CN103614319A

CN103614319A - 阿氏芽孢杆菌及其在防治烟草黑胫病中的应用

Info

Publication number: CN103614319A
Application number: CN201310559441.0A
Authority: CN
Inventors: 李祖红; 曾嵘; 赖泳红; 张拯研; 高华锋; 林选知; 张瑞勤
Original assignee: QUJING CITY CO TOBACCO CO YUNNAN PROV; Yunnan University YNU
Current assignee: QUJING CITY CO TOBACCO CO YUNNAN PROV; Yunnan University YNU
Priority date: 2013-11-12
Filing date: 2013-11-12
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-11-12
Also published as: CN103614319B

Abstract

阿氏芽孢杆菌及其在防治烟草黑胫病中的应用，本发明所述的阿氏芽孢杆菌命名为阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6），已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2013475。该阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6）应用于防治烟草黑胫病。本发明的优点在于阿氏芽孢杆菌J-6具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点，对烟草黑胫病防治有显著效果。

Description

阿氏芽孢杆菌及其在防治烟草黑胫病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有较好防治烟草黑胫病能力的微生物菌株及其在防治烟草黑胫病中的应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，黑胫病是烟草生产中危害最严重的病害之一，每年因黑胫病造成的经济损失达1亿元以上。烟草黑胫病的致病菌为烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitca var.nicotianae Tucker)，主要表现为烟草矮化、萎焉、叶片发黄、根和茎基部坏死，平均发病率为5％～14％，重者损失达到75％，甚至绝收。目前对该病主要采用化学防治为主，抗病品种和栽培措施为辅的综合防治方法。由于长期使用甲霜灵和代森锰锌及其混剂等此类化学农药,使病原菌产生不同程度的抗药性，导致防治效果差，甚至难以控制病原菌危害。另外过多施用化学药剂，造成的农药残留对人畜危害和环境污染，对生态环境造成不可逆转的影响。

针对施用化学农药产生的抗药性给烟草黑胫病防治工作带来阿氏困难，同时也给农药的开发和生产带来严峻的挑战，近年来应用生物方法预防植物病害的研究越来越受到人们的关注，诱导植物产生抗性的方法就是一种比较成功的方法。诱导植物抗性是指利用物理、化学以及生物的方法，预先处理植物，诱导植物启动自身的防御机制，增强对后续病原物的抵抗力，是植物防御植食者的基本策略之一，它使得植物只在需要的时候、需要的部位产生必要数量的防御物质，从而节省能量，诱导植物产生的抗性在反应、效果、信息等方面具有很高的特异性。

微生物方法中利用芽孢杆菌诱导植物植株抗病性已有较多报道。芽孢杆菌普遍存在于环境中，芽孢杆菌中的许多菌株都有一些特别的功能，在工业、农业及医学上均有广泛的应用。近年来农业上芽孢杆菌作为生防菌来减轻有害动物、植物的危害程度成为研究关注热点、重点之一，如国内外关于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有抑制植物病害的功能已有较多的研究报道，以及应用在一些生物肥和农药上。但阿氏芽孢杆菌抑制植物病害的研究较少，利用阿氏芽孢杆菌诱导烟叶产生黑胫病的抗病性或抑制烟叶黑胫病鲜见报道。

应用微生物方法，诱导植物抗性具有多抗、高抗和安全等优点，对烟草安全生产及可持续性发展具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的问题，提供一种可从灯盏花中分离到的内生芽孢杆菌—阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6）以及将其用于防治烟草黑胫病。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌命名为阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6），已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2013475。

本发明所述阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6）应用于防治烟草黑胫病。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌J-6菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16S rDNA序列由1533个碱基组成。用BLAST程序对J-6菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai(登录号EF114313.2)的16S rDNA序列同源性达到99％，鉴定其为阿氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai。构建了J-6菌株的系统发育进化树。

本发明的优点在于阿氏芽孢杆菌J-6具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点，对烟草黑胫病防治有显著效果。

附图说明

图1为本发明所述的阿氏芽孢杆菌J-6在LB培养基上培养特征（正面）。

图2为本发明所述的阿氏芽孢杆菌J-6菌体特征（扫描电镜12000倍）。

图3为本发明所述的阿氏芽孢杆菌J-6菌株的系统发育进化树。

图3中，分支节点上的数字表示经过1000次bootstrap分析所支持的结果。线段标尺0.005表示0.5%的序列差异的分支长度。

具体实施方式

本发明是采用从云南灯盏花上分离到的内生细菌——阿氏芽孢杆菌J-6作为发酵菌株，来进行烟草黑胫病防治效果测定。它是以LB液体培养基为原料，通过液态发酵方式，采用实验室和室外盆栽及大田试验相结合，评价菌株J-6诱导烟株产生烟草黑胫病的抗性作用。

本发明的阿氏芽孢杆菌命名为阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6），已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2013475。

1、阿氏芽孢杆菌J-6菌株的鉴定

阿氏芽孢杆菌菌株J-6的菌落形态特征：菌株J-6菌落突起，表面有皱褶，呈乳白色，直径0.32mm～1.91mm。如图2所示。

菌株J-6的显微形态特征：菌体形态为杆状，为无芽孢的革兰氏阳性菌，兼性厌氧。

菌株J-6生理生化特征：见表1。

表1阿氏芽孢杆菌菌株J-6生理生化特征

测定指标	阿氏芽孢杆菌菌株J-6
		革兰氏	+
过氧化氢	+
		明胶液化	+
吲哚	－
		V-P测定	+
M-R试验	－
		硝酸盐还原	+
D-葡萄糖产酸	+
		D-甘露醇产酸	-
氧化酶	+
		苯丙氨酸脱氨酶	－
卵磷脂酶	－
		柠檬酸盐利用	+
脲酶试验	+
		阿拉伯糖	+
葡萄糖	+
		葡萄糖酸盐	+
麦芽糖	+
		蔗糖	+
淀粉水解	+
		酪蛋白水解	+

表1中，“+”表示阳性反应，“－”阴性反应。

分子生物学特征：16SrDNA基因序列测定。

对阿氏芽孢杆菌菌株J-6进行DNA提取，对菌株的16SrDNA片段进行PCR并测序，在NCBI上进行比对，确定各菌株种类。

PCR体系具体如表2和表3：

表2PCR体系

总体积	50.0ul
		Template DNA	1.5ul
Forward primer（PA）	1.0ul
		Reverse primer（PB）	1.0ul
10×Easytaq Buffer	5.0ul
		dNTPs(2.5mM)	4.0ul
Easytaq DNA Polymerase	0.5ul
		ddH2O	37.0ul

表2中，Forward primer（PA）序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。Reverse primer（PB）序列为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。

表3PCR扩增条件

2、阿氏芽孢杆菌J-6菌株Meg4.0建树

对阿氏芽孢杆菌菌株J-6的16S rDNA序列图谱校正，提交GenBank，并在GenBank，EMBL，DDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，比较测试菌株与模式菌株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。菌株间的序列比较用Clustal.x软件完成。用Neighbor—Joining方法进行分子系统学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树，见图3。

3、发酵菌剂制备

取阿氏芽孢杆菌菌种，在无菌条件下（无菌室或超净工作台），用灭菌竹签挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体LB培养基试管（15×150mm）中，置培养箱内28℃活化培养2～3天。

取出活化2～3天的斜面菌种，在无菌条件下，以同样方式接入菌种到已灭菌的种子LB液体培养基中，在28℃，转速180rpm下摇床培养2～3天，即为阿氏芽孢杆菌J-6菌株发酵种子。如图1所示。

发酵采用250ml玻璃三角瓶，装入LB液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，取出冷却后放置28℃培养箱过夜，无杂菌污染即可确认灭菌彻底，可用于后续发酵培养。在无菌条件下，取阿氏芽孢杆菌J-6种子液，接种于装有100ml LB液体培养基的250ml玻璃三角瓶中，接种量为5～10%（v/w），置28℃通气培养2～3天。在发酵期间，注意发酵室温度变化，检查有无染菌现象。

发酵完毕，收集发酵液，转速10000rpm离心3min，弃上清，获得菌体，每克菌体含2.6×10¹³～10¹⁵个菌。取菌体与保藏液按1g：50ml配成菌剂。菌体保藏液为0.5%吐温80-生理盐水。将保存的的菌剂按1：100稀释，分别进行盆栽试验和大田试验。

4、实施方法

（1）菌株J-6拮抗试验

先制作燕麦培养基（燕麦片30克/L，琼脂14g/L,pH自然）平皿，再将烟草黑胫病病原菌接种在燕麦培养基平板的中央，用竹签将阿氏芽孢杆菌菌株J-6接种在距离平板中心1.5cm位置，重复5次，6～7天观察记录抑菌圈环径。

（2）盆栽试验

盆栽实验按随机区组设计，三个处理：A、生防菌剂J-6；B、稀释700倍的58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂（国营温州农药厂）；C、空白对照。将保藏的菌剂按1：100比列稀释，选择长势一致的烟苗放在配制好的菌剂中浸泡30min，再移栽到花盆中，移栽10天后进行病原菌接种。病原菌的接种方法：将病原菌分生孢子稀释浓度为1x107CFU/mL，用竹签在烟株的茎基部刺破，然后用棉花沾上病原菌分生孢子稀释液，放到伤口处保留24h。统计各处理的黑胫病严重度，并分析计算防效。

（3）大田实验

田间试验按随机区组设计，三个处理：A、生防菌剂J-6；B、4%甲霜灵处理；C、空白对照。将保藏的菌剂按1：100比例稀释配制，选择长势一致的烟苗放在稀释好的菌剂中浸泡30min，再移栽到花盆中，移栽10天后进行病原菌接种。病原菌的接种方法：将病原菌分生孢子稀释浓度为1x107CFU/mL，用竹签在烟株的茎基部刺破，然后用棉花沾上病原菌分生孢子稀释液，放到伤口处保留24h。统计各处理的黑胫病严重度，并分析计算防效。

5.试验结果

（1）阿氏芽孢杆菌J-6拮抗病原菌试验：结果表明阿氏芽孢杆菌菌株J-6对烟草黑胫病几乎没有显示出平板抑制效果，抑制率仅为1.3%，见表4。

（2）盆栽试验：以阿氏芽孢杆菌J-6制备的发酵液施用在盆栽烟株上，使用过阿氏芽孢杆菌J-6菌液处理的烟株的病情指数较对照减少74.3%，防治率提高47.2%，见表5。诱导烟株产生拮抗黑胫病效果明显，对病原菌起到了很好的控制作用。

（3）田间试验表明：阿氏芽孢杆菌J-6对大田烟叶诱导抗病效果较好，阿氏芽孢杆菌J-6菌液处理的烟株病情指数较对照空白照减少54.9%，防治率提高68.8%，比甲霜灵锰锌可湿性粉剂处理的烟株病情指数减少18.7%，防治率提高13.7%，诱导效果为70.3%，见表6。阿氏芽孢杆菌J-6菌剂有较好的诱导烟株拮抗黑胫病作用，起到了防治烟叶黑胫病的作用。

表4平板对峙法评价阿氏芽孢杆菌J-6菌剂抑制烟草黑胫病效果

处理	抑菌率%
		阿氏芽孢杆菌J-6菌剂	0.3
58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂（稀释700倍）	88.9
		空白对照	0

表5烟叶盆栽试验评价阿氏芽孢杆菌J-6菌剂防治烟草黑胫病效果

表6大田试验评价阿氏芽孢杆菌J-6菌剂防治黑胫病效果

处理	病情指数%	防治效果%	诱导效果%
				阿氏芽孢杆菌J-6菌剂	20.9	68.8	70.3%
4%甲霜灵	39.2	55.1	—
				空白对照	75.8	—	—

试验证明，本发明的阿氏芽孢杆菌诱导烟株产生烟株产生拮抗黑胫病效果明显，生防效果较好,且有利于保护环境，是重要的烟草黑胫病生防应用微生物。可应用于防治烟草黑胫病。

阿氏芽孢杆菌菌株J-6的核苷酸碱基序列：

ttagagtttgaatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagctagccgcctaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcgtg。

Claims

1.阿氏芽孢杆菌，其特征在于，本发明所述的阿氏芽孢杆菌命名为阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6），已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2013475。

2.权利要求1所述阿氏芽孢杆菌在防治烟草黑胫病中的应用，其特征在于，阿氏芽孢杆菌J-6（Bacillus aryabhattai J-6）应用于防治烟草黑胫病。