CN101385468A - 一种防治烟草黑胫病的地衣芽孢杆菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治烟草黑胫病的菌剂及其制备方法。该菌剂的生产菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)GP13，保藏号CGMCCNo.1699。所述菌株的固体和液体培养基配方如下：①试管斜面培养基配方为：牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17－20g，蒸馏水1000ml，pH6.8－7.2；②液体发酵培养基配方为：大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1％、消泡剂0.01％、pH7.0－7.2。试验结果表明，本发明用于防治烟草黑胫病有很好的应用前景。

Description

一种防治烟草黑胫病的地衣芽孢杆菌菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治烟草黑胫病的菌剂，以及该菌剂的制备方法。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，同时也是病害危害最严重的作物之一，从播种到收获，整个过程都可受到病原物的侵染。烟草黑胫病(tobacco blackshank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，特别是在温带、亚热带和热带发生较重，是我国烟草的主要病害。在我国，除个别较寒冷的地区，各主要产烟省均有不同程度的发生。其中安徽、河南、山东为历史上的重病区；云南、贵州、福建、广东、湖南、四川等烟区发生也相当普遍，且多与烟草青枯病混合发生，因此为害更为严重。近年来，新烟区也都有发生。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76,373公顷，产量损失2,869.26万公斤，产值损失超过1.23亿元人民币。

烟草黑胫病是一种典型的土传病害，目前国内在防治时主要以栽培抗病品种、轮作等农业措施和大剂量的化学农药进行防治。但是，可供区域栽培的抗性品种很有限，难以满足实际生产的需要。采用轮作在我国人多地少的情况下可行性越来越低。化学防治不仅成本高、防效差，而且污染环境，影响品质，并且一些病原真菌对生产上常用的甲霜灵表现出抗药性，使防治效果变差，防治难度加大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种有效、无毒、安全、无残留、使用简便的防治烟草黑胫病的菌剂。同时，本发明还提供该菌剂的制备方法及其在防治烟草黑胫病中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

A.本发明提供了一种防治烟草黑胫病的菌剂，该菌剂的生产菌株分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GP13，保藏号为CGMCCNo.1699；其菌株的试管斜面培养基配方为：牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2；其液体发酵培养基配方为：大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1％、消泡剂0.01％、pH7.0-7.2。

本发明的生产菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GP13，分离自云南华宁烟草根际土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化测定，该生防细菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的一个新菌株GP13。该菌株具有以下特征：①菌落不规则圆形，菌落边缘裂页状，菌落初期光滑，后期起皱，灰白色，蜡质，不透明，菌体在液体中不易分散，不产色素，产芽孢，芽孢不膨大，亚端生；在显微镜下观察：菌体直杆状，大小0.7～0.9×2.0～2.8μm。②该菌株定殖能力强、抑菌能力强、能促进烟草幼苗生长，具有杀菌、防病、促进生长的作用。该菌株可在烟草的根际和根内定殖。对该作物上的黑胫病病原菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)有显著抑制作用，抑菌圈直径平均为12.0-25.0mm。③具有以下生理生化特征：可厌氧生长，能在50℃、pH5.7、7％NaCl下生长；接触酶阳性，甲基红试验阳性，VP试验阳性；水解淀粉，液化明胶，分解酪素，硝酸盐还原为亚硝酸盐；利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖均能产酸，不能利用甘露醇产酸；利用柠檬酸盐、丙酸盐、甘油。

本发明生防菌株地衣芽孢杆菌(Bacillusl licheniformis)GP13的培养方法：

1.试管种培养

试管斜面培养基配方为：牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2。

将Bacillusl licheniformis GP 13移到试管斜面培养基上，在30℃±1℃恒温培养1～2天，获得试管种。

2.摇瓶液体发酵培养

液体发酵培养基配方为：大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1％、消泡剂0.01％、pH7.0-7.2。

将每支试管斜面加无菌水5-10ml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌悬液，以0.5％的体积比接入装培养液量为30％～50％(装培养液的容积与容器的容积比)的三角瓶中，于30℃±1℃恒温、150～200转/分钟转速振荡培养12小时，可转接至发酵罐中进行发酵生产。

3.发酵罐液体发酵条件

罐温：发酵罐的罐温均控制在28-32℃，通过插入培养基的温度探头测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。

罐压：发酵罐的罐压控制在0.5公斤/平方厘米，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。

搅拌：发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。

抽样检查和培养条件调节：每2小时自取样管取样1次，测定pH，涂片、结晶紫染色、镜检，观察菌体形态、菌体是否产芽孢等，判断有无杂菌的污染，待镜检菌体芽孢数占整个菌体的5％以上时，减少通风量和降低培养温度至25℃左右，其它条件不变，继续培养和抽样检查，待镜检菌体芽孢数占整个菌体的85％以上时，停止培养，镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。

培养周期：发酵罐的培养周期约为24-36小时。

B.本发明提供了所述防治烟草黑胫病的菌剂的制备方法，根据实际需要，可将其分别制成液体发酵菌剂或者固体菌剂。

1.制备液体发酵菌剂的方法

发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿CFU/ml以上时，加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％～10％的甲霜灵锰锌(58％的甲霜灵与代森锰锌混剂)，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，装入塑料旋盖瓶中。

该液体发酵菌剂保质期1年，施用时需要充分搅匀，可结合装填育苗基质、追肥、中耕等农事操作同时进行。

2.制备固体菌剂的方法

发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿CFU/ml以上时，加入填充剂、板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂。具体过程如下：①加入填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入1:1的硅藻土与轻质碳酸钙作为填充剂，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌30分钟。②填充剂硅藻土与轻质碳酸钙的加入量(公斤)＝〖发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率〗/成品菌数-发酵液中的残存物(公斤)。③板框过滤：用2公斤/平方厘米压力将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力应随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升；④打浆：将滤饼卸入打浆罐，按加入填充剂量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。⑤混匀：将打浆后的含菌硅藻土与轻质碳酸钙粉碎，阴干，加5-10％的甲霜灵锰锌(58％的甲霜灵与代森锰锌混剂)作为增效剂，再加填充剂按5倍体积稀释，搅拌混匀。⑥干燥：在温度60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量5％～8％。⑥粉碎：粉碎时出料温度不能超过60℃，以防止菌体失活。成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量200亿/克，其余各项指标均符合标准。⑦按100g/袋装入塑或铝塑封袋中。其包装应经过严格的检验，符合可湿性粉剂农药的包装标准。

该固态菌剂保质期2年，施用时需要充分搅匀，可结合装填育苗基质、追肥、中耕等农事操作同时进行。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.本发明通过地衣芽孢杆菌(Bacillusl licheniformis)GP13菌株的试管培养、摇床扩大培养、发酵罐发酵培养，制备为菌剂，并将其成功地应用用于防治烟草黑胫病，测定表明其对烟草黑胫病的防治具有显著效果。

2.本发明提供的菌剂有效、无毒、安全、无残留、使用简便。

3.随着人类对生存环境的日益重视，要求减少化学农药使用量的呼声日益高涨，对烟草安全的意识也逐步加强。本发明对降低化学农药的使用量、减少环境污染和农药危害，克服病原抗药性，提高烟叶品质，增强烟草农田生态系统稳定性，保障烟草产业的可持续发展，使农民增收具有重要的现实意义和广阔的应用前景，将会在未来的竞争中占有有利的地位。

保藏生物材料的说明

本发明采用的细菌菌株，已于2006年4月24日在位于中国北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GP13，保藏登记入册编号为CGMCC No.1699。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们并不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

——液体发酵菌剂制备方法1

(1)菌种制备

将Bacillusl licheniformis GP13移到试管斜面培养基(牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2)上，在30℃恒温培养1-2天，获得试管种。

(2)液体发酵

将每支试管斜面加无菌水10ml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌悬液，以0.5％的体积比接入已灭菌冷却至30℃、装有200ml培养液(大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1％、消泡剂0.01％、pH7.0-7.2)的500ml三角瓶中，于30℃恒温150-200转/分钟转速振荡培养36小时。要求发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，含菌量达150亿CFU/ml以上。

(3)制剂化

加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％的甲霜灵锰锌(58％的甲霜灵与代森锰锌混剂)，高速万能粉碎机搅拌混匀10分钟，装入250ml塑料旋盖瓶中。即得本发明的液体菌剂。

实施例2

——液体发酵菌剂制备方法2

(1)菌种制备

将Bacillusl licheniformis GP13移到容量为150ml的茄形瓶斜面培养基(牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2)上，在30℃恒温培养1-2天，获得斜面菌种。

(2)液体发酵

将每只茄形瓶斜面加无菌水100ml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌悬液，以0.5％的体积比接入已灭菌冷却至30℃的液体培养液(大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml，pH 7.0-7.2)的发酵罐中，按本发明所述的液体发酵条件，于30℃恒温200转/分钟，发酵培养36小时。要求发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，含菌量达150亿CFU/ml以上。

(3)制剂化

加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％的甲霜灵锰锌(58％的甲霜灵与代森锰锌混剂)，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，装入250ml塑料旋盖瓶中。即得本发明的液体菌剂。

实施例3

——固体菌剂制备方法1

将液体发酵菌剂制备方法1获得的液体菌剂，按液体50％加1:1的硅藻土与轻质碳酸钙作为填充剂，7号滤布真空过滤，通风阴干，高速万能粉碎机粉碎，按100g/袋装入塑或铝塑封袋中。其包装应经过严格的检验，符合可湿性粉剂农药的包装标准。

成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量200亿/克，其余各项指标均符合标准。

实施例4

——固体菌剂制备方法2

发酵车间发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿CFU/ml以上时，加入填充剂、板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂。具体过程如下：

加入填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入1:1的硅藻土与轻质碳酸钙作为填充剂，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌30分钟。

填充剂硅藻土与轻质碳酸钙的加入量(公斤)＝〖发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率〗/成品菌数-发酵液中的残存物(公斤)。

板框过滤：用2公斤/平方厘米压力将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力应随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升。

打浆：将滤饼卸入打浆罐，按加入填充剂量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。

混匀：将打浆后的含菌硅藻土与轻质碳酸钙粉碎，阴干，加5％的甲霜灵锰锌(58％的甲霜灵与代森锰锌混剂)作为增效剂，再按5倍体积稀释，搅拌混匀。

干燥：在温度60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量6％。

粉碎：粉碎时出料温度不能超过60℃，以防止菌体失活。

成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量200亿/克，其余各项指标均符合标准。

按100g/袋装入塑或铝塑封袋中。其包装应经过严格的检验，符合可湿性粉剂农药的包装标准。

应用实施例1

不同施用时期防治烟草黑胫病的效果。

a.试验药剂

本发明固态菌剂，甲霜灵锰锌；试验品种为红花大金元；试验地点分别于宜良九乡德马村、孟自雨过铺江水地村等地进行试点，每点面积约1.5亩。

b.试验方法

试验处理设置：分别在假植时(如采用漂浮育苗，则与基质混匀)、移栽浇定根水时、移栽后10天，500倍稀释成悬浮液，假植后湿润营养土或灌根培土，采用甲霜灵锰锌作药剂对照、灌清水作空白对照，共5个处理。各处理列于表1。各处理形成的小区随机排列，3次重复，共15个小区，每小区植烟50-80株。株行距设置、施肥、管理与当地烟草生产推广要求相同(除不施用任何土壤杀菌剂外，追肥要浇施)。

表1.不同施用时期的试验处理设置

注：对照中，每次施用的水量同生防菌菌剂稀释成的浇水量相同，各处理各时期除施药外，需按农事操作正常浇水、追肥(浇施)。

c.病情调查

生防菌菌剂施用完毕，即中耕培土、追肥后，进行一次病情基数调查，以后20天、40天、60天调查病情。病害的严重度按烟草病害调查的行业标准YC/T39-1996进行，计算病情指数以及相对防效。

d.结果与分析

不同施用时期防治效果见表2，从表2可看出本发明菌剂对烟草黑胫病的防治效果在40.1％～90.5％，三个时期以成活后施用，防治效果较好，移栽期效果稍差，假植期防效相对较差。这可能与育苗方式有关，由于两试点均采用漂浮育苗方式直播成苗，对幼苗生长的基质消毒较好，又无假植时对幼苗根系造成的伤害，因此苗床期烟株可免受烟草黑胫病菌的侵染。烟草黑胫病菌的侵染主要发生在大田本田内，其侵染源来自大田带菌土壤，由于烟苗移栽成活后进入伸根期，此时的根系生长较旺盛，自然造成的根伤害较多，又加之云南天气往往是雨季，这个阶段是烟株较感病的时期，因此菌剂此时施用后就能较好地发挥其拮抗作用，达到较好的防治效果。与对照药剂甲霜灵锰锌相比，生防菌防效稍差。

表2.不同施用时期对烟草黑胫病防治效果(病情基数均为0)

应用实施例2

不同施用浓度防治烟草黑胫病的效果

a.材料与方法

试验药剂为本发明固态菌剂，甲霜灵锰锌；试验品种为红花大金元；试验地点分别于宜良九乡德马村、孟自雨过铺江水地村等地进行试点，每点面积约1.5亩。

b.试验方法

在移栽浇定根水时，分别按500、1000、2000倍的用量稀释成悬浮液，灌根，采用500倍甲霜灵锰锌作药剂对照、灌清水作空白对照，共5个处理(编号分别为I、II、III、IV、V)，每处理每烟株灌注500ml(1市斤)。各处理形成的小区随机排列，3次重复，每小区植烟50-80株。株行距设置、施肥、管理与当地烟草生产推广要求相同(除不施用任何土壤杀细菌剂外，追肥要浇施)。

c.病情调查

菌剂施用完毕，烟株成活后，进行一次病情基数调查，以后20天、40天、60天调查病情。病害的严重度按烟草病害调查的行业标准YC/T39-1996进行，计算病情指数以及防效。

d.结果与分析

表3 不同施用浓度对烟草黑胫病的防治效果(病情基数均为0)

从表3的结果来看，随着浓度的提高，其防效有所提高，其中500倍菌剂的防效与对照药剂相当，防效42.6％～94.5％，宜良点除了与其它点在移栽时施用外，还在移栽成活后10天、20天各加施一次，其防效普遍提高。因此，本发明固态菌剂以500倍稀释施用对黑胫病的防治效果较好，如病害严重于伸根期加施，效果则更为明显。试验结果表明，本发明用于防治烟草黑胫病有很好的应用前景。

Claims (5)

1.一种防治烟草黑胫病的菌剂，其特征在于：该菌剂的生产菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GP13，保藏号CGMCCNo.1699。

2.根据权利要求1所述防治烟草黑胫病的菌剂，所述菌株的固体和液体培养基配方如下：

①试管斜面培养基配方为：牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2；

②液体发酵培养基配方为：大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1％、消泡剂0.01％、pH7.0-7.2。

3.一种防治烟草黑胫病的菌剂的制备方法，其特征在于采用以下步骤：发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿CFU/ml以上时，加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％～10％的甲霜灵锰锌，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，装入塑料旋盖瓶中，即得到所需的液体发酵菌剂。

4.一种防治烟草黑胫病的菌剂的制备方法，其特征在于采用以下步骤：发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿CFU/ml以上时，加入填充剂，经板框过滤、打浆、干燥、粉碎，即得到所需的可湿性粉剂。

5.权利要求1或2所述的菌剂在防治烟草黑胫病中的应用。