CN108531425A - 恶臭假单胞菌及其在防治花生根部病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)以及利用该微生物防治花生病害的应用技术。该菌株的其保藏编号为CGMCC No.12359，该菌株能够分泌具有高效灭菌活性的物质，能够用于防治花生冠腐病、白绢病和根腐病，优选的使用形式为将恶臭假单胞菌进行发酵获得发酵液，将发酵液稀释后使用。本发明的有益效果：所筛选得到的恶臭假单胞菌灭菌活性高而稳定，对花生根部的冠腐病、白绢病和根腐病的病原菌有明显的拮抗作用，而且，能够有效提高花生产量，成本低，操作简单，起效快，作用时间长，对环境不构成危害。

Description

恶臭假单胞菌及其在防治花生根部病害中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种恶臭假单胞杆菌及其在防治花生根部病害中的应用。

背景技术

花生冠腐病是花生全生育期均可发生的一种土传真菌型病害，病原为Aspergillus niger V.Tiegh，属半知菌亚门，丝孢目曲霉菌属，黑曲霉菌真菌。该病主要发生在苗期或生长前期。在花生苗期，病菌先侵染残存的子叶，进而侵染花生的茎基部。病部初生黄褐色凹陷的病斑，病斑边缘褐色，以后病部迅速扩大，皮层纵裂，组织干腐，最后仅剩下破碎的纤维组织。在潮湿的情况下，病部很快长出黑色霉层，即病菌的分生孢于梗和分生孢子。侵染果仁，能使之腐烂而不能发芽，在受害部位表面长出一层黑霉。在种仁发芽后，病菌可以侵染子叶，子叶未出土就变黑腐烂，胚轴受侵染呈水浸状，浅褐色，有黑色霉层。花生生长期感病，常造成茎基部腐烂，病株萎蔫枯死。

花生白绢病是花生上的重要病害，病原为Sclerotium rolfsii Sacc.，属半知菌亚门，无孢菌目，齐整小核菌属真菌。该病多在成株期发生，高温高湿的7～9月份是发病盛期，主要危害茎基部、果柄、果荚及根。受害病组织初期呈暗褐色软腐，不久即长出白色绢丝状的菌丝，覆盖受病部位。环境条件适宜时，菌丝迅速向外蔓延，花生近地面中下部的茎杆以及病株周围的土壤表面，都可长出一层白色绢丝状的菌丝层；后期在病部菌丝层中形成很多菌核；随着受害病组织的腐烂，植株皮层脱落，仅剩下纤维组织，很易折断。荚果感病后病部变浅褐色至暗褐色，果仁感病后变皱缩腐烂，病部覆盖灰褐色菌丝层，后期还能形成菌核；病菌在种壳里面和种仁表面生长的时候还能产生草酸，以致在种皮上形成条纹、片状或圆形的蓝黑色彩纹。

花生根腐病在花生各生育期均可发生，病原为半知菌亚门镰孢菌属真菌。出苗前染病可引起烂种、烂芽；在苗期受害可引起苗枯；在成株期受害可引起根腐、茎基腐和荚腐，病株地上部表现矮小、生长不良、叶片由下而上渐变黄后干枯，主根变褐、皱缩、干腐，侧根脱落，或侧根少而短，拔起时主根像老鼠尾巴一样，只留残存的根组织，俗称之“老鼠尾巴”。

当前对花生病虫害的防治主要以植物抗性品种和化学防治为主，但有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如残毒、环境污染，对人体和生态造成了很大威胁，不利于花生种植产业的可持续发展。因此，寻找一种经济、安全、有效的防治措施迫在眉睫。生物防治措施是利用有益微生物杀灭或者降低病原生物的数量以控制植物病害发生、发展的一类措施。这些有益生物亦称拮抗微生物或生防菌。目前有关于花生生防菌的研究，但是，针对上述三种花生病原菌的生防菌剂在应用过程中存在防效不稳定、起效慢、作用时间长、防治作用单一的问题，使得微生物菌剂的应用受到阻碍。因此，还需要寻找有效的防治花生冠腐病、白绢病和根腐病的菌种。

发明内容

为了克服化学方法防治花生冠腐病、白绢病和根腐病中存在的农药残留、环境污染等问题，本发明提供一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)以及利用该微生物防治花生病害的应用技术。该技术不但能够有效防治花生冠腐病、白绢病和根腐病，而且促进花生的生长及产量提高，操作简单、无污染、对环境不构成危害。

本发明人从自然土壤中得到一株细菌，经生化鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)LX16。其生化鉴定结果见表1，该菌株构成本发明的第一方面。

由于该菌株能够分泌具有高效灭菌活性的物质，能够用于防治花生冠腐病、白绢病和根腐病，这构成本发明的第二方面。其中优选的是，在使用时采取灌根形式，即将恶臭假单胞菌进行发酵获得发酵液，将发酵液稀释后使用。

同时，本发明的第三方面是将恶臭假单胞菌用于提高花生产量。其中优选的是，将恶臭假单胞菌LX16菌液稀释后灌根。

本发明的有益效果：所筛选得到的恶臭假单胞菌灭菌活性高而稳定，对花生根部的冠腐病、白绢病和根腐病的病原菌有明显的拮抗作用，而且，能够有效提高花生产量，成本低，操作简单，起效快，作用时间长，对环境不构成危害。

附图说明

图1为菌株LX16的菌落形态图；

图2为菌株LX16的16s rDNA的PCR产物扩增结果图；

图3为菌株LX16与其在GenBank数据库中相关属种构建的以16S rDNA序列为基础的系统发育树。

生物材料样品保藏信息：

本发明的菌种的保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为：CGMCC No.12359。分类命名为：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

以下实施例用的材料如下：

分离培养基：NA培养基：牛肉浸膏(Beef extract)3g，蛋白胨(Peptone)5g，葡萄糖(Dextrose)10g，琼脂粉(Agar)15g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。倒平板时加入利福平至终浓度为100ug/mL。

扩繁培养基：LB液体培养基，成分：胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，氯化钠(NaCl)10g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

真菌培养基：PDA培养基，成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

实验真菌来源：山东省花生研究所保存花生冠腐病、白绢病菌和花生根腐病菌。

实施例1菌株的分离、培养和鉴定

1、菌株的筛选和分离

从山东省花生研究所莱西实验田根系重病区未发病花生根际采集土壤。称取5g根际土壤放入45ml无菌水的三角瓶中，用玻璃棒搅拌使其充分悬浮，过滤去除沉淀，即成稀释10倍的菌悬液。把稀释后的菌悬液在28℃恒温箱内孵育2～3天，然后用灭菌水将菌悬液分别稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个梯度的菌悬液。分别取这些菌悬液100μL涂布于含有利福平(100μg/mL)的LB培养基上，涂板后用封口膜密闭后，于28℃的恒温箱倒置培养。一天后观察菌落生长情况，观察菌落大小、色泽、表面光滑度及边缘的形状等，并及时记录。接种环挑取出现抑菌圈的单菌落在NA培养基上继续纯化培养，纯化后的菌种平板置于4℃保存。

2、菌落的形态观察及菌株的生理生化鉴定

生防细菌菌株LX16在LB平板上生长，淡黄色，边缘整齐，扁平突起，湿润光滑，粘稠(图1)。

革兰氏染色、V-P测定、接触酶试验、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、甲基红试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定。

LX16菌株的生理生化鉴定结果见表1，结果显示LX16菌体表现为革兰氏染色阴性，专性需氧型，能以柠檬酸盐作为碳素的营养来源，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，具有过氧化氢酶活力，不能分解明胶、淀粉等大分子物质，菌株LX16与恶臭假单胞菌的生理生化特性基本一致，初步确定该菌株为P.Putida。

表1 活性菌株LX16的生理生化特征

注：“+”表示反应结果为阳性；“－”表示反应结果为阴性。

Reference:“+”present positive result；“-”present negative result.

3、细菌的16S rRNA分子学鉴定

菌株DNA提取

选取对真菌具有拮抗活性的细菌菌株，挑取10个相同的菌落做重复，进行基因组DNA的提取，其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit试剂盒说明书进行，并略加修改，步骤如下：

(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清；

(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮；

(3)加入4μLRNAase(100mg/mL)溶液，震荡15s，室温放置5min；

(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

(5)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(7)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中放入500μL缓冲液GD(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

(9)向吸附柱CB3中放入700μL漂洗液PW(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

(10)向吸附柱CB3中放入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(12)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

PCR与序列测定

(1)提取的DNA参照TaKaRa公司的16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增，其中正向引物为：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ IDNo.1)，反向引物为：3’-CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’(SEQ ID No.2)。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共30个循环。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后置于3UVTMTransilluminator(UVP,USA)下进行观察。通过电泳检测发现LX16菌株16s rDNA片段大小约为1500bp，片段大小与试剂盒预期设计相符，扩增结果见图2。

(2)根据预先设计的引物与预期扩增片段大小，结合Marker，目的片段在紫外灯下切割下来，用回收试剂盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit进行DNA的回收。16s rDNA序列测定由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测定序列结果表明LX16菌株的16srDNA片段共有1456nt碱基对组成，序列表信息见SEQ ID No.3。通过BLAST程序将测定的序列与GenBank(NCBI，网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16s rDNA序列进行确定。结果显示该活性菌株的16s rDNA序列GenBank基因库中假单胞菌属的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的16s rDNA序列高度同源，同源率达99％。构建发育树和同源性分析结果显示(图3)，菌株LX16与假单胞菌属的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)单独构成一个分支，进化上的距离最近，反映出它们之间亲缘关系最近，运用DANMAN软件分析得到二者同源性为99％。结合传统的生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株LX16为恶臭假单胞菌。

实施例2菌株抑制真菌能力的测定

在无菌操作台中将花生冠腐病、白绢病菌和花生根腐病菌用镊子取约0.5cm*0.5cm的正方形小块接种至PDA培养基中，于28℃温室中倒置培养2-3天。

挑取对真菌抑制效果最好的单菌落LX16进行真菌对峙实验。待真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌1-2cm处接种细菌，继续放置28摄氏度温室培养2-3天，观察真菌生长状况。

抑菌率＝[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100％

实验结果：LX16对花生冠腐病菌的对峙试验共进行3次，见表2，抑制作用明显，最高抑制率为65.06％，最低为60.26％，平均抑制率为62.68％。LX16对花生白绢病的对峙试验共进行3次，见表3，最高抑制率为58.97％，最低为57.19％，平均抑制率为58.00％。LX16对花生根腐病的3次对峙试验，见表4，最高抑制率为65.08％，最低为63.88％，平均抑制率为64.66％。由此表明，LX16对花生病原菌有明显的拮抗作用，可以作为潜力生防菌株。

表2 LX16与花生冠腐病菌的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复)

表3 LX16与花生白绢病菌的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复)

表4 LX16与花生根腐病菌的对峙实验结果(三批实验，每次三个重复)

实施例3菌株室内盆栽防治花生病害及促生作用试验

将菌株活化后接入LB液体培养基，置于28度摇床中180r/min震荡培养3d。

将保存的花生冠腐病、白绢病和根腐病的病原菌的扩繁：将燕麦粒装入三角瓶中，蒸馏水浸泡6h后倒掉水分，121℃高压灭菌20min；将花生冠腐病菌、白绢病菌、根腐病菌分别接种到灭菌的燕麦粒中，置于28℃培养7d，每天摇动接种瓶2次，使所有燕麦粒均有病原菌，获得带菌燕麦粒。

病原菌接种：将花生(品种鲁花8号)种植于人工气候室的盆中，土壤：蛭石：营养土的质量比＝2：1：1。培养温度白天为28℃，夜间25℃，12h光照/12h黑暗，花生单粒种植，每盆3粒。每种病原菌带菌麦粒10粒利用撒表土法接种于花生周边，随后盖上一层薄土并浇水。

LX16接种：分别在播种期、播种后10d利用恶臭假单胞菌发酵液灌根，每个处理10盆，每盆3株，重复3次。每盆每次浇稀释100倍发酵液100m L。设置50％多菌灵800倍液和清水两个对照。观察发病情况，种植75天后调查冠腐病、白绢病和根腐病的发病情况。花生每天浇水1次。

冠腐病分级标准：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状,整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的三分之二以下表现系统症状；4级：整株的三分之二以上表现系统症状，死亡植株按4级计算。

白绢病分级标准：0级：植株无症状；1级：病斑仅在茎基部产生；2级：茎基部产生缢缩症状，表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)的染病部位占整株的三分之一以下；3级：表现系统症状的染病部位占整株的三分之二以下；4级：表现系统症状的染病部位占整株的三分之二以上。

根腐病分级标准：0级:茎基和主须根上均无病斑；1级:茎基和主根上有少量病斑；3级:茎基和主根上病斑较多,病斑面积占茎基和根总面积的1/4～1/2；5级:茎基和主根上病斑多且大,病斑面积占茎基和根总面积的1/2～3/4；7级:茎基和主根上病斑连片,形成绕茎现象,但根系并未死亡；9级:根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。

病株率＝发病株数/总株数×100％

病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

LX16对花生生长发育的影响：分别在播种期、播种后10d利用恶臭假单胞菌发酵液灌根，每个处理10盆，每盆3株。每盆每次浇稀释100倍发酵液100m L。设置清水为对照。花生每天浇水1次。花生收获时，调查LX16对花生生长发育的影响。

盆栽试验结果：用生防菌LX16的发酵液处理花生菌株，LX16对室内盆栽花生冠腐病的防治效果为63.5％，见表5；LX16对室内盆栽花生白绢病的防治效果为51.0％，见表6；LX16对室内盆栽花生根腐病的防治效果为59.9％，见表7，均高于对照药剂多菌灵处理。这说明生防菌LX16对花生冠腐病、白绢病和根腐病均有明显防治效果。

表5 盆栽应用菌株LX16对花生冠腐病的防治效果

表6 盆栽应用菌株LX16对花生白绢病的防治效果

表7 盆栽应用菌株LX16对花生根腐病的防治效果

花生播种4个月后进行收获，倒出盆栽花生，测量花生主茎高、侧枝长、地径、分枝数；记录花生荚果数，用流水清洗掉荚果表面土壤颗粒后自然晾干并称重。用剪刀剪开花生植株地上、地下部分，放入干燥箱内于80℃下烘至恒重后称量其干重。实验结果见表8。

表8 LX16接种对花生生长的影响

花生播种后120天时测量花生主茎高、侧枝长、地径粗、分枝数，发现接种LX16花生平均主茎高、侧枝长、地径粗、分枝数均高于未接种花生。接菌花生单株荚果数、荚果重量、地上部干重、地下部干重也均大于未接种花生，这说明，接种LX16显著地促进了花生的生长及产量。

实施例4菌株LX16大田防治花生冠腐病、白绢病和根腐病试验

试验在山东省花生研究所莱西试验农场进行，为花生连作田，花生冠腐病、白绢病和根腐病等发生严重。采用随机区组设计，花生每小区70m²，4次重复。清水为空白对照，50％多菌灵800倍液为阳性对照。分别在播种期、播种后10d利用LX16发酵液灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约100m L。其他田间管理同正常生产，75天后调查发病情况。

大田试验结果表明，田间应用生防菌LX16的发酵液处理花生菌株，LX16对花生冠腐病的防治效果为62.0％，见表9；LX16对花生白绢病的防治效果为52.1％，见表10；LX16对花生根腐病的防治效果为46.8％，见表11。这说明生防菌LX16对花生冠腐病、白绢病和根腐病均有明显防治效果，且对冠腐病、根腐病防治效果优于多菌灵处理。

综上，用生防菌LX16的发酵液处理花生菌株，室内盆栽和大田试验均表明其对冠腐病、白绢病和根腐病均有明显防治效果。

表9 田间应用菌株LX16对花生冠腐病的防治效果

表10 田间应用菌株LX16对花生白绢病的防治效果

表11 田间应用菌株LX16对花生根腐病的防治效果

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 恶臭假单胞菌及其在防治花生根部病害中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcttacctt gttacgactt 20

<210> 3

<211> 1447

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌LX16(Pseudomonas putida)

<400> 3

ggtggacaga tcaccgtggt accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa 60

cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca 120

ttctgattcg cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180

ggactacgat cggttttatg ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctttgtaccg 240

accattgtag cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc 300

accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccattac gtgctggtaa 360

ctaaggacaa gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420

cgacagccat gcagcacctg tctcaatgtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt 480

tcattggatg tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540

caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc 600

aggcggtcaa cttaatgcgt tagctgcgcc actaagagct caaggctccc aacggctagt 660

tgacatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 720

gcacctcagt gtcagtatca gtccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata 780

tctacgcatt tcaccgctac acaggaaatt ccaccaccct ctaccatact ctagcttgcc 840

agttttggat gcagttccca ggttgagccc ggggatttca catccaactt aacaaaccac 900

ctacgcgcgc tttacgccca gtaattccga ttaacgcttg caccctctgt attaccgcgg 960

ctgctggcac agagttagcc gggtgctgct tattctgtcg gtaacgtcaa aattgcagag 1020

tattaatcta caacccttcc tcccaactta aagtgcttta caatccgaag accttcttca 1080

cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc aatattcccc actgctgcct 1140

cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact gatcatcctc tcagaccagt 1200

tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta gctaatccga cctaggctca 1260

tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg taggacgtat gcggtattag 1320

cgttcctttc gaaacgttgt cccccactac caggcagatt cctaggcatt actcacccgt 1380

ccgccgctga atccaggagc aagctccttt catccgctcg actgcatgtg tagctgccgc 1440

catgcag 1447

Claims (5)

1.一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LX16，其保藏编号为CGMCC No.12359。

2.一种根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌LX16在防治花生冠腐病、白绢病和根腐病中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将恶臭假单胞菌LX16菌液稀释后灌根。

4.一种根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌LX16在提高花生产量方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将恶臭假单胞菌LX16菌液稀释后灌根。