CN108004291B - 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法 - Google Patents

一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108004291B
CN108004291B CN201711396444.1A CN201711396444A CN108004291B CN 108004291 B CN108004291 B CN 108004291B CN 201711396444 A CN201711396444 A CN 201711396444A CN 108004291 B CN108004291 B CN 108004291B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
acid lactone
pantoic acid
producing microorganism
pantolactone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711396444.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108004291A (zh
Inventor
耿英龙
吴胜
胡柏剡
吴晓东
彭俊华
王钰
李伟峰
刘晓庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANDONG NHU VITAMIN Co.,Ltd.
SHANDONG XINHECHENG AMINO ACID Co.,Ltd.
Zhejiang NHU Co Ltd
Shandong Xinhecheng Fine Chemical Technology Co Ltd
Original Assignee
Shandong Nhu Vitamin Co ltd
Shandong Xinhecheng Amino Acid Co ltd
Zhejiang NHU Co Ltd
Shandong Xinhecheng Fine Chemical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Nhu Vitamin Co ltd, Shandong Xinhecheng Amino Acid Co ltd, Zhejiang NHU Co Ltd, Shandong Xinhecheng Fine Chemical Technology Co Ltd filed Critical Shandong Nhu Vitamin Co ltd
Priority to CN201711396444.1A priority Critical patent/CN108004291B/zh
Publication of CN108004291A publication Critical patent/CN108004291A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108004291B publication Critical patent/CN108004291B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/77—Fusarium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于水解D,L‑泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法。具体而言，用产酶微生物菌株水解D,L‑泛解酸内酯，再进行酸化，由此形成的转化液经高效液相色谱手性在线检测，快速筛选出对水解D,L‑泛解酸内酯有催化活力和立体选择性的菌株。通过该定向筛选方法，本发明发现轮枝镰孢菌菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552在水解D,L‑泛解酸内酯方面具有显著而独特的优势，在5～10h内对浓度为1～70％的D,L‑泛解酸内酯的水解转化率可达到35％以上，目标产物D‑泛解酸内酯的ee值大于98％。

Description

一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选 方法
技术领域
本发明属于生物催化研究领域，具体涉及一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物，及其在水解D,L-泛解酸内酯反应中的应用和筛选方法。
背景技术
D-泛解酸内酯是生物体内合成辅酶A的前体物质，也是工业上用来制备泛酸、泛醇等生化制品的重要手性中间体，后者在医药、食品、饲料和保健品领域有着广泛的应用。
利用产酶微生物(野生菌或工程菌)催化制备D-泛解酸内酯是目前主流的生产方法，具有环保、经济、产物光学纯度高等多种优点。综合文献和工业生产实践，利用酶法制备D-泛解酸内酯有以下几种技术路线：
1.利用微生物不对称还原手性酮基泛解酸内酯制备手性D-泛解酸内酯是一种理论计算最优的技术路线。多年来由日本的Shimizu S领导的研究组对此路线进行了持续的研究，并从平滑假丝酵母中筛选到相关的酮基还原酶，完成基因克隆和工程菌构建等工作，对重组酶进行了晶体学研究。但该路线存在酮基泛解酸内酯价格较为昂贵，酮基还原酶底物耐受浓度低等缺点，至今还无法实现工业化生产。
2.筛选立体专一性水解L-泛解酸内酯的产酶微生物，将D,L-泛解酸内酯中的L-构型彻底水解，从而分离获得未水解的D-泛解酸内酯(如JPA 47-19745)。该方法要求所需酶具有高度的立体选择性和非常高的催化活性，且转化率必须大于50％。目前报道的水解L-泛解酸内酯的产酶微生物普遍选择性不高，不能满足工业生产要求。
3.微生物选择性地水解D,L-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到高光学纯度的D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化重新转化为D-泛解酸内酯。本法中未反应的L-泛解酸内酯可以通过加碱消旋进行再利用，从而达到动态动力学拆分的效果，即将D,L-泛解酸内酯全部转化为D-泛解酸内酯。此法最早由日本的Fuji公司申请专利(US专利5275949，1994)，并在日本第一制药公司全球率先实现工业化生产。国内亿帆鑫富药业(原浙江鑫富生化股份有限公司)、新发药业有限公司和兄弟科技有限公司都采用了同样的工艺路线(参见CN1111604C、CN1793321A、CN1293194C、CN101701246B和 CN105950679A)。
上述的方法3是目前唯一一种实现工业化生产D-泛解酸内酯的工艺路线，其中最关键的环节是获得高效立体选择性水解D-泛解酸内酯的产酶微生物。目前国内外的筛选方法，基本都采用先活性筛选，即根据泛解酸内酯水解生成泛解酸导致体系pH值下降的特点，利用指示剂表征pH变化，从而从大量的待选微生物中筛选出具有泛解酸内酯的水解活性的菌株；然后利用泛解酸内酯水解过程中旋光反转的特点测定转化体系的旋光值来评估活性菌株的选择性高低(参见CN1793321A和CN101701246B)。这种先判断催化活性后检测立体选择性的传统筛选方法存在步骤繁琐，工作量大，效率低等不足。此外由于测定旋光值的影响因素较多，筛选过程中测定的旋光值往往会出现误差，不能准确评估微生物水解泛解酸内酯的立体选择性的高低，需要进一步采用色谱方法测定光学纯度。因此，传统的筛选方法步骤繁琐，准确性不高。鉴于此，提供一种简单、高效、准确地筛选水解D-泛解酸内酯的产酶微生物具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物及其在水解D,L-泛解酸内酯反应中的应用，以及提供一种简单、高效地筛选用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的方法。
用于解决问题的方案
为了实现上述发明目的，本发明提供一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的应用，其特征在于，使用产酶微生物培养结束后直接过滤获得的湿菌体或经过固定化后的菌丝体，对D,L-泛解酸内酯进行水解反应，水解反应结束后，分离所述产酶微生物，将水解液酸化以进行环化反应，最终得到具有一定光学纯度的D-泛解酸内酯，所述湿菌体或固定化后的菌丝体与D,L- 泛解酸内酯的投料质量比为0.1～1:1，所述水解反应中底物D,L-泛解酸内酯的浓度为1～70％，反应时间为5～10h。
本发明的产酶微生物选自丝状真菌镰孢霉属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、粘帚霉属或短梗霉属的菌株或其突变株。
本发明的产酶微生物的培养温度为25～35℃，培养时间为1～7天，培养基组成为：10～40g/L蔗糖，1～20g/L蛋白胨，1～20g/L酵母膏，1～20g/L玉米浆， 1g/L微量元素液，pH6～7，余量为水，其中所述微量元素液的组分的配合量为：10g/L的CaCl2·6H2O，0.425g/L的MnCl2·4H2O，0.005g/L的ZnCl2，0.01g/L 的NiCl2·6H2O，0.01g/L的Na2MoO4·2H2O。
本发明的产酶微生物优选为Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552，其湿菌体重复使用于本发明的水解反应至少25次仍保持酶活稳定。
本发明还提供一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的筛选方法：用产酶微生物菌株水解D,L-泛解酸内酯，再进行酸化，由此形成的转化液经高效液相色谱(HPLC)手性在线检测，快速筛选出对水解D,L-泛解酸内酯兼具催化活力和立体选择性的菌株。
具体地，包括如下步骤：
1)将产酶微生物菌株加入包含1～70％的D,L-泛解酸内酯，pH值为6.8～7.0 的水溶液中，在温度为20～35℃下水解反应0.1～10h；
2)水解反应结束后，分离菌株，用有机溶剂萃取除去未反应的D,L-泛解酸内酯；将水相进行酸化，得到包含D-泛解酸内酯的水相；
3)将所述步骤2)中包含所述D-泛解酸内酯的水相用有机溶剂萃取，得到的有机相用高效液相色谱手性分析，即可筛选出对水解所述D,L-泛解酸内酯有催化活力和立体选择性的菌株。
上述步骤1)中的pH值可通过缓冲溶液进行调节。
上述步骤2)、3)中的萃取用有机溶剂选自1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、甲苯或乙醚中的至少一种，优选为二氯甲烷或乙酸乙酯。
上述步骤3)中的HPLC手性分析的色谱条件为Chiralpak AD-H手性柱 (5μm，250mm×4.6mm)，柱温箱温度为25℃，流动相为异丙醇：正己烷＝20:80(v/v)，流速为1mL/min，检测波长为230nm，进样量为10μL。
本发明的筛选方法通过将样品的HPLC谱图与D,L-泛解酸内酯的标准谱图进行对比，可实现利用一次检测分析同时完成对待测菌株水解D,L-泛解酸内酯的水解活性(即催化活性)和立体选择性两种性能的精确评估。
通过上述筛选方法，本发明人发现轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)CGMCC NO.14552对D,L-泛解酸内酯兼具极高的水解活性和立体选择性。
本发明还提供一种水解D,L-泛解酸内酯的方法，包括使用产酶微生物培养结束后直接过滤获得的湿菌体或经过固定化后的菌丝体，对D,L-泛解酸内酯进行水解反应，水解反应结束后，分离所述产酶微生物，将水解液酸化以进行环化反应，进一步浓缩、结晶，最终得到具有一定光学纯度的D-泛解酸内酯，所述湿菌体或固定化后的菌丝体与D,L-泛解酸内酯的投料质量比为0.1～1:1，所述水解反应中底物D,L-泛解酸内酯的浓度为1～70％，反应温度为 20～35℃，pH值为6～8，反应时间为5～10h。
本发明的产酶微生物不需要添加CaCl2等提高细胞通透性的试剂，且所述湿菌体重复使用于本发明的水解反应至少25次仍保持酶活稳定。
对上述D,L-泛解酸内酯溶液的浓度没有特别的限定。本发明的轮枝镰孢菌对底物(D,L-泛解酸内酯)的耐受性极好，在非常高的底物浓度，例如70％下，依然能保持一定的水解活性。优选底物浓度为1～60％，更优选为20～50％。
发明的效果
本发明用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的筛选方法和使用其水解D,L-泛解酸内酯的方法具有如下优点：
1)通过将水解反应得到的泛解酸内酯酸化后再进行HPLC手性分析，可通过一次检测分析同时完成对待测菌株的催化活性和立体选择性的精确评估，在检测的同时直接完成筛选。筛选方法简单、精确、易于操作。
2)本发明使用了特定的色谱条件，色谱柱通量高，在8min左右即能完成一个样品的检测，快速、准确、高效。
3)通过本发明筛选方法筛选出的Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552对D,L-泛解酸内酯兼具有极高的催化活性和立体选择性。在5～10h 内，D,L-泛解酸内酯的转化率达到35％以上，目标终产物D-泛解酸内酯的光学纯度ee值大于98％。
4)通过本发明筛选方法筛选出的Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552不仅对D,L-泛解酸内酯的水解活性高，对底物的耐受性也优异，在非常高的底物浓度下依然保持优异的水解活性。
5)Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552的湿菌体重复使用于本发明的水解反应至少25次仍保持酶活稳定，且水解活性高，水解反应中不需要添加CaCl2等提高细胞通透性。
附图说明
图1是由高效液相色谱得到的D,L-泛解酸内酯的手性拆分图。
图2是菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552不对称催化水解 D,L-泛解酸内酯而制备目标产物D-泛解酸内酯时由高效液相色谱得到的手性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应理解，下列实施例仅用于阐述本发明，本发明不限于此。
除非另有说明，或者明确注明厂商，否则本发明中所使用的试剂和材料均为本领域常用或市购可得的常规产品。
产酶微生物的来源
本发明的产酶微生物可选自丝状真菌镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)或短梗霉属(Aureobasidium)的菌株或其突变株。菌株来源不受特殊限制，可由菌株保藏机构、商购或赠与获得，或者可来自自然环境，如土壤。本发明的产酶微生物的突变株可按照本领域常规的突变方法获得。
本申请实施例中的微生物来源于浙江省新昌县新昌江附近的土壤以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。其中，本申请所用的轮枝镰孢菌菌株分类命名为轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides，由发明人采集、分离自浙江省新昌县新昌江附近的土壤，于2017年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.14552。
产酶微生物的培养
本发明的产酶微生物的培养适用于本领域常规的培养条件，优选在以下条件下进行培养：
培养温度25～35℃，培养时间1～7天，培养基为液体培养基，具体组成为： 10～40g/L蔗糖，1～20g/L蛋白胨，1～20g/L酵母膏，1～20g/L玉米浆，1g/L微量元素液，pH6～7，余量为水，其中所述微量元素液的组分的配合量为：10g/L 的CaCl2·6H2O，0.425g/L的MnCl2·4H2O，0.005g/L的ZnCl2，0.01g/L的NiCl2·6H2O，0.01g/L的Na2MoO4·2H2O。
产酶微生物的筛选方法及使用其水解D,L-泛解酸内酯的方法
除非另有说明，本申请前述及下文实施例中提及的镰孢霉菌菌株的筛选方法及使用该菌株水解D,L-泛解酸内酯的方法，也同样适用于其他菌属的产酶微生物的菌株及其突变株。
D,L-泛解酸内酯的高效液相色谱检测
本发明人经过潜心研究，发现一种利用高效液相色谱准确地手性分析 D,L-泛解酸内酯的方法，所述色谱条件为如下：
Chiralpak AD-H手性柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温箱温度为25℃，流动相为异丙醇：正己烷＝20:80(v/v)，流速为1mL/min，检测波长为230nm，进样量为10μL。
该检测方法的优点在于：色谱柱通量高，仅需8min即可完成样品的检测，具有简便、快速、高效的特点。
下述实施例中的HPLC检测均在上述条件下完成。
催化活性和立体选择性的表达
产酶微生物的催化活性即酶的活力，也即本发明中所述的水解活性，在本文中用底物D,L-泛解酸内酯的转化率来表示。转化率越高，表明微生物的产酶能力越强，催化活性越强。
本发明用ee值来表示立体选择性，ee值越高，表明微生物对D-泛解酸内酯水解酶的立体选择性越高。
实施例
取待检测的225株镰孢霉菌株进行下述筛选实验，其中100株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，125株为发明人分离自浙江省新昌县新昌江附近的土壤。
实施例1：用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的筛选(1)
菌株：100株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的镰孢霉菌
实施步骤：按照标准流程将保存于安瓶中的镰孢霉菌开封，用无菌吸管吸取0.3～0.5毫升用于镰孢霉菌培养的前述本发明的液体培养基，滴入安瓶内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浮状，并将其涂于固体平板，同时吸取少量的菌悬液移植于培养基试管中，在25℃下培养活化菌株。然后将活化复壮的菌株接种到24孔板中培养，培养获得的菌丝体用作酶催化剂与D,L-泛解酸内酯溶液混合反应。
取与D,L-泛解酸内酯等质量的菌丝体加入5mL的1％的D,L-泛解酸内酯水溶液中进行反应，用氨水控制反应的pH值为6.8～7.0。4h后停止反应，离心除去菌丝体，取5mL二氯甲烷萃取除去未反应的D,L泛解酸内酯，水相中水解产生的泛解酸经酸化处理后重新环化，经二氯甲烷萃取后，通过HPLC进行手性分析，确定待测菌株对D,L-泛解酸内酯的转化率以及目标产物D-泛解酸内酯的ee值。
由液相色谱得到的D,L-泛解酸内酯的手性拆分图如图1所示，筛选出的 20株镰孢霉菌株的产酶能力和立体选择性如表1所示。
表1 20株镰孢霉菌株的产酶能力和立体选择性
Figure RE-GDA0001575773900000081
Figure RE-GDA0001575773900000091
由表1可以看出，与其他菌株相比，AS3.4712、AS3.2626和AS3.1818具有显著的立体选择性，D-泛解酸内酯的ee值均为90％以上。
实施例2：用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的筛选(2)
菌株：125株由发明人采集、分离自浙江省新昌县新昌江附近的土壤的镰孢霉菌株
按照实施例1中的步骤，对125株镰孢霉进行水解D,L-泛解酸内酯的高通量筛选，得到水解活性和立体选择性高的5株镰孢霉菌株，结果如下表2所示。
表2 5株镰孢霉菌株的产酶能力和立体选择性
菌株编号 转化率(％) 产物D-泛解酸内酯的ee值(％)
RPH15 38.2 73.5
RPH22 37.8 98.2
RPH81 31.6 82.3
RPH 94 34.1 92.8
RPH115 41.1 90.9
由上述结果可以看出，菌株RPH22、RPH94、RPH115显示出优异的产物D-泛解酸内酯的立体选择性，产物D-泛解酸内酯的ee值显著高于其他菌株，均为90％以上。
实施例3：产D-泛解酸内酯水解酶的镰孢霉菌的复筛
对从上述225株镰孢霉菌的初筛中获得的产物D-泛解酸内酯的ee值高的菌株RPH22、RPH 94、RPH115、AS3.4712、AS3.2626和AS3.1818进行复筛，考察其水解活性和底物耐受能力。
将上述6株菌株分别接种到200mL的前述本发明的液体培养基中，在 28℃、200r/min下振荡培养48h，布氏漏斗抽滤除去发酵液体，收集菌丝体。取与D,L-泛解酸内酯等质量的菌丝体加入到D,L-泛解酸内酯浓度分别为1％、 20％、50％和70％的溶液中进行反应，用氨水控制反应的pH值为6.8～7.0，10h 后停止反应。离心除去菌丝体，取5mL转化液用乙酸乙酯萃取除去未反应的 D,L泛解酸内酯，水相中水解产生的泛解酸经酸化处理后重新环化，经乙酸乙酯萃取后，利用HPLC进行手性分析，反应得到的底物转化率和产物D-泛解酸内酯的ee值如下表3所示。
表3 6株镰孢霉菌株的产酶能力和立体选择性
Figure RE-GDA0001575773900000101
根据表3的结果，轮枝镰孢菌菌株RPH22(Fusarium verticillioides CGMCCNO.14552)在高底物浓度和低底物浓度下均表现出非常出色的立体选择性，十分适合作为水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物。还可以看出，菌株RPH22的底物耐受力优异，在50％和70％的高底物浓度下，产物D-泛解酸内酯的ee值显著高于其他菌株，且保持很高的转化率。
图2示出了菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552不对称催化水解D,L-泛解酸内酯而制备目标产物D-泛解酸内酯时由液相色谱得到的手性分析图。
实施例4～6：菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552催化水解D,L-泛 解酸内酯的反应
实施例4：以水为溶剂配制1L浓度为20％的D,L-泛解酸内酯溶液，加入以实施例3所述的方法培养得到的轮枝镰孢菌菌株RPH22(Fusarium verticillioides CGMCCNO.14552)的湿菌体，湿菌体与D,L-泛解酸内酯的投料质量比为0.25:1，28℃下搅拌，用氨水自动控制反应pH值为6.85-6.95。反应8h后，经HPLC检测转化率为39.0％。停止水解反应，过滤回收湿菌体，用乙醚萃取未水解的泛解酸内酯，调节水相pH至2，反应1h后，浓缩水相、-10℃下结晶，得到D-泛解酸内酯，检测其纯度为99.3％，ee值为98.9％，产物的收率为93％。
实施例5：以水为溶剂配制1L浓度为60％的D,L-泛解酸内酯溶液，加入以实施例3所述的方法培养得到的轮枝镰孢菌菌株RPH22的湿菌体，湿菌体与D,L-泛解酸内酯的投料质量比为0.6:1，反应时间为5h，其它反应条件与实施例4相同。反应结束后，HPLC检测底物转化率为41.2％，结晶得到的D-泛解酸内酯纯度为99.0％，ee值为98.5％，产物的收率为90.0％。
实施例6：以水为溶剂配制1L浓度为70％的D,L-泛解酸内酯溶液，加入以实施例3所述的方法培养得到的轮枝镰孢菌菌株RPH22的湿菌体，湿菌体与D,L-泛解酸内酯的投料质量比为0.8:1，反应时间为10h，其它反应条件与实施例4相同。反应结束后，HPLC检测底物转化率为45.4％，结晶得到的D- 泛解酸内酯纯度为99.4％，ee值为99.3％，产物的收率为94.4％。
由实施例4～6的水解反应可以看出，本发明的菌株RPH22即使在投料比小于1的情况下，经过5～10h的水解反应也能实现底物转化率为39％以上，产物D-泛解酸内酯的ee值大于98％。
实施例7：菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552催化水解D,L-泛解酸 内酯的稳定性
重复使用实施例4回收得到的湿菌体，以与实施例4相同的方式进行水解反应，结果如表4所示。
表4 Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552菌株的酶活稳定性
Figure RE-GDA0001575773900000121
由表4结果可知，菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552在重复使用25次后，产物D-泛解酸内酯的e.e.值开始小于98％，转化率较明显降低。因此，该菌株的酶活稳定性很高，至少可重复使用25次。
实施例8：菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552的细胞通透性的研究
以与实施例4相同的方式进行产酶微生物催化水解浓度为20％的D,L-泛解酸内酯的反应，其中，产酶微生物分别选用本发明的菌株Fusarium verticillioides CGMCCNO.14552、购自中国科学院微生物研究所的菌株 Fusarium anthophilum AS3.4712、Fusarium redolens AS3.2626和 Fusarium neoceras AS3.1818。
作为比较，在水解反应溶液中添加0.05mol/L的细胞通透剂CaCl2，在与未添加CaCl2的反应相同的条件下，使用上述产酶微生物催化水解D,L-泛解酸内酯，将获得的底物转化率与产物D-泛解酸内酯的ee值进行比较，结果如表 5所示。
表5菌株的细胞通透性对水解D,L-泛解酸内酯的反应的影响
Figure RE-GDA0001575773900000131
由表5数据可以看出，本发明菌株Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552的细胞通透性好，在未添加CaCl2的条件下，底物D,L-泛解酸内酯的转化率和产物D-泛解酸内酯的ee值显著高于其他菌株，甚至与其他菌株添加CaCl2的条件下所达到的转化率和ee值接近或更高。
实施例9：Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552的固定化细胞催化水解D, L-泛解酸内酯的反应
固定化细胞的制备：本发明的固定化细胞可采用本领域常规的方法制备。以实施例3的方式培养Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552湿菌体 100g，取其中50g用于固定化细胞的培养，另外50g不进行固定化，作为对照用于酶活稳定性的对比实验。
将上述50g的Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552湿菌体用去离子水配制成菌悬液，加入终浓度为16mmol/L的戊二醛溶液，室温下搅拌均匀后静置3h，抽滤，用去离子水充分洗涤，去除未作用的戊二醛，得到交联的固定化细胞。
以与实施例4相同的方式，用上述Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552的固定化细胞和未经固定化的湿菌体分别催化水解浓度为20％的 D,L-泛解酸内酯，并且重复使用该固定化细胞和未经固定化的湿菌体，以比较其酶活稳定性，所得底物转化率及产物的ee值的数据如下表6所示。
表6 Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552细胞固定化前后的酶活稳定性比较
Figure RE-GDA0001575773900000141
由表6数据可知，固定化后的Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552 的酶活稳定，重复使用30次的底物转化率及产物ee值变化较小。相比之下，未经固定化的湿菌体重复使用25次后转化率和产物ee值开始较快降低。虽然湿菌体的稳定性比固定化细胞低，但转化率比重复使用30次前的转化率高，且产物ee值相差不大。此外，由于固定化细胞在大规模生产中存在以下缺点： (1)工序步骤多，成本高；(2)限制细胞膜、细胞壁和载体的扩散；(3)载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性，因此，从简化工艺、降低成本的角度，优选使用未经固定化的湿菌体进行催化水解反应。
产业上的可利用性
本发明提供的水解D,L-泛解酸内酯的微生物的筛选方法可实现对菌株的催化活性和立体选择性的一次性同时筛选，筛选方法简单、高效、工业适用性强。另外，由此获得的轮枝镰孢菌菌株的细胞通透性好、底物耐受能力强，酶活稳定性高，湿菌体可重复使用于水解反应至少25次仍保持酶活稳定，在较短时间内可实现高产率转化D,L-泛解酸内酯，且产物D-泛解酸内酯的光学纯度高。因此，本发明筛选的轮枝镰孢菌菌株具有良好的工业应用前景。

Claims (4)

1.一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的应用，其特征在于，使用产酶微生物培养结束后直接过滤获得的湿菌体或经过固定化后的菌丝体，对D,L-泛解酸内酯进行水解反应，水解反应结束后，分离所述产酶微生物，将水解液酸化以进行环化反应，最终得到具有一定光学纯度的D-泛解酸内酯，所述湿菌体或固定化后的菌丝体与所述D,L-泛解酸内酯的投料质量比为0.1～1:1，所述水解反应中底物D,L-泛解酸内酯的浓度为20～70％，反应时间为5～10h，所述产酶微生物为Fusarium verticillioides CGMCC NO.14552。
2.根据权利要求1所述的用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的应用，其特征在于，所述产酶微生物的湿菌体重复使用于所述水解反应至少25次仍保持酶活稳定。
3.根据权利要求1或2所述的用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物的应用，其特征在于，所述产酶微生物的培养温度为25～35℃，培养时间为1～7天，培养基的组成为：10～40g/L蔗糖，1～20g/L蛋白胨，1～20g/L酵母膏，1～20g/L玉米浆，1g/L微量元素液，pH6～7，余量为水，其中所述微量元素液的组分的配合量为：10g/L的CaCl2·6H2O，0.425g/L的MnCl2·4H2O，0.005g/L的ZnCl2，0.01g/L的NiCl2·6H2O，0.01g/L的Na2MoO4·2H2O。
4.一种用于水解D,L-泛解酸内酯的产酶微生物，其为Fusarium verticillioidesCGMCC NO.14552。
CN201711396444.1A 2017-12-21 2017-12-21 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法 Active CN108004291B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711396444.1A CN108004291B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711396444.1A CN108004291B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108004291A CN108004291A (zh) 2018-05-08
CN108004291B true CN108004291B (zh) 2020-10-02

Family

ID=62060439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711396444.1A Active CN108004291B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108004291B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108102926B (zh) * 2017-11-27 2021-04-13 苏州百福安酶技术有限公司 高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株bfa010-7及其在制备d-泛解酸内酯中的应用
CN110358687B (zh) * 2018-12-19 2020-12-04 安徽瑞达健康产业有限公司 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法
CN110157623B (zh) * 2018-12-21 2022-07-12 合肥工业大学 一种镰刀菌菌株及其发酵生产d-泛解酸内酯水解酶的方法
CN109682896A (zh) * 2019-01-16 2019-04-26 安徽瑞达健康产业有限公司 用高效液相色谱法分离检测泛酰内酯手性异构体的方法
CN110698439B (zh) * 2019-10-08 2021-08-17 浙江新和成股份有限公司 一种双极膜法制备d-泛解酸内酯的工艺
CN110845453A (zh) * 2019-11-28 2020-02-28 安徽泰格生物科技有限公司 一种l-泛解酸内酯的消旋方法
CN112175919B (zh) * 2020-09-30 2024-02-09 江西兄弟医药有限公司 内酯水解酶突变体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100351369C (zh) * 2005-11-22 2007-11-28 浙江杭州鑫富药业股份有限公司 产d－泛解酸内酯水解酶的微生物及其制备d－泛解酸的方法
CN1900297B (zh) * 2006-07-27 2010-05-12 浙江杭州鑫富药业股份有限公司 微生物酶法制备d-泛乙醚的方法
CN101392278B (zh) * 2008-06-11 2011-07-20 济南大华广济畜牧发展有限公司 微生物混合发酵制备d-泛解酸内酯的方法
CN105950679B (zh) * 2016-05-27 2019-12-10 江西兄弟医药有限公司 一种发酵制备d-泛解酸内酯的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108004291A (zh) 2018-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108004291B (zh) 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法
Kataoka et al. Lactonohydrolase-catalyzed optical resolution of pantoyl lactone: selection of a potent enzyme producer and optimization of culture and reaction conditions for practical resolution
US20210230566A1 (en) Acinetobacter and use thereof in production of chiral 3-cyclohexene-1-carboxylic acid
Sicard et al. A fluorescence‐based assay for Baeyer–Villiger monooxygenases, hydroxylases and lactonases
CN109504634B (zh) 芽孢杆菌wzz006及其应用
CN100345974C (zh) S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法
WO2008046328A1 (fr) Souche produisant une lactonohydrolase lévorotatoire et son utilisation pour la production d'oxyacide chiral
Wang et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061
Hu et al. Highly enantioselective reduction of 2-hydroxy-1-phenylethanone to enantiopure (R)-phenyl-1, 2-ethanediol using Saccharomyces cerevisiae of remarkable reaction stability
Andreu et al. Potential of some yeast strains in the stereoselective synthesis of (R)-(−)-phenylacetylcarbinol and (S)-(+)-phenylacetylcarbinol and their reduced 1, 2-dialcohol derivatives
Goswami et al. Stereospecific enzymatic hydrolysis of racemic epoxide: a process for making chiral epoxide
Kurbanoglu et al. Total production of (R)-3, 5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric reduction of 3, 5-bis (trifluoromethyl)-acetophenone in the submerged culture of Penicillium expansum isolate
CN105567584B (zh) 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用
CN102174432B (zh) 一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用
Zilbeyaz et al. Production of (R)‐1‐phenylethanols through bioreduction of acetophenones by a new fungus isolate Trichothecium roseum
CN104651425B (zh) 一种生物催化合成光学活性烷基内酯的方法
CN108753851B (zh) 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物
US20100261251A1 (en) Microbial kinetic resolution of ethyl-3,4-epoxybutyrate
CN102174422B (zh) 一种耐有机溶剂脂肪酶生产菌及该脂肪酶的基因和应用
CN105586289B (zh) 一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺的假单胞菌及其筛选和应用
CN110358687B (zh) 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法
CN1333068C (zh) 生物催化制备(s)－4－氯－3－羟基丁酸酯的菌种和方法
Romano et al. Enhanced enantioselectivity of Bacillus coagulans in the hydrolysis of 1, 2-O-isopropylidene glycerol esters by thermal knock-out of undesired enzymes
Li et al. (R)-Oxynitrilase-catalysed synthesis of chiral silicon-containing aliphatic (R)-ketone-cyanohydrins
Gong et al. Biocatalytic preparation of enantiopure (R)-ketoprofen from its racemic ester by a new yeast isolate Citeromyces matriensis CGMCC 0573

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200526

Address after: 312500, No. 418, West Avenue, Qixing street, Xinchang County, Shaoxing, Zhejiang

Applicant after: ZHEJIANG NHU COMPANY Ltd.

Applicant after: SHANDONG NHU VITAMIN Co.,Ltd.

Applicant after: SHANDONG XINHECHENG AMINO ACID Co.,Ltd.

Applicant after: SHANDONG XINHECHENG FINE CHEMICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 312500, No. 418, West Avenue, Qixing street, Xinchang County, Shaoxing, Zhejiang

Applicant before: ZHEJIANG NHU COMPANY Ltd.

Applicant before: SHANDONG NHU VITAMIN Co.,Ltd.

Applicant before: SHANDONG XINHECHENG AMINO ACID Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant