CN111534472A - 阿耶波多氏芽孢杆菌wzz10及在2-四氢糠酸手性拆分中的应用 - Google Patents

阿耶波多氏芽孢杆菌wzz10及在2-四氢糠酸手性拆分中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10及在2‑四氢糠酸手性拆分中的应用：以阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)‑四氢糠酸为底物，以pH 7.0的磷酸盐缓冲液作为反应介质，在20～35℃，150‑200rpm条件下进行拆分制备(S)‑2‑四氢糠酸乙酯和(R)‑2‑四氢糠酸。本发明提供的产酶微生物菌株Bacillus aryabhattai WZZ10的立体选择性强，(S)‑2‑四氢糠酸乙酯ee值(光学纯度)≧96％，转化率58％，避免了化学生产中手性助剂的使用，能耗低，反应时间短，环境污染小，有工业化生产的潜力。

Description

阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10及在2-四氢糠酸手性拆分中的 应用
(一)技术领域
本发明涉及(R,S)-2-四氢糠酸乙酯的拆分，特别涉及阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10菌株及在立体拆分(R,S)-2-四氢糠酸乙酯获得光学纯(S)-2-四氢糠酸乙酯和(R)-2-四氢糠酸的应用。
(二)背景技术
2-四氢糠酸(2-Tetrahydrofuroic acid)，化学名为四氢呋喃-2-甲酸，是一种重要的化学中间体，广泛应用于医药、化工等领域。光学纯的2-四氢糠酸是不对称合成的重要原料，其中(R)-四氢呋喃-2-甲酸是合成培南类抗生素的手性中间体，(S)-四氢呋喃-2-甲酸是合成唑嗪类药物的手性中间体，其衍生物在包括利尿剂、阿夫唑嗪、夫洛培南、特拉唑嗪等药物合成中广泛应用。
工业化生产光学纯2-四氢糠酸的方法多使用酸碱成盐的方法。成盐的方法需要使用不同的手性助剂，如使用带有苯环的盐与外消旋的2-四氢糠酸在无机金属碱的水溶液中进行盐交换，再经过萃取得到光学纯度高的产物，ee值一般达97％以上，但使用试剂毒性大，环境污染较为严重。目前，工业生产光学纯2-四氢糠酸的常见手性助剂为麻黄碱，据报道，使用麻黄碱作为拆分试剂时，S型酸的收率为38.0％左右，但是该手性助剂有极大的毒性，且价格昂贵。也有使用苯乙胺为手性助剂，反应时间需15h以上，且需多次结晶，总收率44％，手性助剂回收率27％左右，但该手性助剂具有一定的神经毒性。
从1998年开始国外就将酶法拆分(动力学拆分)在四氢糠酸衍生物中应用，2003年，Yoshito Fujima等使用曲霉属蛋白酶(20％W/V)催化反应20h以上，可得到R型酸ee值为94.4％，再通过甲基乙基酮/甲醇(5:1)处理沉淀结晶，最终得ee值99％以上的R型酸，总收率22％。国内，谢开龙等在2018年公开了一种碱性蛋白酶拆分四氢呋喃-2-甲酸乙酯的方法，反应24h，在磷酸盐缓冲溶液的环境下经碱性蛋白酶的催化可得ee值达99％的乙酯，总收率接近30％。总体来说，目前酶法拆分最大的问题在于收率和高光学纯度不能同时满足,且反应时间较长。
本发明所述的微生物脂肪酶法反应避免了毒性较大的手性助剂的使用，而且对比已经公开的酶法拆分，具有短时高效的特点。
(三)发明内容
本发明目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一种廉价高效的产酶微生物，以(R,S)-2-四氢糠酸乙酯((R,S)-Ethyl-tetrahydro-2-furoate)为反应底物，立体选择性水解(R)-2-四氢糠酸乙酯生产(R)-2-四氢糠酸，并保留原外消旋底物中(S)-2-四氢糠酸乙酯，(S)-2-四氢糠酸乙酯亦可通过加醇酯化获得光学纯的(S)-2-四氢糠酸，反应式如图1所示。
本发明采用的技术方案是：
本实验提供一株新菌株——阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10(Bacillus aryabhattaiWZZ10)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20191099，保藏日期2019年12月25日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10在拆分外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯制备(R)-2-四氢糠酸和(S)-2-四氢糠酸乙酯中的应用，具体所述的应用为：以阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯为底物，以pH7.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在15-35℃，150-200rpm(优选20-30℃、150-180rpm)条件下进行拆分反应；反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-2-四氢糠酸乙酯和(R)-2-四氢糠酸。所述底物加入量以缓冲液体积计为1～50g/L(优选15～30g/L)；催化剂加入量，以湿菌体重量计为1～50g/L缓冲液(优选20～40g/L)，以干菌体重量计为1～20g/L缓冲液(优选10～20g/L)。
本发明所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10菌株接种至斜面培养基，在28℃培养1天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH为7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在28℃、180r/min条件下培养12-24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨25g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4 0.25g/L，橄榄油10mL/L，溶剂为水，pH 7.0，115℃灭菌30min；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度1-2％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在12000rpm离心3-10min，弃上清液，收集湿菌体；发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO41g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为去离子水，pH7.0，115℃灭菌30min；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-20℃条件下冷冻，然后通过冷冻干燥机内，在冷阱-80℃，真空度20Pa下冷冻干燥12h，得到干菌体。
本发明所述产物分离纯化方法：将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收催化剂，滤液用3M HCl调节pH为4，然后乙酸乙酯萃取，分液得到有机层和水层；将有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥后，减压浓缩至无液体流出，得淡黄色液体(S)-2-四氢糠酸乙酯；将水层用3M HCl调节pH为1-3，在6mmHg，90℃下减压蒸馏除水，获得无色液体(R)-2-四氢糠酸。(S)-2-四氢糠酸乙酯可以通过非对映体水解酶如Novozym 435重新水解为(S)-2-四氢糠酸进行工业化应用。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的产酶微生物菌株Bacillus aryabhattaiWZZ10的立体选择性强，(S)-2-四氢糠酸乙酯对映体过量值≧96％(图2)，转化率达到58％，(S)-2-四氢糠酸乙酯的收率约为32％，(R)-2-四氢糠酸的收率达40％以上，下游分离简单，产率较高，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
(四)附图说明
图1为脂肪酶手性拆分外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯的反应式。
图2为标样外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯底物气相色谱图。
图3为标样外消旋2-四氢糠酸产物衍生气相色谱图。
图4为实施例1WZZ10菌株催化外消旋底物(R,S)-2-四氢糠酸乙酯制备(R)-2-四氢糠酸乙酯和(S)-2-四氢糠酸乙酯的气相色谱图。
图5为实施例1WZZ10菌株催化外消旋底物(R,S)-2-四氢糠酸乙酯制备(R)-2-四氢糠酸和(S)-2-四氢糠酸的气相色谱图。
图6为实施例5WZZ10菌株催化外消旋底物(R,S)-2-四氢糠酸乙酯反应后减压浓缩所得的(S)-2-四氢糠酸乙酯气相色谱图。
图7为实施例5WZZ10菌株催化外消旋底物(R,S)-2-四氢糠酸乙酯反应后减压浓缩所得的(R)-2-四氢糠酸气相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1菌株WZZ10的分离纯化及鉴定
1、对映体选择性菌株的分离纯化
(1)富集：采集杭州各地重油污污染的土样富集培养。取1g土壤，加入含50mL无菌水和少量玻璃珠的摇瓶内，30℃、180rpm震荡培养5h。取1mL悬浮液，梯度稀释至10-6，取200μL涂布于LB固体培养基，30℃培养24h。
LB固体培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶于水中，调节pH为7.0，115℃灭菌30min。
(2)初筛(脂肪酶生产菌的筛选)：
挑选单菌落接种于罗丹明B显色平板，30℃培养72h。依据变色圈的先后、变色圈直径和菌落直径比值，挑选脂肪酶活性高且产酶周期短的菌株，将其接种于LB斜面培养基中培养，30℃培养24h，4℃冰箱保存，并分别编号1～400。
将保存的菌株接种于种子培养基中，30℃、180rpm摇床培养12h。以体积浓度2％的接种量转接到发酵培养基中，30℃、180rpm摇床培养24h；将发酵液分装至50mL离心管内，10000rpm离心10min，保留菌体沉淀，并置于-20℃冰箱内冰冻24h，放入真空冷冻干燥机内，在冷阱-80℃，真空度20Pa下冷冻干燥12h得到干菌粉，将干菌粉无菌分装，对应编号，以备复筛。
罗丹明B显色平板：将甲组分与乙组分以体积比10:1混合作为甲乙混合溶液。将质量浓度0.1％的罗丹明B溶液(过滤除菌)以1∶100体积比加入到甲乙混合液中混匀，作为显色指示剂倒平板。甲组分组成：
1.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L K2HPO4，5.0g/L KC1，0.25g/L MgSO4，0.1g/L FeSO4，5.0g/L蛋白胨，20g/L琼脂，加水溶解，自然pH，装入三角瓶中，115℃灭菌30min，冷却至60℃；乙组分组成：橄榄油和质量浓度2％的聚乙烯醇(PVA)溶液以体积比1:3的比例混合，用细胞破碎仪10000rpm乳化3min，间歇5min，再次乳化3min，转入三角瓶中，115℃灭菌30min，冷却至60℃。
种子培养基配方：蛋白胨20g/L，葡萄糖30g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，橄榄油10mL/L，加水溶解，调节pH 7.0；
发酵培养基配方：蛋白胨25g/L，葡萄糖15g/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO40.25g/L，KCl0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，(NH4)2SO4 2g/L，橄榄油10mL/L，加水溶解，调节pH7.0。
(3)复筛(四氢糠酸对映体选择性菌株的筛选)：
1)干菌粉筛选
A：反应条件
取无菌ep管，加入保存的干菌粉20mg、14mg外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯以及1mL的pH 7.0的磷酸盐缓冲液，震荡混匀，放入30℃、180rpm的摇床内，反应24h，获得含(S)-2-四氢糠酸乙酯和(R)-2-四氢糠酸的反应液。
B：检测方法
S-2-四氢糠酸乙酯的检测：向上述反应液中加入3M HCl调节pH至4，并加入2ml乙酸乙酯，充分震荡萃取，12000rpm离心3min；保留下层水相用作产物衍生；取上层有机相，并加入少量无水MgSO4除去痕量水，作为用品；取1000μL用品用气相色谱(GC)手性分离四氢糠酸乙酯，检测R-2-四氢糠酸乙酯和S-2-四氢糠酸乙酯的峰面积，根据公式(a)计算底物对映体过量值(ees)。
(R)-2-四氢糠酸的检测(产物衍生为底物)：保留的水相内继续用3倍体积的乙酸乙酯萃取除去水相中残留的底物四氢糠酸乙酯，12000rpm离心3min；弃有机相，保留下层水相；加入3M HCl将溶液pH调至2，再加入1mL乙酸乙酯萃取，12000rpm离心3min，取上层有机相800μL转入新ep管内，并向该有机相中加入1mL无水乙醇和80μL乙酰氯，将ep管放于金属震荡仪，800rpm、30℃反应30min；然后减压浓缩除掉乙醇，加入800μL饱和NaHCO3中和pH至7-8，震荡5min，待溶液中无大量气泡后加入800μL乙酸乙酯分层，取出上层有机相，加入少量无水MgSO4除去痕量水，取1000μL用气相色谱手性分离，检测R-四氢糠酸和S-四氢糠酸的峰面积，根据公式(b)计算产物对映体过量值(eep)，通过公式(c)计算转化率。
色谱柱：CP-Chirasil-Dex CB(25m，0.25mm，0.25μm，Agilent)；氦气流速：40mL/min；空气流速：400mL/min；进样器温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温：110℃；平衡时间：8min。
(S)-2-四氢糠酸乙酯标准品[或(S)-2-四氢糠酸]出峰时间4.412±0.003min，(R)-2-四氢糠酸乙酯标准品[或(R)-2-四氢糠酸]出峰时间4.487±0.003min，见图2、图3。
从400株菌株中挑选对外消旋四氢糠酸乙酯有对映体选择性，且底物对映体选择性ees和产物对映体选择性eep均较高的10株以备发酵再次筛选，检测结果见表1。
表1不同菌株对外消旋四氢糠酸乙酯对映体选择性
Figure BDA0002534011240000061
注：
Figure BDA0002534011240000062
Figure BDA0002534011240000063
Figure BDA0002534011240000064
公式(a)中[Ss]为反应后S-四氢糠酸乙酯的峰面积，[Rs]为反应后R-四氢糠酸乙酯的峰面积；
公式(b)中[Sp]为反应后S-四氢糠酸的峰面积，[Rp]为反应后R-四氢糠酸的峰面积；
公式(c)中C为(R)-四氢糠酸的转化率。
2)发酵活化再复筛
将选出的10株菌株的对应斜面，在无菌条件下，接种到50mL种子培养基，在30℃、180r/min培养24h；取1mL种子液接种于50mL的发酵培养基中，30℃、180r/min培养24h，获得发酵液(培养基同步骤(2))。将发酵液12000rpm离心3min，弃上清液，保留菌丝体。取0.05g湿菌体加入1mL的0.2mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，再加入14.4mg外消旋四氢糠酸作为底物，震荡摇匀，在30℃、180r/min下转化反应8-30h。通过上述检测方法(B)，测定发酵活化后10株菌株的ee％和转化率，见表2。
表2不同菌株对外消旋四氢糠酸乙酯对映体选择性
Figure BDA0002534011240000071
当对映体的反应速率差异非常大，则只有一种对映体发生转化，当转化率达到约50％时，反应会同时提供两种光学纯形式的对映体。对应表2中的十株菌株，较高的ee值的同时转化率接近50％的要求，优选164号为四氢糠酸对映体选择性菌株，此时(S)-2-四氢糠酸乙酯的ee值96.31％，(R)-2-四氢糠酸的ee值68.47％，转化率58.45％，对应的气相色谱图见图4、图5，并对164号菌株进行菌种鉴定。
2、菌种鉴定
生理生化特征：菌株164为革兰氏阳性菌，专性好氧。
表3梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应结果
Figure BDA0002534011240000072
Figure BDA0002534011240000081
经测序鉴定，菌株164的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：
AGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCG。
根据16S rRNA测序及菌种生理生化特性鉴定，该菌株164被鉴定为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，并命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)WZZ10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20191099，保藏日期2019年12月25日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例2：菌株WZZ10的应用
(1)WZZ10干菌粉的制备
将阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10菌株接种至斜面培养基，在28℃培养1天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH为7.0；
阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10的斜面接种至50mL种子培养基，在28℃、180r/min培养12h，获得种子液；
取1mL种子液接种于100mL的发酵培养基中，28℃、180r/min培养24h，获得发酵液。将发酵液12000rpm离心3min，弃上清液，取湿菌体在-20℃条件下冷冻，然后通过真空冷冻干燥机在冷阱-80℃，真空度20Pa下冷冻干燥12h，获得阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉。
种子培养基配方为：蛋白胨25g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，橄榄油10mL/L，加水溶解，调节pH 7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO41.0g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为去离子水，pH7.0，115℃灭菌30min。
(2)菌株WZZ10手性拆分外消旋四氢糠酸乙酯
取0.1g步骤(1)方法制备的阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉和144mg外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯到10mL pH7.0磷酸盐缓冲液，在28℃、搅拌转速180rpm条件下反应8h后，采用实施实例1中检测方法(B)检测，测得(S)-2-四氢糠酸乙酯的ee值93.61％，(R)-2-四氢糠酸的ee值73.70％，(R)-2-四氢糠酸转化率55.95％。
实施例3：
取1g实施例2方法制备的阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉和1.5g外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯到100mL pH7.0磷酸盐缓冲液，在28℃、搅拌转速180rpm条件下反应7.5h后，采用实施例1检测方法得(S)-2-四氢糠酸乙酯的ee值94.52％，(R)-2-四氢糠酸的ee值74.31％，(R)-2-四氢糠酸转化率56.18％。
实施例4：
取10g实施例2方法制备的阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉和20g外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯到1L、pH7.0磷酸盐缓冲液，在25℃、搅拌转速180rpm条件下反应7h。将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收菌体，滤液加入3M HCl水溶液，调节pH至4，乙酸乙酯进行萃取，分液得到有机层和水层；将有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥后，减压浓缩至无液体流出，得淡黄色液体(S)-2-四氢糠酸乙酯5.58g，ee值92.15％，收率27.90％，GC纯度99.1％(图6)；将水层用3M HCl调节pH为2，在6mmHg，90℃下减压蒸馏除水，获得无色液体(R)-2-四氢糠酸8.96g，ee值75.64％，收率44.80％，GC纯度99.3％(图7)。
测GC纯度的色谱柱及相关参数
色谱柱：DB-624(25m，0.2mm，1.12μm，Agilent)；氦气流速：40mL/min；空气流速：400mL/min；进样器温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温：四氢糠酸乙酯100℃，四氢糠酸150℃；平衡时间：24min。
(S)-2-四氢糠酸乙酯出峰时间10.182min，见图6；(R)-2-四氢糠酸出峰时间12.925min，见图7。
实施例5：
取100g实施例2方法制备的阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉和250g外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯到5L pH7.0磷酸盐缓冲液，在20℃、搅拌转速180rpm条件下反应10h。将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收菌体，滤液加入1L的乙酸乙酯进行萃取，分液得到有机层和水层；将有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥后，减压浓缩至无液体流出，得淡黄色液体(S)-2-四氢糠酸乙酯80.25g，ee值93.53％，收率32.10％，GC纯度(检测条件同实施例4)99.3％；将水层用3M HCl调节pH为2，在6mmHg，90℃下减压蒸馏除水，获得无色液体(R)-2-四氢糠酸101.48g，ee值74.28％，收率40.59％，GC纯度(检测条件同实施例4)99.2％。
实施例6：
取20g实施例2方法制备的阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10干菌粉、50g外消旋(R,S)-2-四氢糠酸乙酯和1L、pH7.0磷酸盐缓冲液加入到50L的发酵罐内，调节参数20℃、搅拌转速180rpm，反应12h。通过实施例4的方法分离纯化得(S)-2-四氢糠酸乙酯14.17g，ee值91.98％，收率28.35％，GC纯度(检测条件同实施例4)99.2％；(R)-2-四氢糠酸21.90g，ee值74.56％，收率43.80％，GC纯度(检测条件同实施例4)99.3％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10及在2-四氢糠酸手性拆分中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1372
<212> DNA
<213> 阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)
<400> 1
agaagcttgc ttctatgacg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct 60
gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat 120
gggagatgat tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc 180
tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc 240
ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300
ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg 360
taaaactctg ttgttaggga agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac 420
ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480
cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa 540
agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagaa 600
aagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga 660
aggcggcttt ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 720
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc 780
ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga 840
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa ctctagagat agagcgttcc 960
ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt tagttgggca 1080
ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcaagaccg 1200
cgaggtcaag ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct 1260
acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cg 1372

Claims (6)

1.阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10(Bacillus aryabhattai WZZ10)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20191099，保藏日期2019年12月25日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10在拆分外消旋(R，S)-2-四氢糠酸乙酯制备(R)-2-四氢糠酸和(S)-2-四氢糠酸乙酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R，S)-2-四氢糠酸乙酯为底物，以pH 7.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在15-35℃，150-200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-2-四氢糠酸乙酯和(R)-2-四氢糠酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物加入量以缓冲液体积计为1～50g/L；催化剂加入量以湿菌体重量计为1～50g/L缓冲液，以干菌体重量计为1～20g/L缓冲液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将阿耶波多氏芽孢杆菌WZZ10菌株接种至斜面培养基，在28℃培养1天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH为7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在28℃、180r/min条件下培养12-24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨25g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO41.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，橄榄油10mL/L，溶剂为水，pH 7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度1-2％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在12000rpm离心3-10min，弃上清液，收集湿菌体；发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO41g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-20℃条件下冷冻，然后放入真空冷冻干燥机内，在冷阱-80℃，真空度20Pa下冷冻干燥12h，获得干菌体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产物分离纯化方法：将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收催化剂，将滤液调节pH值至4，再加入乙酸乙酯进行萃取，分液得到有机层和水层；将有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥后，减压浓缩至无液体流出，得淡黄色液体(S)-2-四氢糠酸乙酯；将水层用3M HCl调节pH值至1-3，在6mmHg，90℃下减压蒸馏除水，获得无色液体(R)-2-四氢糠酸。
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