CN116671525B - 液态复合微生物酵素及其制备方法、液态生物制剂以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农作物防病治病技术领域，具体公开了一种液态复合微生物酵素及其制备方法、液态生物制剂以及它们的应用。本发明提供的液态复合微生物酵素及液态生物制剂能够促进药用植物生长发育，改善土壤质量，并且能够保留中药材中的有效成分，对三七、珠子参、雪上一枝蒿、重楼和贝母等药用植物的真菌性或细菌性土传病害防效较高，具有广阔的应用前景。

Description

液态复合微生物酵素及其制备方法、液态生物制剂以及它们 的应用
技术领域
本发明涉及农作物防病治病技术领域，具体涉及一种液态复合微生物酵素及其制备方法、液态生物制剂以及它们的应用。
背景技术
滇药用植物种植业发展迅猛，但随之而来的病害问题也日益突出，严重影响产业的持续健康发展。特别是由微生物引起的真菌性根腐病和细菌性软腐病等土传病害的频繁发生严重阻碍了药用植物种植业的发展，这些病害在药材种植大棚中一旦发生，将面临大面积绝收，不仅给农户们造成无法挽回的损失，对于下游以中草药为原料进行的药物研发和生产工作也会造成严重影响。
然而，目前对于土传病害的防治方法仍依赖于大面积使用化学药剂，虽然化学药剂能够短期内高效的杀死病原物，看似对于药用植物土传病害具有较好防治效果，但是长期或过量使用不仅会产生农药残留等中药材安全问题，还可能污染环境，导致更加严重的土壤退化、污染以及植株抵抗力下降，导致土传病害反复频发等问题，形成恶性循环，不利于药用植物种植业的可持续发展。另外，化学药剂的使用不当还可能影响药用植物中活性物质的代谢和积累，造成药用植物中有效成分含量不足(即造成中药材“药性”损失)，从而导致中药材质量下降。因此，研发绿色、有效、对中药材质量影响小且符合可持续发展观要求的药用植物土传病害防治措施对于中药材安全生产具有着重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的缺乏对药用植物土传病害防治效果好，且对环境和中药材质量影响小的防治方法和相关产品等问题，提供了一种液态复合微生物酵素及其制备方法、液态生物制剂以及它们的应用，旨在提高对药用植物真菌性和细菌性土传病害的防治效率，为中药材质量和产量提供有力保障。
为了实现以上目的，本发明一方面提供一种制备液态复合微生物酵素的方法，所述方法包括将灭菌的原料中接种复合微生物菌剂，在发酵条件下进行发酵，获得复合微生物酵素，
其中，所述原料按照重量份包括：黄豆粉10-30份，核桃青皮10-30份，稻壳10-30份，复合微生物菌剂0.5-1份，水20-30份；
所述的复合微生物菌剂中的活性成分包括恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌。
本发明第二方面提供根据第一方面所述的方法制备获得的液态复合微生物酵素。
本发明第三方面提供一种液态生物制剂，所述液态生物制剂按照重量份包括以下原料：复合微生物酵素1-10份、复合微生物菌剂0.1-0.5份，有机物料30-70份和水20-60份，其中，所述复合微生物酵素为第二方面所述的复合微生物酵素，所述复合微生物菌剂中的活性成分包括恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌。
本发明第四方面提供第二方面所述的液态复合微生物酵素，和/或第三方面所述的液态生物制剂在防治药用植物真菌性和细菌性土传病害中的应用。
本发明第五方面提供一种防治药用植物真菌性和细菌性土传病害的方法，所述方法包括将第二方面所述的液态复合微生物酵素，和/或，第三方面所述的液态生物制剂施用于种植药用植物的土壤中。
相对于现有技术，本发明提供的技术方案至少具有如下有益效果：
(1)施用本发明提供的液态复合微生物酵素及由所述酵素制备的液态生物制剂对于药用植物中的有效成分的代谢和积累没有不利影响(即不会造成中药材的“药性”损失)，减少因病害防治产品的使用导致的中药材质量降低的问题。
(2)本发明提供的液态复合微生物酵素及由该酵素制备的液态生物制剂具有较高活性，其中所含的有效成分大多是可以直接作用于病原菌的物质，相比传统生物农药而言利用率更高，病原物消减的更快，施用后作物恢复的也更好。
(3)本发明提供的液态复合微生物酵素及由该酵素制备的液态生物制剂对于药用植物的真菌性和细菌性土传病害具有较好的防治效果，尤其是对药用植物的根腐病和软腐病具有良好的防治效果。
(4)本发明提供的液态复合微生物酵素及由该酵素制备的液态生物制剂还能促进肥料分解，提高肥料中的营养元素的利用率。此外，还可以促进药用植物对氮源的吸收，从而提高药用植物的生长，以及调节土壤酸碱性，改善土质。
(5)本发明提供的液态复合微生物酵素及由该酵素制备的液态生物制剂以核桃青皮、稻壳等农业生产废弃物作为主要原料，实现了废弃物资源化，有助于资源回收利用和产业结构优化升级。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
土传病害是限制种植业发展和农民增收的主要原因之一，土传病害的发生不仅影响作物的产量，还会造成农产品的质量(例如产品外观品相、单果重量等)降低。因此，通常对于土传病害的防治产品和方法对于病害防治效果的考量更多的是注重降低土传病害发生频率，以及减少土传病害对作物产品的尺寸大小和外观品相等方面造成的损失。但是，药用植物和普通农作物的种植之间又有所不同，对于药用植物病害的防治，一方面需要考量防治效果，减少土传病害带来的中药材减产损失，另一方面还需要注意尽可能保留中药材中的有效成分(即保留药用植物的“药性”)，减少病害防治产品对药用植物有效成分的代谢和积累的不利影响，避免因病害防治产品的使用导致的中药材质量降低的问题。
本发明的发明人在研究中巧妙地发现，通过将核桃青皮、黄豆粉、稻壳等原料采用特定的微生物进行发酵后获得的酵素(即发酵液)不论是在单独使用时，还是配合海藻酸、氨基酸等物料配制成液态生物制剂时，对于药用植物土传病害都具有良好的防治效果，而且能够有效改善土质，促进药用植物生长。经过进一步研究，发明人还发现，采用恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌、公牛链霉菌复配而成的复合菌剂不仅能够利用上述原料进行酵素制备，而且这些菌株及其代谢产物的施用对于药用植物土传病害的防治效果以及作物的生长发育的促进作用也具有积极效果。此外，发明人还意外地发现，采用上述酵素后基于该酵素制备的液态生物制剂进行药用植物土传病害防治时，获得的中药材中的有效成分不仅得到保留，与不使用任何病害防治产品相比还有所提高，对于高质量中药材生产具有重要意义。
基于上述发现，本发明一方面提供一种制备液态复合微生物酵素的方法，所述方法包括将灭菌的原料中接种复合微生物菌剂，在发酵条件下进行发酵，获得复合微生物酵素，
其中，所述原料按照重量份包括：黄豆粉10-30份，核桃青皮10-30份，稻壳10-30份，复合微生物菌剂0.5-1份，水20-30份；
所述的复合微生物菌剂中的活性成分包括恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌。
本发明提供的方法中，所采用的原料中的各组分分别至少具有以下作用：
黄豆粉和核桃青皮：作为复合微生物菌剂提供的微生物所必须的营养原料，在发酵过程中被微生物分解为多糖、氨基酸、有机盐等物质，从而被微生物利用合成细胞内部结构，如：细胞膜、遗传物质(RNA)、鞭毛、细胞质等；也能够合成细胞内外物质：如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、消化酶、氨基酸酶、植物刺激素、吲哚乙酸、链霉素、生物碱、抗生素、有机酸、有机碱、多肽、维生素等。
稻壳：微生物将其分解为多糖、海藻糖、芳香族醇等物质，这些是复合微生物酵素中的真菌细胞壁合成的主要物质，也是其中细菌芽孢产生所需要的物质。
复合微生物菌剂：发酵分解黄豆粉、核桃青皮、稻壳等原料，获得含有大量具有防治土传病害、改善土质、促进药用植物生长发育以及促进药用植物中活性成分合成和积累等功效的小分子活性物质和代谢产物的复合微生物酵素。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述原料按照重量份包括：黄豆粉10-20份，核桃青皮10-20份，稻壳10-20份，复合微生物菌剂0.5-0.8份，水25-30份。
优选地，所述原料中，黄豆粉、核桃青皮和稻壳的重量比为1:0.5-1.5:0.5-1.5。优选为1:0.8-1.2:0.8-1.2。
优选地，所述原料中，干物质(即黄豆粉、核桃青皮、稻壳等)含量不超过85重量％。优选为50-85重量％，更优选为60-80重量％。例如可以为60重量％、62重量％、64重量％、65重量％、66重量％、67重量％、68重量％、69重量％、70重量％、72重量％、74重量％、76重量％、78重量％、80重量％，或者也可以为上述任意两个数值组成的范围中的任意中间值。采用优选干物质含量的原料制备获得的液态复合微生物酵素施用于药用植物时，能够获得更好的病害防治和对土壤质量的改良效果，而且收获的中药材中有效成分含量也会更高，有效提高了中药材的产量和质量。
本发明中，对于用于上述液态复合微生物酵素制备的复合微生物菌剂中选用的具体菌株没有特别限制，只要获得的酵素具有防治药用植物土传病害、促进药用植物生长发育、促进药用植物中有效成分的合成和积累以及改善土质等效果即可。发明人经过进一步研究发现，采用特定菌株复配获得的复合菌剂制备获得的酵素具有更好的作用效果。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述恶臭假单胞菌的保藏编号为CGMCCNo.17926(获取方式可参考CN201910677599.5)，所述木霉菌的保藏编号为CGMCC No.21023(获取方式可参考CN202011610974.3)，所述卡氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20221660(获取方式可参考CN202211742732.9)，所述公牛链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.1682(获取方式可参考CN200610048661.7)。
发明人经过长期研究发现，上述恶臭假单胞菌能够产生铁载体，为药用植物提供充足的铁元素，同时也能有效减少环境中病原菌可利用铁的含量而降低其致病力，增强植株抗性，从而抑制细菌性土传病害，并且该菌株还可以分泌多种酶和抗生素，而且有良好的发酵基础。上述木霉菌具有抑制真菌性土传病害的作用，在高酸性环境中保持特性不变，还能够促进作物生长。上述卡氏芽孢杆菌的抗逆性强，可以溶解钙、磷、铁等金属元素，促进肥料溶解吸收，抑制病原物生长。上述公牛链霉菌可以抑制病原菌，促进生长，促进根的发育。并且，发明人在研究中还意外地发现，上述菌株共同使用时，具有协同增效作用，不仅利于获得高品质好效果的酵素产品，而且能够更好地发挥促进药用植物生长发育、促进药用植物有效成分的代谢和积累、改善土质以及防治土传病害等作用。
为了提高酵素的制备效率，获得效果更好的微生物酵素，优选地，所述复合微生物菌剂的用量使得接种后的原料中：恶臭假单胞菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，木霉菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL。
更优选地，所述复合微生物菌剂的用量使得接种后的原料中：恶臭假单胞菌的有效活菌数为1×106-1×108CFU/mL，木霉菌的有效活菌数为1×106-1×108CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数为1×106-1×108CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数为1×106-1×108CFU/mL。
发明人经过进一步研究还发现，复合微生物菌剂中不同菌种的用量比对于酵素的作用效果也具有重要影响。为了获得对药用植物的促生效果和病害防治效果更好的微生物酵素，优选地，所述复合微生物菌剂的用量使得接种后的原料中：恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为0.5-2:0.5-2:0.5-2:1。优选为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:1。
更优选地，恶臭假单胞菌和木霉菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
更优选地，木霉菌与卡氏芽孢杆菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
更优选地，恶臭假单胞菌和卡氏芽孢杆菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
本发明中，可以直接按照前述比例称取使用灭菌后的原料进行微生物酵素制备，也可以先按照前述比例称量除复合微生物菌剂之外的原料并将其混合后，再对获得的混合物进行灭菌处理。本领域中任意能够用于酵素原料灭菌的方法均可适用于本发明。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述灭菌的条件包括：温度120-130℃，时间0.5-1h。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵条件包括：发酵温度20-24℃，发酵时间7-14天。本发明中，对于发酵的具体时间没有特别严格的限制，当没有稻壳漂浮在发酵液上层时即可结束发酵。本领域技术人员可以根据实际情况决定发酵时间，例如，若达到上述标准时发酵不满7天，可提前结束发酵，若发酵14天后仍未达到上述标准，也可适当延长发酵时间。
本发明中，可以采用本领域常规的灭菌、发酵方法，按照前述方式和条件进行酵素制备。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述液态复合微生物酵素制备方法可以包括：将黄豆粉、核桃青皮、稻壳和水混合，装入发酵容器(例如菌包袋等)后密封，然后将入料的发酵容器放入灭菌锅高温灭菌，取出后待自然冷却，接种复合微生物菌剂，再将接种后的发酵容器置于发酵条件下发酵，发酵结束后滤出发酵液(以去除未降解的原料残渣等沉淀物)，制得液态复合微生物酵素。
本发明第二方面提供根据第一方面所述的方法制备获得的液态复合微生物酵素。
本发明提供的液态复合微生物酵素中含有原料降解产生的多糖、氨基酸、有机盐等物质，以及大量可供作物吸收利用的矿物质微量元素，例如：钙、铁、锌、镁、钾、钠等，还含有一些其他的能够直接作用于病原菌的小分子物质以及微生物代谢产物等，具有防治药用植物土传病害(尤其是真菌或细菌导致的根腐病和软腐病等病害)、改善土壤质量、以及提高病害区药用植物中有效成分的积累等作用效果。
本发明第三方面提供一种液态生物制剂，所述液态生物制剂按照重量份包括以下原料：复合微生物酵素1-10份、复合微生物菌剂0.1-0.5份，有机物料30-70份和水20-60份，其中，所述复合微生物酵素为第二方面所述的复合微生物酵素，所述复合微生物菌剂中的活性成分包括恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述液态生物制剂中，复合微生物酵素、有机物料和水的重量比为1:5-20:5-20。优选为1:8-18:8-15。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述复合微生物菌剂中，所述恶臭假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.17926，所述木霉菌的保藏编号为CGMCC No.21023，所述卡氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20221660，所述公牛链霉菌的保藏编号为CGMCC No.1682。
优选地，所述复合微生物菌剂中，恶臭假单胞菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，木霉菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL。
更优选地，所述复合微生物菌剂中，恶臭假单胞菌的有效活菌数为1×108-1×1010CFU/mL，更优选为5×108-5×109CFU/mL，木霉菌的有效活菌数为1×108-1×1010CFU/mL，更优选为5×108-5×109CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数为1×108-1×1010CFU/mL，更优选为5×108-5×109CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数为1×108-1×1010CFU/mL，更优选为5×108-5×109CFU/mL。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述复合微生物菌剂中，恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为0.5-2:0.5-2:0.5-2:1。优选为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:1。
优选地，恶臭假单胞菌和木霉菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
优选地，木霉菌与卡氏芽孢杆菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
优选地，恶臭假单胞菌和卡氏芽孢杆菌的有效活菌数之比为0.5-1.5:1。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述液态生物制剂中，由所述复合微生物菌剂提供的恶臭假单胞菌的有效活菌数为1×105-1×107CFU/mL，优选为5×105-5×106CFU/mL，更优选为1×106-5×106CFU/mL，木霉菌的有效活菌数为1×105-1×107CFU/mL，优选为5×105-5×106CFU/mL，更优选为1×106-5×106CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数为1×105-1×107CFU/mL，优选为5×105-5×106CFU/mL，更优选为1×106-5×106CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数为1×105-1×107CFU/mL，优选为5×105-5×106CFU/mL，更优选为1×106-5×106CFU/mL。由于该液态生物制剂中还含有部分由液态复合微生物酵素带来的恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌，因此液态生物制剂中的实际活菌含量应高于上述水平。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述有机物料包括海藻酸和氨基酸。优选采用液态海藻酸和液态氨基酸。
优选地，以干物质计，所述海藻酸与氨基酸的重量比为3-10:1。优选为5-8:1。
本发明中，对于用作有机物料的原料(如海藻酸和氨基酸等)没有特别限制，其可以是本领域任意能够用于液态生物制剂制备的相关产品，既可以是商购获得的相关产品，也可以是按照现有技术自行制备的相关产品。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述液态氨基酸中水分含量为70-80重量％。优选为70-75重量％。
优选地，所述液态氨基酸中，以干物质计，游离氨基酸含量为20-30重量％。优选为25-30重量％。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述液态海藻酸中水分含量为35-45重量％。优选为35-40重量％。
优选地，所述液态海藻酸中，以干物质计，海藻酸含量为55-65重量％。优选为60-65重量％。
本发明进一步提供上述液态生物制剂的制备方法，优选所述方法包括：将有机物料加入复合微生物菌剂、液态复合微生物酵素、水，混匀后即制得液态生物制剂。
本发明第四方面提供第二方面所述的液态复合微生物酵素，和/或第三方面所述的液态生物制剂在防治药用植物真菌性和细菌性土传病害中的应用。
由于本发明提供的酵素中所含的活性成分大部分是小分子物质(例如氨基酸、脂肪酸和糖类等)，使其比传统生物农药更耐高温，耐低温，耐盐碱，耐干湿，耐药物，从而具有更长的保质期。该酵素以及基于该酵素制备的液态生物制剂能够避免在强光或长时间存放下有效成分的损失。并且对于药用植物的种植区域、具体作物选择、种植季节和气候情况等没有特殊要求，即使种植的药用植物的种类、地区、季节、气候等条件发生改变，其效果都能够得到稳定保障。需要注意的是，由于本发明提供的酵素和基于该酵素制备的液态生物制剂的活性成分除上述小分子物质外，还包括活菌(例如在制备酵素或液态生物制剂时添加的恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌等)，当选用保藏编号为CGMCCNo.17926的恶臭假单胞菌时，由于实验中发现该菌株具有一定的致病性(针刺接种至植物可能导致软腐病发生)，为了避免因产品使用不当导致的药用植物病害发生或加重的情况，本发明提供的酵素和基于该酵素制备的液态生物制剂在使用时应施用于土壤中，避免与植株的直接接触，尤其避免与植株表面的伤口接触。
而且，本发明提供的酵素和基于该酵素制备的液态生物制剂还能促进肥料分解，更加利于药用植物对肥料的应用率。例如，本发明优选地恶臭假单胞菌和卡氏芽孢杆菌能够促进磷钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素溶解，使得磷钾利用率提高20％以上。
此外，本发明提供的酵素和基于该酵素制备的液态生物制剂还能促进氮源吸收，调节土壤酸碱，从而具有改善土质，提高土壤肥力的功效。本发明所使用的微生物和土壤中硝化细菌的共生作用，可以促进NH4 +以及NO3 -氮源的循环，提高作物对铵态氮、硝态氮和有机氮的利用，并且调节了土壤酸碱性(pH)。
本发明提供的酵素和基于该酵素制备的液态生物制剂能够有效促进药用植物对真菌性和细菌性土传病害的抗性，提高防治效果。尤其是对三七根腐病、珠子参根腐病、雪上一枝蒿根腐病、重楼细菌性软腐病和贝母细菌性软腐病等病害具有良好的防治效果。
“雪上一支蒿”本义是一种中药材的名称，是由毛茛科乌头属多种药用植物的块根炮制而成的，具有祛风除湿、活血止痛的功效。本发明中，采用的是雪上一枝蒿的引申义，也即，将这些能够产出雪上一枝蒿的乌头属植物统称为雪上一枝蒿。任意能够产出雪上一枝蒿的药用植物均可采用本发明提供的方法或产品进行土传病害防治，例如短柄乌头(Aconitum brachypodum Diels.)、展毛短柄乌头(Aconitum brachypodumDiels.var.laxiflorum Fletcher et Lauener)、曲毛短柄乌头(Aconitum brachypodumvar.crispulum W.T.Wang)、宣威乌头(Aconitum nagarum Stapf var.lasiandrumW.T.Wang)、小白撑(Aconitum nagarum Stapf var.heterotrichum Fletcher etLauener)、铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)、伏毛铁棒锤(Aconitum flavum Hand.-Mazz.)等。
本发明第五方面提供一种防治药用植物真菌性和细菌性土传病害的方法，所述方法包括将第二方面所述的液态复合微生物酵素，和/或，第三方面所述的液态生物制剂施用于种植药用植物的土壤中(例如可以施用于药用植物根际土壤中等)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述药用植物真菌性土传病害选自三七根腐病、珠子参根腐病和雪上一枝蒿根腐病中的至少一种。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述药用植物细菌性土传病害选自重楼软腐病和/或贝母软腐病。
本发明提供的方法中，对于所述液态微生物酵素或液态生物制剂的用量没有特别限制，只要能够促进药用植物生长发育、改善土壤质量、或是提高药用植物对于(前述)土传病害的防治效果即可。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述液态复合微生物酵素的施用量为200-300mL/株。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述液态生物制剂的施用量为200-300mL/株。
为了获得更好的药用植物促生效果和/或土传病害防治效果，优选地，所述液态复合微生物酵素或液态生物制剂的施用频率为每茬作物施用1-3次。
下面将结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，液态氨基酸购自济南清海化工有限公司，液态海藻酸购自山东海之星进出口有限公司。复合微生物菌剂为通过将恶臭假单胞菌(保藏编号为CGMCCNo.17926)、木霉菌(保藏编号为CGMCC No.21023)、卡氏芽孢杆菌(保藏编号为CCTCC NO：M20221660)和公牛链霉菌(保藏编号为CGMCC No.1682)的菌株分别扩培后，按照一定比例将培养液混合，从而制备的液态复合菌剂，其中恶臭假单胞菌的有效活菌数为1×109CFU/mL，木霉菌的有效活菌数为1×109CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数为1×109CFU/mL。液体氨基酸中的氨基酸含量采用双指示剂甲醛滴定法测定，液体海藻酸中的海藻酸含量采用咔唑硫酸分光光度法测定。检测结果如表1所示。
表1物料检测结果
实施例1
按照表2中各物料的重量份配比称取原料，先将黄豆粉、核桃青皮、稻壳和水混合后装入菌包袋中，扎紧袋口后，将入料的菌包袋放入灭菌锅，121℃灭菌30min。灭菌结束后，将菌包袋取出自然降温至室温后，接种复合微生物菌剂，再将接种后的菌包袋袋口扎紧，放入发酵室中，在22±2℃的温度下发酵10天左右(当没有稻壳漂浮在发酵液上层时即可结束发酵)。
表2液态复合微生物酵素原料配比
注：复合微生物菌剂按照1mL＝1g折算重量份。
对比例1
按照如下方法制备液态复合微生物酵素：
(1)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，将其中的黄豆粉替换为等重量(以干物质计)的大豆粉，获得酵素D7。
(2)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，将其中的核桃青皮替换为等重量(以干物质计)的核桃干壳，获得酵素D8。
(3)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，将其中的稻壳替换为等重量(以干物质计)的麦麸，获得酵素D9。
(4)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，使用等质量的替换菌剂替代制备酵素A1时使用的复合微生物菌剂，获得酵素D10。替换菌剂的制备方法为：调整制备酵素A1使用的复合微生物菌剂中的恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为0.5:0.5:0.5:1，并保持其中的总有效活菌数与复合微生物菌剂相同。
(5)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，使用等质量的替换菌剂替代制备酵素A1时使用的复合微生物菌剂，获得酵素D11。替换菌剂的制备方法为：调整制备酵素A1使用的复合微生物菌剂中的恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为3:2:3:1，并保持其中的总有效活菌数与复合微生物菌剂相同。
(6)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，将其中的复合微生物菌剂替换为等质量的卡氏芽孢杆菌CCTCC NO：M 20221660菌剂，该菌剂中的总有效活菌数与制备酵素A1使用的复合微生物菌剂相同，获得酵素D12。
(7)按照实施例1中制备酵素A1的方法，不同的是，将其中的复合微生物菌剂替换为等质量的公牛链霉菌CGMCC No.1682菌剂，该菌剂中的总有效活菌数与制备酵素A1使用的复合微生物菌剂相同，获得酵素D13。
实施例2
按照表3中各物料的重量份配比称取原料，将各物料混合制成液态生物制剂。具体方法包括：将有机物料(将液态海藻酸和液态氨基酸按照3:1的重量比混合而成)加入到双轴预混机中混匀，再加入复合微生物菌剂、液态复合微生物酵素和水，拌和均匀即可。
表3液态生物制剂配方
实施例3
按照如下方法制备液态生物制剂：
(1)按照实施例2中制备液态生物制剂I-1的方法，不同的是，采用的有机物料中仅含液态氨基酸，获得液态生物制剂II-7。
(2)按照实施例2中制备液态生物制剂I-1的方法，不同的是，采用的有机物料中仅含液态海藻酸，获得液态生物制剂II-8。
(3)按照实施例2中制备液态生物制剂I-1的方法，不同的是，采用的有机物料中液态海藻酸和液态氨基酸的重量比为1：1，获得液态生物制剂II-9。
测试例
本测试例用于说明本发明提供的液态复合微生物酵素和液态生物制剂对三七、珠子参、雪上一枝蒿、重楼和贝母土传病害的田间防治效果、土壤养分含量的调节效果以及对中药材中的有效成分的影响。
将上述实施例中的液态复合微生物酵素和液态生物制剂按照表4中的用量施用于三七、珠子参、雪上一枝蒿(短柄乌头)、重楼和贝母根际土壤中。使用频率为每茬作物3次(定植后0天、20天和30施用)。同时在施用本发明提供的液态复合微生物酵素和液态生物制剂(处理组)和未施用该液态复合微生物酵素和液态生物制剂(对照组)的大棚中种植三七、珠子参、雪上一枝蒿、重楼和贝母(每个试验组种植100株)，于收获期调查药用植物发病情况和药用植物土壤养分情况(结果详见表5)，计算病害防治效果(表4)、以及收获的中药材中的有效成分含量(表6)。
根腐病分级标准：
0级:全株无病。
1级:病斑占根表面积5％以下；
2级:病斑占根表面积6％～10％；
3级:病斑占根表面积11％～25％；
4级:病斑占根表面积26％～50％；
5级:病斑占根表面积51％～75％；
6级:病斑占根表面积75％以上或完全腐烂；
细菌性软腐病分级标准：
0级:全株无病；
1级:植株底脚叶及叶鞘出现枯黄症状；
3级:植株中部以下叶片发黄，叶鞘枯黄坏死；
5级:植株中上部片发黄，叶鞘枯黄坏死；
7级:植株整株发黄；
9级:植株整株枯死、倒伏。
病情指数＝[(Σ(病级株数×代表级数))/(总株数×最高代表级值)]×100防治效果(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％
土壤养分含量测定方法：全氮和碱解氮采用凯氏定氮法测定；全磷和有效磷采用HCIO4-H2SO4法测定；全钾和速效钾采用火焰光度计法测定；有机质含量采用烧失量法测定；pH采用点位法测定。
中药材有效成分测定方法：皂苷类物质采用比色法测定；雪上一枝蒿甲、乙、丙、丁、戊、己、庚素采用薄层色谱法测定；生物碱类物质采用毛细管电泳法测定。
表4真菌性和细菌性土传病害防治效果试验测试条件及结果
表5药用植物根际土壤养分含量测试条件及结果
表6中药材中有效成分含量测试条件及结果
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种制备液态复合微生物酵素的方法，其特征在于，所述方法包括将灭菌的原料中接种复合微生物菌剂，在发酵条件下进行发酵，获得复合微生物酵素，
其中，所述原料按照重量份包括：黄豆粉10-30份，核桃青皮10-30份，稻壳10-30份，水20-30份；所述复合微生物菌剂重量份0.5-1份；
所述的复合微生物菌剂中的活性成分包括保藏编号为CGMCC No.17926的恶臭假单胞菌、保藏编号为CGMCC No.21023的木霉菌、保藏编号为CCTCC NO：M 20221660的卡氏芽孢杆菌和保藏编号为CGMCC No.1682的公牛链霉菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述复合微生物菌剂的用量使得接种后的原料中：恶臭假单胞菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，木霉菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数不低于1×105CFU/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述复合微生物菌剂的用量使得接种后的原料中，恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为0.5-2:0.5-2:0.5-2:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵条件包括：发酵温度20-25℃，发酵时间7-14天。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法制备获得的液态复合微生物酵素。
6.一种液态生物制剂，其特征在于，所述液态生物制剂按照重量份包括以下原料：复合微生物酵素1-10份、复合微生物菌剂0.1-0.5份，有机物料30-70份和水20-60份，其中，所述复合微生物酵素为权利要求5所述的复合微生物酵素，所述复合微生物菌剂中的活性成分包括保藏编号为CGMCC No.17926的恶臭假单胞菌、保藏编号为CGMCC No.21023的木霉菌、保藏编号为CCTCC NO：M 20221660的卡氏芽孢杆菌和保藏编号为CGMCC No.1682的公牛链霉菌；
所述有机物料包括海藻酸和氨基酸；以干物质计，所述海藻酸与氨基酸的重量比为3-10:1。
7.根据权利要求6所述的液态生物制剂，其中，所述复合微生物菌剂中，恶臭假单胞菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，木霉菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，卡氏芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL，公牛链霉菌的有效活菌数不低于1×108CFU/mL。
8.根据权利要求6或7所述的液态生物制剂，其中，所述复合微生物菌剂中，恶臭假单胞菌、木霉菌、卡氏芽孢杆菌和公牛链霉菌的有效活菌数之比为0.5-2:0.5-2:0.5-2:1。
9.权利要求5所述的液态复合微生物酵素，和/或，权利要求6-8中任意一项所述的液态生物制剂在防治药用植物真菌性和细菌性土传病害中的应用；
其中，所述药用植物真菌性土传病害选自三七根腐病、珠子参根腐病和雪上一枝蒿根腐病中的至少一种；
所述药用植物细菌性土传病害选自重楼软腐病和/或贝母软腐病。
10.一种防治药用植物真菌性和细菌性土传病害的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5所述的液态复合微生物酵素，和/或，权利要求6-8中任意一项所述的液态生物制剂施用于种植药用植物的土壤中；
其中，所述药用植物真菌性土传病害选自三七根腐病、珠子参根腐病和雪上一枝蒿根腐病中的至少一种；
所述药用植物细菌性土传病害选自重楼软腐病和/或贝母软腐病。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述液态复合微生物酵素的施用量为200-300mL/株；
和/或，所述液态生物制剂的施用量为200-300mL/株。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述液态复合微生物酵素或液态生物制剂的施用频率为每茬作物施用1-3次。
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