体培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。

步骤（2）发酵温度为25-30℃，发酵时间为40h。

步骤（3）固体和乙醇的质量为1:10。

一种微生物发酵银杏外种皮的方法的应用，应用方法所制备的产品应用于烟草青枯病的防治以及促进烟叶生长。

实施例2

一种微生物发酵银杏外种皮的方法，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡3.5h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和2%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品。

步骤（2）微生物菌液的制备方法同实施例1。

所述巨大芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27125，保藏于中国普通微生物保藏管理中心。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）分离自临沂市临沂大学农业种植实验园番茄种植土壤中。分离筛选方法同实施例1。

所述黑曲霉菌购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏编号为CGMCCNo.3.15663，原始保藏日期为2016年5月13日，同实施例1。

步骤（2）发酵温度为25-30℃，发酵时间为45h。

步骤（3）固体和乙醇的质量为1:12。

本实施例，除步骤（1）加水浸泡时间、步骤（2）发酵时间和微生物菌液的加入量以及步骤（3）固体和乙醇的质量比不同外，其余原料和步骤均相同。

实施例3

一种微生物发酵银杏外种皮的方法，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡4h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和3%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品。

步骤（2）微生物菌液的制备方法同实施例1。

所述巨大芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27125，保藏于中国普通微生物保藏管理中心。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）分离自临沂市临沂大学农业种植实验园番茄种植土壤中。分离筛选方法同实施例1。

所述黑曲霉菌购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏编号为CGMCCNo.3.15663，原始保藏日期为2016年5月13日，同实施例1。

步骤（2）发酵温度为25-30℃，发酵时间为50h。

步骤（3）固体和乙醇的质量为1:15。

本实施例，除步骤（1）加水浸泡时间、步骤（2）发酵时间和微生物菌液的加入量以及步骤（3）固体和乙醇的质量比不同外，其余原料和步骤均相同。

对比例1

一种微生物发酵银杏外种皮的方法，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡3h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和1%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品。

步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到微生物菌液。

本对比例除步骤（2）微生物菌液中仅仅包含保藏编号为CGMCC No.27125的巨大芽孢杆菌外，其余其余原料和步骤均相同。

对比例2

本对比例除步骤（2）微生物菌液中仅仅包含保藏编号为CGMCC No.3.15663的黑曲霉菌外，其余其余原料和步骤均相同。

对比例3

本对比例除步骤（2）微生物菌液中，改变巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株的用量比，其余其余原料和步骤均相同。

步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比2:1混合后，得到微生物菌液。

对比例4

本对比例除步骤（2）微生物菌液中，改变巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株的用量比，其余其余原料和步骤均相同。

步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比1:2混合后，得到微生物菌液。

对比例5

化学药剂：72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂500倍液，市售药剂。施药方法采用灌根法，每株200mL。

实验验证

1、抑菌实验

以实施例1为例，根据步骤（2）方法制备巨大芽孢杆菌、黑曲霉以及混合菌液，进行抑菌效果实验。以清水为空白CK组。

微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比1:2混合后，得到微生物菌液（混合菌液）。

烟草青枯菌为青枯劳尔氏菌，由临沂市农业科学院研究室分离自烟草青枯病样，并鉴定和保存。青枯菌用PSA培养基，30℃培养，得到青枯病菌悬液。

方法：取200μL青枯病菌悬液均匀涂布于NA平板上，平板中放置无菌滤纸片，分别滴加10μL待测菌液,待培养基充分吸收后，倒置于25-30℃恒温培养箱培养24h，观察抑菌效果并测量抑菌圈的直径。设置重复3次。抑菌效果如图1所示，从图中可以看出，本发明混合菌液抑菌效果最佳（32.5mm），巨大芽孢杆菌抑菌圈也较为明显且透明，直径达25.9mm，黑曲霉有抑菌效果（2.1mm），但相对巨大芽孢杆菌，相对较弱。

2、产生长素(3-Indoleacetic acid，IAA)能力测定：采用Salkowski比色法测定巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株产IAA能力。反应后红色越深，菌株产IAA能力越强。在530nm下测定其吸光度，然后根据IAA的标准曲线计算产IAA量。结果如表1所示。

3、种植实验

烟草：云烟系列云烟97；

试验方法：实验设置10个处理，每处理设3次重复，结果取平均值。每小区栽植烟株200株，小区采用随机区组排列，四周均设有保护行。根据季候条件，在移栽烟苗一月后，进行第一次施药，烟株打顶后进行第二次施药。施药方法采用灌根法，每株200mL。相关栽培管理措施按优质烟生产规范要求操作。试验地烟草青枯病历年发生。

供试药剂：实施例1-3、对比例1-4所得银杏外种皮提取物，对比例5药剂；

S1：实施例1粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S2：实施例2粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S3：实施例3粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S4：对比例1粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S5：对比例2粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S6：对比例3粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S7：对比例4粉剂，分散于清水中，制成2g/L的分散液，施药方法采用灌根法，每株200mL；

S8：对比例5，72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂500倍液，市售药剂。施药方法采用灌根法，每株200mL；

S9：等量清水。

烤烟农艺性状和青枯病发生情况及产质量测试

病害调查：病害于旺长期、成熟期调查2次，按标准GB23222—2008 进行病害分级。每小区随机取5点，每点调查5株。

烟草青枯病病情分级标准(以株为单位)：

0级:全株无病;

1级:茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎;

3级:茎部有黑色条斑，但不超过1/2，或病侧1/2-2/3叶片凋萎;

5级:茎部黑色条斑超过1/2，但未到达茎顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎;

7级:茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎;

9级:病株基本枯死。

发病率(%)=(发病株数/调查总株数)×100；

病情指数=∑(各级病株数×该病级代表值)/(总株数×最高级代表值)×100；

相对防效(%)=(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。

不同处理烟草青枯病的发病情况如表1所示：

表1不同时期不同处理组烟草青枯病发病情况

农艺性状及经济性状调查

农艺性状于成熟期进行1次调查，采用5点取样法，每点调查5株，测量烟株的株高、有效叶片数及叶片的最大长、宽值。

表2成熟期不同处理组农艺性状

从表1-2数据我们可以看出，本发明实施例1-3所得产品，对于烟草青枯病的防治效果与化学药剂（对比例5）相当，可替代化学药剂使用。而化学药剂对于烟株烟叶的生长无明显积极作用，本发明实施例药剂，对于烟株和烟叶的生长体现了明显的促进作用。而改变了微生物菌液中菌株组成的对比例1-4，两种功能微生物巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌间的协同平衡作用被打破，对于银杏外种皮的发酵效果减弱，活性物质减少，导致对于病原菌的抑制效果的减弱以及促生效果的下降。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种微生物发酵银杏外种皮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)银杏鲜果的脱皮：将采摘的银杏鲜果清洗除杂后，加水浸泡3-4h，机械分离果核得到新鲜银杏外种皮；

(2)银杏外种皮的预处理：将新鲜银杏外种皮使用组织捣碎机捣碎后与水按照质量比1:1混合均匀，紫外线灭菌处理后，加入固体质量5%的葡萄糖和1-3%的微生物菌液，进行充分发酵处理，得到发酵混合物；

(3)后处理及纯化：将步骤（2）得到的发酵混合物灭菌处理后冷冻干燥，得到固体，固体研磨后置于容器中，按一定质量比加入乙醇，70℃-75℃回流下，提取3次，每次3h，然后抽滤得到提取物上清液，将上清液浓缩、冻干得到终产品；步骤（2）微生物菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌株和黑曲霉菌株分别在LB琼脂培养基上，25-30℃活化培养48h后，接种至扩繁液体培养基中，继续在25-30℃、200r/min振荡培养24h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水将其稀释至有效活菌数为1×10⁸-2×10⁸CFU/mL，得到两种菌的菌悬液，再按照体积比1:1混合后，得到微生物菌液；所述巨大芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27125，保藏于中国普通微生物保藏管理中心；所述黑曲霉菌购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏编号为CGMCC No.3.15663。

2.根据权利要求1所述微生物发酵银杏外种皮的方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基的组成为：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂18g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0；所述扩繁液体培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。

3.根据权利要求1所述微生物发酵银杏外种皮的方法，其特征在于，步骤（2）发酵温度为25-30℃，发酵时间为40-50h。

4.根据权利要求1所述微生物发酵银杏外种皮的方法，其特征在于，步骤（3）固体和乙醇的质量为1:（10-15）。

5.一种权利要求1-4任意一项所述微生物发酵银杏外种皮的方法的应用，其特征在于，应用所述方法制备的产品用于烟草青枯病的防治以及促进烟叶生长。